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蛋白多糖复合物.pdf

摘要
申请专利号:

CN201110122299.4

申请日:

20110512

公开号:

CN102188693B

公开日:

20131030

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:

IPC分类号:

A61K38/16,A61K8/73,A61K8/64,A23L1/30,A61P3/06,A61P7/02,A61P9/10,A61P25/00,A61P43/00,A61K31/727,A61K31/728,A61K31/737

主分类号:

A61K38/16,A61K8/73,A61K8/64,A23L1/30,A61P3/06,A61P7/02,A61P9/10,A61P25/00,A61P43/00,A61K31/727,A61K31/728,A61K31/737

申请人:

湛江市索奇生物技术有限公司

发明人:

李国跃,吴怡

地址:

524022 广东省湛江市开发区人民大道中26号合得利工业大夏8层

优先权:

CN201110122299A

专利代理机构:

广州新诺专利商标事务所有限公司

代理人:

李国钊

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内容摘要

本发明属于生物化学技术领域,公开了一种新型蛋白多糖复合物。所述新型蛋白多糖复合物由质量百分比为M%的金属硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖组成,其中,0

权利要求书

1.一种蛋白多糖复合物,其特征在于,由金属硫蛋白和糖胺聚糖制成,所述糖胺聚糖从海洋贝类动物提取,所述金属硫蛋白与糖胺聚糖的质量比为4~5:1。2.根据权利要求1所述的一种蛋白多糖复合物,其特征在于,所述金属硫蛋白通过动物体内组织获取或由基因工程方法获取。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域,具体涉及一种新型蛋白多糖复合物。 

背景技术

金属硫蛋白(MT)化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐,化学结构特殊,是一类富含半胱氨酸、广泛存在于生物体内的低分子量、富含金属及巯基的非酶蛋白。MT的分子量介于6000~7000Da之间,通常含有61个氨基酸,其中20个为半胱氨酸,可以与7个二价金属离子结合形成两个独立的金属簇。MT对金属离子有特定的亲和力,其对金属的结合序列为:Fe2+<Co2+<Zn2+<Pb2+<Cd2+<Cu2+~Ag2+<Bi2+<Hg2+,是机体内唯一一种在金属代谢中起明确作用的小分子蛋白质,结合重金属是MT蛋白区别于其他蛋白质的重要特性。MT在生物体内具有多种作用,包括解除重金属的毒害,清除自由基,参与微量元素代谢,促进机体免疫功能以及抗辐射、抗衰老等。同时,MT能抑制脂质(如血脂)的过氧化反应,可降低血液粘度,改善血液循环,能达到防治心脑血管疾病的目的和稳定生物膜等多种生物学作用。因此,MT可应用于食品、化妆品和医药等领域。 

糖胺聚糖(GAGs)存在于动物细胞的表面和细胞外基质,是一种长链多糖,是由含已糖醛酸和己糖胺成分的重复二糖单元连接成的直链杂多糖。糖胺聚糖的通式为:[己糖醛酸→己糖胺]n,n随种类而异,一般在30~250之间。二糖单元中至少有1个单糖残基带有负电荷的羧基或硫酸基。在体内1条或多条糖胺聚糖和1个核心蛋白共价连接形成蛋白聚糖,但透明质酸除外。按单糖残基、残基间连键的类型以及硫酸基的数目和位置,糖胺聚糖可分为:透明质酸,4-硫酸软骨素,6-硫酸软骨素,硫酸皮肤素,硫酸角质素,肝素,和硫酸乙酰肝素。GAGs通过结合受体蛋白介导重要的生物学机制,比如保护蛋白免受降解、抗凝血、维持或抑制细胞生长、黏附和抗黏附、生物过滤器、促进或抑制血管形成、诱导神经轴突生长,以及在正常发育和病理条件下结合、贮存及向靶细胞释放生长因子和参与信号转导等生物活性。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型蛋白多糖复合物,其功能特性和物理稳定性均优于独立的金属硫蛋白或糖胺聚糖。 

为达到上述目的,本发明采用如下技术方案: 

新型蛋白多糖复合物,由质量百分比为M%的金属硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖组成, 其中,0<M<100。 

进一步,所述金属硫蛋白与糖胺聚糖的最佳质量比为4~5∶1。 

作为优选,所述金属硫蛋白通过动物体内组织获取或由基因工程方法获取。 

作为优选,所述糖胺聚糖通过动物组织提取。 

进一步,所述糖胺聚糖为透明质酸,或4-硫酸软骨素,或6-硫酸软骨素,或硫酸皮肤素,或硫酸角质素,或肝素,或硫酸乙酰肝素,或它们的混合物。 

本发明所述的新型蛋白多糖复合物综合了两组分的功能特性,使其功能特性和理化稳定性比单独的MT或GAGs都有改善,同时提高了MT的某些生理活性例如热稳定性。使MT与GAGs在食品、化妆品、医药等领域应用更加广泛。 

具体实施方式

本发明所述的新型蛋白多糖复合物,是由质量百分比为M%的金属硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖组成,其中,0<M<100。所述的金属硫蛋白优选通过动物体内组织获取或由基因工程方法获取。所述的糖胺聚糖优选通过动物组织提取;所述的糖胺聚糖包括透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和硫酸乙酰肝素,或它们的混合物。 

一、MT-GAGs最佳质量配比实验: 

1、MT的制备。 

采用现有的提取方法从动物肝脏中提取出活性Zn-MT,并制成冻干粉。 

2、GAGs的制备。 

采用现有的提取方法从海洋贝类动物提取出的GAGs,并制成水溶液。 

3、新型蛋白多糖复合物即MT-GAGs的制备。 

取一特定浓度的GAGs水溶液,按不同的质量比加入MT冻干粉,搅拌混匀,得MT-GAGs复合物。 

4、MT-GAGs复合物的分离 

取不同质量比制备的MT-GAGs复合物,分别配成MT-GAGs溶液10ml,取1ml分别上柱分离(Sephadex G-751.6*30,流速5ml/分),214nm紫外监测,记录仪显示当MT-GAGs质量比为1∶0时有MT样品吸收峰,质量比为1∶1~4∶1时在13~19份洗脱液有MT-GAGs样品吸收峰,且随MT量增大吸收峰值也增大,当比例增大到5∶1时另外又出现MT吸收峰,表示MT-GAGs配比达到饱和。 

5、MT-GAGs复合物经人工胃液作用后分离。 

取不同质量比MT-GAGs复合物适量,分别加人工胃液配制成1×10-4mol/LMT-GAGs溶液,37℃温育120min,煮沸3分钟酶灭火,8000r/min离心5min,取上清液用6000透析膜透析12小时,将透析后溶液转入10ml容量瓶中,加水至刻度,再取1ml上柱分离(SephadexG-751.6*30,流速5ml/分),214nm紫外监测,记录仪显示当MT-GAGs质量比为1∶0时MT样品无吸收峰,质量比为1∶1~4∶1时吸收峰与未经人工胃液处理样品的吸收峰相同,在质量比>4∶1时吸收峰没有大改变,过量的MT在人工胃液中被降解。 

6、结论。 

MT与GAGs最佳质量比为4~5∶1。 

二、MT-GAGs对铅中毒小鼠的保护实验: 

1、铅中毒蓄积模型 

取小鼠每天灌胃40mg/L的醋酸铅溶液,按0.01L/kg体重剂量灌胃,连续10天后,测定血铅确定已中毒后,随机分为染毒低剂量给药组(LD)、染毒中剂量给药组(MD)、染毒高剂量给药组(HD)、染毒对照组(Pb)和正常对照组(NC),每组10只。 

2、样品配制 

取MT-GAGs样品分别配制成0.01%、0.05%和0.10%(mg/100ml)浓度样品,105℃,保温30分钟,灌胃用。 

3、动物处理 

LD、MD、HD 3组每天灌胃不同浓度的MT-GAGs(MT∶GAGs=4.3∶1)样品,Pb和NC组灌胃去离子水,按0.01L/kg体重剂量灌胃,连续7天,置代谢笼内,收集7天的尿和粪便。7天后眼眶取血,并处死动物,观察内脏变化,分离肾脏及股骨,测定尿、粪及血、肾、骨的铅含量。 

4、结果 

Pb组小鼠肉眼可见肝、肠明显病变。其它各组小鼠内脏未见异常。染毒小鼠经用MT-GAGs灌胃后,3个浓度剂量组的小鼠的排泄铅(尿铅和粪铅)均明显高于未服MT-GAGs的Pb组染毒小鼠;血、肾、骨中的铅含量明显低于未服MT-GAGs的Pb组小鼠;HD、MD组的肾铅和HD组的骨铅接近于正常NC组,说明MT-GAGs能明显增加体内铅的排泄,降低体内铅的蓄积,对铅中毒小鼠具有与MT相同的保护作用。与单纯MT实验结果相同。 

三、MT-GAGs对热的稳定性实验: 

1、红细胞悬液的制备: 

取新鲜兔肝素抗凝血2ml,2500r/min离心5min,吸掉血浆与白细胞,红细胞用10倍PBS清洗后,2500r/min离心5min,弃掉上清液,重复清洗三次后,配成1×108红细胞/ml悬液,备用。 

2、氯化汞浓度与溶血率的关系: 

测定Hg2+(汞离子)浓度0~2×10-4mol/L对兔血红细胞溶血的影响。取以上配制的红细胞悬液,吸取0.1ml,分别加入7.90ml不同浓度的HgCl2(氯化汞)溶液(Hg2+浓度0~2×10-4mol/L),轻摇后于37℃温育30min,然后在3000r/min离心5min,取上清液测定417nm下的吸光值,按下式计算溶血率Hp: 

Hp=(A-A0)/(A∞-A0) 

式中:A0-不加HgCl2时上清液的吸光值 

A——加入一定HgCl2后对应的上清液吸光值 

A∞——HgCl2浓度大到红细胞完全溶血时对应的吸光值 

从下表中可见随Hg2+浓度增加,Hp%增大,当Hg2+浓度>37.5×10-6mol/L时,Hp%有突跃,大于56.3×10-6mol/L时,红细胞全部溶血,试验重复5次取平均值。 

3、MT对HgCl2引起的红细胞溶血的抑制作用: 

取用NaCl调等渗后的1×10-6mol/L MT一定量,加入到2.25×10-4mol/L HgCl22ml溶液中,使MT与HgCl2浓度比达到一定值,用PBS调体积到7.9ml,混合均匀后,放置5min再加0.1ml红细胞悬液,使总体积为8ml,轻摇后于37℃温育30min,然后在3000r/min离心5min,取上清液测定417nm下的吸光值,每个浓度比分别以相应CMT浓度中不加HgCl2为空白对照管,试验重复5次取平均值。A∞是不加MT红细胞完全溶血时吸光值,计算溶血率减少的百分数HMT=1-A/A∞,以下数据可以看出随体系中MT含量的增高,红细胞溶血率减少的百分数HMT就增大。 

  CMT/CHgCl2×10-4   0   2.22   4.44   6.67   8.89   2.25×10-4mol/LHgCl2(ml)   2   2   2   2   2

  1×10-6mol/L Zn-MT(ml)   0   0.10   0.20   0.30   0.40   PBS(ml)   5.90   5.80   5.70   5.60   5.50   红细胞悬液(ml)   0.1   0.1   0.1   0.1   0.1   HMT   /   39.2   52.1   63.6   77.7

4、MT与MT-GAGs在不同受热时间对HgCl2引起的红细胞溶血的抑制作用: 

取两组2.25×10-4mol/L HgCl22.0ml溶液,分别加入经105℃不同受热时间处理后1×10-6mol/L的MT和MT-GAGs0.4ml,用NaCI调等渗,使MT和MT-GAGs与HgCl2摩尔浓度比达到8.89×10-4,用PBS调体积到7.9ml,混合均匀后,放置5min再加0.1ml红细胞悬液,使总体积为8ml,轻摇后于37℃温育30min,然后在3000r/min离心5min,取上清液测定417nm下的吸光值。计算溶血率减少的百分数HMT=1-A/A∞,以HMT≥77%为不溶血,HMT<77%为溶血。下表数据可以看出MT在105℃受热3分钟时可以保护红细胞不发生溶血,受热3分钟以上红细胞完全溶血;MT-GAGs在105℃受热30分钟时仍可以保护红细胞不发生溶血,即MT在GAGs的保护下在105℃受热30分钟仍保留保护红细胞抵抗汞离子产生溶血的活性。 

  受热时间(105℃)   3分钟   5分钟   10分钟   20分钟   30分钟   1×10-6mol/LMT   不溶血   溶血   溶血   溶血   溶血   1×10-6mol/L MT-GAGs   不溶血   不溶血   不溶血   不溶血   不溶血

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蛋白 多糖 复合物
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