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新的生物标记及其在诊断、治疗孤独症中的用途.pdf

摘要
申请专利号:

CN201180060249.6

申请日:

20111213

公开号:

CN103328501B

公开日:

20150916

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:

IPC分类号:

C07K14/47,A61K38/04

主分类号:

C07K14/47,A61K38/04

申请人:

奥蒂斯姆生物技术有限公司

发明人:

纳吉·莫门尼,本特·L·佩尔松

地址:

英国里丁伯克郡

优先权:

1051330-7,61/423,636

专利代理机构:

中科专利商标代理有限责任公司

代理人:

张国梁

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内容摘要

一种新的生物标记,其为具有序列SSKITHRIHWESASLLR*的肽,其中用星号标示的C端精氨酸侧链缺少通常在侧链中存在的NH2-C=NH部分。本发明公开了所述生物标记在诊断神经疾病和/或神经精神疾病(特别是孤独症)中的用途,以及用于确定所述新的生物标记和针对所述新的生物标记的抗体的浓度的方法。孤独症的治疗,包括向受试者使用补体因子I抑制剂。

权利要求书

1.一种分离的肽,所述肽由氨基酸序列NH-SSKITHRIHWESASLLR*-COOH(SEQ ID NO:1)组成,其中用R*表示的C端残基具有如式(I)所示的侧链:2.一种用于诊断的产品套装,所述产品套装包括权利要求1中定义的肽。3.根据权利要求2所述的产品套装,其中所述产品套装还包括下述中的一种或多种:蛋白酶抑制剂;确定权利要求1中定义的肽的浓度的使用说明书;由序列SSKITHRIHWESASLL(SEQ ID NO:2)组成的肽;由序列SSKITHRIHWESASLLR(SEQ ID NO:3)组成的肽。4.权利要求1中定义的肽,用于制备用于诊断孤独症谱系障碍的诊断产品。5.权利要求1中定义的肽与由序列SSKITHRIHWESASLLR(SEQ ID NO:3)和/或SSKITHRIHWESASLL(SEQ ID NO:2)组成的肽组合在制备用于诊断孤独症谱系障碍的诊断产品中的用途。6.补体因子I与权利要求1中定义的肽和/或由序列SSKITHRIHWESASLLR(SEQ ID NO:3)和/或SSKITHRIHWESASLL(SEQ ID NO:2)组成的肽组合在制备用于诊断孤独症谱系障碍的诊断产品中的用途。7.权利要求1中定义的肽在制备用于评价受试者中孤独症谱系障碍治疗的功效的试剂中的用途。8.权利要求1中定义的肽在制备用于检测孤独症谱系障碍的诊断产品中的用途。

说明书

发明的技术领域

本发明涉及生物学肽,用于分析所述肽的方法,特别是用于在生物样品中分析所述肽的方法,以及用于诊断神经疾病和/或神经精神疾病(特别是孤独症)的相关方法。本发明还涉及孤独症的治疗。

发明背景

在医学领域中,对于用于诊断或预知病理学状况和用于评价应用的治疗的功效的新的、改进的生物学标记(生物标记)存在持续的需求。概括来说,来自患者样品的生物标记的浓度通过统计学相关性被作为指示病理学状况的存在、严重性或风险的指示。一个广泛研究的生物标记亚组是生物流体中的肽,所述生物流体诸如血液、脑脊液或尿。取决于分析方法和样品的类型,生物样品中存在的不同的肽的数量可能在从数十种到好几万种之间变化。因此,清楚的是,还有许多种医学相关的肽生物标记尚待发现。

命名为补体C3的人蛋白是先天性免疫系统的一种充分研究的成分,并且有大量的补体C3在血液中循环。经典补体途径典型地需要抗原:抗体复合物用于激活(特异性免疫应答),而替代性和甘露糖-结合凝集素途径可以通过C3水解激活或在不存在抗体的条件下由抗原激活(非特异性免疫应答)。在所有三种途径中,C3-转化酶切割并且激活成分C3,产生C3a和C3b,并且引起进一步切割和激活事件的级联。

在文献中已知能够用作生物标记的许多补体C3肽片段。例如,WO/2004/079371公开用于孤独症诊断标记的补体C3的肽片段。作为另一实例,US20050048584A1公开一种使用来源于补体C3的肽生物标记检测阿尔茨海默病并且区分阿尔茨海默病与其他痴呆疾病的方法。

孤独症是一种具有不同严重程度的神经精神疾病,在全世界1000名儿童中大约有2-5名受此病影响,并且在美国,可能多至110名中就有1名受此病影响。对孤独症的病因还不了解,但是认为是遗传因素和环境因素的作用。孤独症的诊断需要对儿童行为进行专家评估,并且考虑到对儿童和家庭诊断的巨大意义,确定一个可靠的诊断通常花费大量的时间和努力。因此,亟需基于生物学变量的客观测量而用于诊断孤独症的临床测定。

孤独症的治疗包括行为训练和管理,其利用积极的强化效果、自助和社会能力来改善行为和交流。已经开发了一些不同的治疗系列(treatment suites),包括应用行为分析(Applied Behavioural Analysis,ABA),孤独症及相关交流缺陷儿童的治疗和教育(Treatment and Education of Autistic and Related Communication Handicapped Children,TEACCH)和感觉统合。专门的治疗包括语言、职业和物理疗法。对于孤独症没有标准的医学治疗,但是有时用这样的药物如抗抑郁药、抗精神病药、抗惊厥药和哌甲酯治疗问题行为和症状。然而,不存在病性改善性治疗(disease-modifying treatment)。

一些发明目的

因此,本发明的一个目的是提供一种新的用于诊断的生物学标记。本发明的另一个目的是提供用于确定样品中,例如生物样品中新标记的浓度的分析方法,例如,用于诊断目的方法。此外,本发明的一个目的是提供用于诊断神经疾病和/或神经精神疾病的基于生物学标记的新的、改进的方法,所述神经疾病和/或神经精神疾病诸如特别是孤独症(autism),以及阿斯珀格综合征(Asperger’s syndrome),阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease),帕金森病(Parkinson’s disease),肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis),多发性硬化(multiple sclerosis),精神分裂症(schizophrenia),抑郁症和双相性精神障碍(bipolar disorder)。本发明的另一个目的是提供用于孤独症的治疗,所述治疗是病性改善性的而不仅仅是针对症状的。

发明概述

在第一方面,本发明提供具有氨基酸序列NH2-SSKITHRIHWESASLLR*-COOH(SEQ ID NO:1)的肽,其中用R*表示的C端残基具有式(I)所示的侧链:

在第二方面,提供一种分析方法,包括确定第一方面的肽在样品中的存在、不存在和/或浓度的步骤。样品优选是生物样品。更优选地,所述生物样品选自由下列各项组成的组:血液样品,血浆样品,肝素化血浆样品,EDTA-血浆样品,血清样品,尿样,唾液样品,泪液样品,脑脊液样品,腹水样品,组织样品和活组织检查样品。最优选地,生物样品是肝素化血浆样品。

确定所述肽的存在、不存在和/或浓度可以通过基于质谱的方法进行,诸如通过MALDI-TOF、SELDI-TOF、LC-MS或LC-MS/MS进行;或通过免疫化学测定法进行,诸如通过ELISA、RIA、FIA或DELFIA进行。

在第三方面,本发明提供对第一方面的肽特异性的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

在第四方面,提供用于诊断的产品套装,所述包装包括第一方面的肽和/或第三方面的抗体。所述产品套装还包括下述中的一种或多种:蛋白酶抑制剂;用于确定第一方面的肽的浓度的使用说明书;具有序列SSKITHRIHWESASLL(SEQ ID NO:2)的肽;具有序列SSKITHRIHWESASLLR(SEQ ID NO:3)的肽;对SEQ ID NO:2特异性的抗体;对SEQ ID NO:3特异性的抗体。

在第五方面,提供诊断神经疾病或神经精神疾病的方法,所述方法包括下述步骤:

-提供或获得来自待诊断的受试者的样品;

-确定所述样品中第一方面的肽的浓度;和

-将所述浓度与参照值进行比较,所述参照值是基于第一方面的肽在来自健康对照受试者的类似样品中的浓度;

其中所述样品中低于所述参照值的浓度指示存在神经疾病或神经精神疾病。

第五方面的方法可以进一步包括下述步骤:

-确定具有序列SSKITHRIHWESASLLR(SEQ ID NO:3)和/或SSKITHRIHWESASLL(SEQ ID NO:2)的肽在所述样品中的浓度;和

-将所述浓度与参照值进行比较,所述参照值是基于相同的肽在来自健康对照受试者的类似样品中的浓度;

其中所述样品中比所述参照值高的浓度进一步指示存在神经疾病或神经精神疾病。

在第五方面的方法中,确定浓度的步骤可以通过第二方面的方法进行。

第五方面的神经疾病或神经精神疾病可以选自孤独症,阿斯珀格综合征,阿尔茨海默病,帕金森病,肌萎缩性侧索硬化,多发性硬化,精神分裂症,抑郁症和双相性精神障碍。最优选地,所述疾病是孤独症。

在第六方面,提供第一方面的肽在诊断方法中的用途。优选地,所述肽用于诊断孤独症、阿斯珀格综合征、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化、精神分裂症、抑郁症和双相性精神障碍。最优选地,所述肽用于诊断孤独症。

在第七方面,提供诊断孤独症的方法,所述方法包括下述步骤:

a.提供或获得来自待诊断的受试者的样品;

b.确定所述样品中补体因子I的活性水平;和

c.将所述活性与参照值进行比较,所述参照值是基于补体因子I在来自于健康对照受试者的类似样品中的活性水平;

其中所述样品中比所述参照值高的活性指示所述受试者中存在孤独症。

第七方面的方法中的样品可以选自由下列各项组成的组:血液样品,血浆样品,肝素化血浆样品,EDTA-血浆样品,血清样品,尿样,唾液样品,泪液样品,脑脊液样品,腹水样品,组织样品和活组织检查样品。优选地,所述样品是血浆样品。

第七方面的方法可以进一步包括进行第五方面的方法来诊断孤独症,并且综合这些结果产生对孤独症的更灵敏和/或选择性的诊断。

第五方面的用于诊断孤独症的方法可以进一步包括进行第七方面的方法,并且综合这些结果产生对孤独症的更灵敏和/或选择性的诊断。

在第八方面,提供治疗孤独症的方法,所述方法包括给需要所述治疗的受试者施用补体因子I抑制剂化合物。

在第九方面,提供补体因子I抑制剂化合物在制备用于治疗孤独症的药物中的用途。

在第十方面,提供用于治疗孤独症的补体因子I抑制剂化合物。

第八、第九或第十方面的补体因子I抑制剂化合物可以选自由下列各项组成的组:对-胍基苯甲酸6-脒基-2-萘基酯二甲磺酸盐(FUT-175),丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin),苯磺酰氟(benzenesulfonyl fluoride)诸如SC,苏拉明(suramin),WAP-型抑制剂如弹性蛋白酶特异性抑制剂(抑制性蛋白酶蛋白(elafin))。优选地,所述化合物选自FUT-175、抑制性蛋白酶蛋白和苏拉明。

在第十一方面,提供用于评价受试者中孤独症治疗的功效的方法,所述方法包括下述步骤:

a.确定治疗前在所述受试者中第一方面的生物标记水平的基线值;

b.对所述受试者实施待评价的治疗;

c.在(b)之后,确定在所述受试者中第一方面的生物标记的水平;和

d.比较(a)和(c)中得到的水平;

其中第一方面的生物标记水平的增加指示对所述治疗的治疗性应答。

在第十二方面,提供用于评价受试者中孤独症治疗的功效的方法,所述方法包括下述步骤:

a.确定治疗前在所述受试者中补体因子I活性水平的基线值;

b.对所述受试者实施待评价的治疗;

c.在(b)之后,确定在所述受试者中补体因子I活性水平;和

d.比较(a)和(c)中得到的水平;

其中补体因子I活性降低指示对所述治疗的治疗性应答。

第十一方面的方法可以进一步包括进行第十二方面的方法,并且综合这些结果以产生提高的灵敏性和/或选择性。

第十二方面的方法可以进一步包括进行第十一方面的方法,并且综合这些结果以产生提高的灵敏性和/或选择性。

附图简述

图1显示在SEQ ID NO:1的新的肽生物标记中C端精氨酸的侧链修饰。A)正常的精氨酸侧链。B)在本发明的新的肽生物标记中C端精氨酸的修饰的侧链的结构。该具有修饰的侧链的氨基酸已知为鸟氨酸。

图2显示来自4名诊断为孤独症的不同受试者(表示为D)和4名不同的健康对照儿童受试者(表示为C)的样品的代表性质谱。1865(SEQ ID NO:2)、1978(SEQ ID NO:1)和2021(SEQ ID NO:3)的位置标记表示在上部。明显的是,与健康受试者相比较,标记1865和2021在患有孤独症的受试者中升高,而标记1978在孤独症受试者中减少。Y-轴单位:μA。X-轴:表观MW(Daltons)。Y-轴自动分级,以显示相关的峰。对于每组的Y-轴近似分级如下:D1:0-700;D2:0-1000;D3:0-350;D4:0-800;C1:0-300;C2:0-400;C3:0-650;C4:0-650。

图3以图表形式显示实施例3对于标记1978(SEQ ID NO:1)的测量(表1中的数值)。表示为“0”的组包含来自健康对照受试者的结果,而表示为“1”的组包含来自孤独症受试者的结果。

图4显示在截止标准、选择性和灵敏性之间存在的相互关系。

图5显示本发明的新的肽生物标记(SEQ ID NO:1)在基于实施例3的数据的孤独症诊断中的接受者操作特征(ROC)曲线。

图6是显示已知的SEQ ID NO:3的肽生物标记在基于实施例3的数据的孤独症诊断中的接受者操作特征(ROC)曲线的比较例。

图7显示通过组合SEQ ID NO:1的新的肽生物标记与已知的SEQ ID NO:3的标记在用于基于实施例3的数据的孤独症诊断中得到的接受者操作特征(ROC)曲线。与每种单独的标记相比,提高的灵敏性和选择性是明显的。

图8显示通过组合SEQ ID NO:1的新的肽生物标记与已知的SED IQ NO:2和SEQ ID NO:3的标记在用于基于实施例3的数据的孤独症诊断中得到的接受者操作特征(ROC)曲线。提高的灵敏性是明显的。

图9:7-氨基-4-甲基香豆素的释放作为血浆温育时间的函数(平均值±SD;1h(974±44.2),2h(1995±45.2)和3h(2374±1.2))的荧光强度。

图10:(a)在来自患有孤独症谱系障碍(ASD)的儿童(n=30)和健康对照儿童(n=30)的EDTA血浆中的补体因子I活性。显示每个个体的因子I活性的散点图。显示来自在研究时没有用药的ASD儿童的样品,来自使用维思通、利他林、二者的组合或其他药物如抗精神病药(硫利达嗪)或抗惊厥药(苯巴比妥和丙戊酸钠)的用药的ASD儿童的样品。(b)对于患有ASD的儿童和健康对照组按照不同年龄组和性别显示EDTA血浆中补体因子I活性的平均值和标准误差。在ASD组中;年龄≤5岁:男孩(n=17),女孩(n=4)和年龄>5岁:男孩(n=6),女孩(n=3)。在健康对照组中;年龄≤5岁:男孩(n=4),女孩(n=10)和年龄>5岁:男孩(n=9),女孩(n=7)。

定义

术语孤独症(autism)和孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)在本发明的上下文中具有相同的意思,并且是指按照DSM-IV标准(美国精神病联合会精神疾病诊断和统计学手册(American Psychiatric Association Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders))的孤独症诊断。

术语灵敏性在本发明的上下文中意指实际的阳性受试者被正确鉴定为阳性受试者的比例(例如,正确鉴定为患有孤独症疾病的孤独症受试者的百分数)。

术语特异性在本发明的上下文中意指按本样实际的阴性受试者被正确鉴定为阴性受试者的比例(例如,正确鉴定为不患有孤独症疾病的健康受试者的百分数)。

在本文中,生物标记有时使用其观察到的近似分子量作为名称鉴定。表II显示观察到的分子量/名称、序列和SEQ ID NO之间的关系。

发明详述

新的修饰的肽生物标记

在第一方面,本发明公开一种具有氨基酸序列NH2-SSKITHRIHWESASLLR*-COOH(SEQ ID NO:1)的修饰的肽,其中用R*表示的C端残基的侧链缺少在精氨酸中正常存在的NH2-C=NH部分,因此R*残基的侧链具有式(I)所示的结构:

对于侧链修饰的本质的另外图示,参见图1。具有式(I)的侧链的氨基酸已知为鸟氨酸,但是其通常不存在于多肽中。

分析方法

在第二方面,本发明公开用于分析第一方面的肽(优选在生物样品中)的存在、不存在和/或浓度的方法。所述分析可以通过本领域已知适于所述分析的任意方式进行,诸如基于质谱的方法(包括MALDI-TOF,SELDI-TOF,LC-MS,LC-MS/MS等)或适当的已知的免疫化学方法(包括ELISA,RIA,DELFIA等)。也可以组合免疫化学方法和基于质谱的方法进行分析,诸如在SELDI-TOF中使用抗体包被的芯片。在一些情形中,样品可以在分析前进行浓缩或纯化。对于稀的样品,如尿和脑脊液,浓缩是特别优选的。例如,所述浓缩和/或纯化可以通过使用超滤(如果需要保留生物标记,优选使用约1.0-1.5kD的适当的截留MW;备选地,可以使用约10kD的截留MW以去除较高分子量的蛋白)、通过选择性蛋白沉淀或通过蒸发样品中全部或部分的流体而进行。层析技术也能够用于浓缩样品以及进行纯化。在pH 7对CM10表面的结合特征(实施例3)为优化层析纯化方案提供了合适的起点。

优选地,生物样品选自:血液样品,血浆样品,肝素处理的血浆样品,EDTA-血浆样品,血清样品,尿样,唾液样品,泪液样品,脑脊液样品,腹水样品,组织样品和活组织检查样品。更优选地,生物样品是肝素血浆样品。最优选地,生物样品使用蛋白酶抑制剂,如无EDTA的抑制剂混合物(来自美国Thermo Scientific的Halt蛋白酶抑制剂)(例如10μL/mL血浆)和SC(Pentapharm Ltd,瑞士)(例如20μL/mL血浆)处理的肝素血浆样品。

抗体

在第三方面,本发明涉及对第一方面的肽特异性的抗体。在本文描述的肽本身的公开内容的辅助下,技术人员能够应用本领域公知的方法来获得并且表征对所述肽的特异性多克隆或单克隆抗体。

诊断产品

在第四方面,公开一种诊断产品(诸如试剂盒),其包括第一方面的肽和/或第三方面的抗体。优选地,所述诊断产品还包括下述中的一种或多种:使用指导;蛋白酶抑制剂;SEQ ID NO:2的肽;SEQ ID NO:3的肽;对SEQ ID NO:2特异性的抗体;对SEQ ID NO:3特异性的抗体。所述肽可以作为阳性对照/参照样品,所述抗体可以作为用于免疫学分析方法的检测试剂。

诊断方法

在第五方面,公开一种用于神经疾病和/或神经精神疾病的诊断方法,所述方法基于确定第一方面的肽标记,优选通过第二方面的方法来确定。SEQ ID NO:1的肽标记可以有利地与已知的诊断标记(诸如在WO/2004/079371中公开的那些(优选SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3))的确定进行组合。将来自第一方面的肽标记与另外的标记的结果组合提供具有提高的特异性和/或灵敏性的诊断方法。

为了能够用于诊断,上述一种或多种标记的浓度必须与参照值(还已知为“截止值”)进行比较。适当地,参照值通过确定来自健康对照受试者的相同标记的浓度(最优选地,使用相似的方法和相似的样品)或更优选地通过获得来自一组健康对照受试者的平均值而得到。第一方面的标记在健康受试者中存在,但是在患有神经疾病和/或神经精神疾病如孤独症的受试者中倾向于不存在或者具有较低的浓度。

技术人员应该理解,视为指示存在疾病的与参照值不同的水平将在各情形之间不同,在最现实的情形中,在健康群体和在患有疾病的群体中的标记浓度将在某种程度上部分重叠。要求较大的差别将提高诊断方法的特异性但是会牺牲灵敏性;要求较小的差别将提高灵敏性,代价是特异性降低(见图4的举例说明)。理想的特异性和灵敏性的水平将取决于设置而变化:例如,在检测先前不怀疑患有疾病的受试者的筛选步骤中,需要非常高的特异性来避免大量假阳性;当检测已经怀疑患有疾病的受试者时,可能相反优先高灵敏性,接受较低的特异性。确定的一种标记或多种标记的浓度还可能取决于用来测定浓度的具体的分析方法的特征、以及样品的类型和样品的处理而不同。所有这些考虑对于技术人员来说是公知的。同样地,通过组合本文的教导和仅是常规的实验和优化方法,对上述问题的解决方案(例如,确定截止值)在技术人员的能力范围之内。

能够用于确定截止值的统计学工具已知为接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线,其可以按下述构建。按测量的参数排列所有受试者(患者和对照者)。从表格的上部开始,并且对每个新测量的值连续计算对所有受试者的灵敏性和100-特异性(灵敏性=posP/allP(posP/所有P),其中posP是使用该测量值分类为患有该疾病的患者数目(患者意指患有疾病的受试者)),特异性为negC/allC(negC/所有C),其中negC是不分类为患有该疾病的对照者。将这些值以x-y-图表绘图,其中“100-特异性为x”,灵敏性为y,形成ROC-曲线。

截止值总是调整到实际情形,包括疾病的流行,特别是疾病的严重性程度,但是统计学程序(对临床情形无所知)通常通过将ROC-曲线的左上角的距离最小化(即,最小化((100-灵敏性)^2+(100-特异性)^2))而计算截止,其中^意指平方(Pythagoras theorem)。图5-8显示使用该方法获得的“标准”(意指截止值)、灵敏性和选择性的值。

关于生物标记的组合,重要的是挑选出哪些在有助于患者和受试者的区分的意义上实际上是独立的(至少在某种程度上-这意味着,例如,一个峰尽管与另一个峰偶合,但是其对于鉴别力具有一些另外的贡献)。可以使用多种已知的统计学方法,例如,判别分析或对数回归。对于另外的细节,技术人员参考在http://www.medcalc.org/manual/index.php上在线可用的软件(MedCalc Software,Mariakerke,Belgium)手册。

考虑到上述内容,进行了示例性的分析(实施例5)。分析显示,新的1978标记(SEQ ID NO:1)清楚地具有相当好的区分患有和不患有孤独症的受试者的潜力,具有与已知的标记2021(SEQ ID NO:3)和1865(SEQ ID NO:2)可比水平的区分力(表III,图3,5和6)。为了检测将新的1978标记与已知标记1865和2021中的一种或两种组合将产生改善的诊断方法的假设,对1978与2021的组合(图7)和1865、1978与2021的组合(图8)也作出ROC曲线(在判别分析后)。通过比较图7的ROC-曲线与图5和图6的曲线,明显看出组合新的1978标记与已知的2021标记产生比独立的每种标记更好的结果。分析中加入第二种已知的标记1865也产生更好的结果(图8与图7比较)。

优选地,要诊断的神经疾病和/或神经精神疾病选自孤独症,阿斯珀格综合征,阿尔茨海默病,帕金森病,肌萎缩性侧索硬化,多发性硬化,精神分裂症,抑郁症和双相性精神障碍。最优选地,所述要诊断的神经疾病和/或神经精神疾病是孤独症。

在第七方面,提供诊断孤独症的方法,所述方法包括下述步骤:

a.提供或获得来自待诊断的受试者的样品;

b.确定所述样品中补体因子I的活性水平;和

c.将所述活性与参照值进行比较,所述参照值是基于补体因子I在来自于健康对照受试者的类似样品中的活性水平;

其中样品中比所述参照值高的活性指示所述受试者中存在孤独症。

第七方面的方法中的样品可以选自由下列各项组成的组:血液样品,血浆样品,肝素化血浆样品,EDTA-血浆样品,血清样品,尿样,唾液样品,泪液样品,脑脊液样品,腹水样品,组织样品和活组织检查样品。优选地,所述样品是血浆样品。

确定补体因子I的活性水平可以使用如实施例6所述的荧光测定(参见6.1.2.2节)进行。当然也可以使用其他确定方法。

关于补体因子I的参照值可以按上述公开的内容作必要的修正而获得。

第一方面的方法可以进一步包括进行第五方面的方法来诊断孤独症,并且综合这些结果产生对孤独症的更灵敏和/或选择性的诊断。综合可以例如使用上述ROC方法进行,其中补体因子I活性视为决定因素。

第五方面的用于诊断孤独症的方法可以进一步包括进行第七方面的方法,并且综合这些结果产生对孤独症的更灵敏和/或选择性的诊断。

本发明还公开第一方面的肽在诊断方法、优选在诊断孤独症的方法中的用途。

孤独症的治疗

Momeni等已经公开(Autism Research and Treatment Volume 2012(孤独症研究和治疗卷2012)(2012),Article ID 868576,doi:10.1155/2012/868576)患有孤独症谱系障碍的儿童在血浆中具有高补体因子I活性(实施例6)。

补体因子I是人血浆中存在的丝氨酸蛋白酶,其参与补体蛋白C3b的降解。补体因子I活性不足与人类中增加的感染发病率相关。

在该论文中,Momeni等表明,ASD组中补体因子I活性的平均水平显著高于典型发育和健康的儿童对照组中的平均水平,这表明高的补体因子I活性可能对ASD的发生具有影响。

因此,使用补体因子I的抑制剂对孤独症提供治疗。多种补体因子I抑制剂化合物和化合物种类是已知的,包括对-胍基苯甲酸6-脒基-2-萘基酯二甲磺酸盐(FUT-175),丝氨酸蛋白酶抑制蛋白,苯磺酰氟诸如SC,苏拉明,WAP-型抑制剂,如弹性蛋白酶特异性抑制剂(抑制性蛋白酶蛋白)(实施例7)。

确定补体因子I抑制剂的适当给药可以由本领域技术人员通过仅仅常规的实验和优化方法进行。在已知对人应用的安全用药间隔的已知化合物的情形中,实验的自然起点是所述间隔。可以通过按照在实施例6.1.1所述的范例重复(例如,每周)评估与基线(即,在治疗开始前)比较而监测治疗的功效(功能的提高)。

FUT-175可以口服施用。给药可以开始为0.1mg/kg/天(分成每天两次剂量),并且必要时,增加为0.25mg/kg/天(分成每天两次或四次剂量),随后增加至0.5mg/kg/天(分成每天四次剂量)。

苏拉明可以通过静脉内注射施用,以0.1g/单次每周静脉内注射起始。必要时,剂量以0.1g的增量逐渐增加直至每次注射1g。

抑制性蛋白酶蛋白可以通过静脉内注射施用,以10mg每天两次起始。必要时,剂量逐渐升高至每次注射20,100,200mg和然后的400mg。

评价孤独症治疗功效的方法

在第十一方面,提供用于评价受试者中孤独症治疗的功效的方法,所述方法包括下述步骤:

a.确定治疗前在所述受试者中第一方面的生物标记水平的基线值;

b.对所述受试者实施待评价的治疗;

c.在(b)之后,确定在所述受试者中第一方面的生物标记的水平;和

d.比较(a)和(c)中得到的水平;

其中第一方面的生物标记水平的增加指示对所述治疗的治疗性应答。

所述值的确定可以以关于第五方面公开的方式进行。

在第十二方面,提供用于评价受试者中孤独症治疗的功效的方法,所述方法包括下述步骤:

a.确定治疗前在所述受试者中补体因子I活性水平的基线值;

b.对所述受试者实施待评价的治疗;

c.在(b)之后,确定在所述受试者中补体因子I活性水平;和

d.比较(a)和(c)中得到的水平;

其中补体因子I活性降低指示对所述治疗的治疗性应答。

所述值的确定可以以关于第七方面公开的方式进行。

第十一方面的方法可以进一步包括进行第十二方面的方法,并且综合这些结果以产生提高的灵敏性和/或选择性。

第十二方面的方法可以进一步包括进行第十一方面的方法,并且综合这些结果以产生提高的灵敏性和/或选择性。

总结评论

下述实施例应该视为是非限制性的。其中所用的参考文献通过引用完全结合于本文。

实施例

1.患者和对照者选择

所有患有孤独症谱系障碍(ASD)的儿童由临床孤独症专家检查。儿童精神病医师检查所有的儿童,所述所有的儿童也由儿童神经科医师或儿童心理医师检查。所有会诊者同意依据DSM-IV标准(American Psychiatric Association Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders)诊断为孤独症。从同一地区招募对照组,对照组和由没有神经疾病和/或神经精神疾病征兆的健康儿童组成。在检查开始前两周之前具有任意类型感染的对照儿童排除在该研究之外。

在年龄和性别上没有显著差异。ASD组中的儿童从孤独症康复中心招募。

2.取样

收集静脉血到3mL肝素管(Vacutainer System;Becton-Dickinson Inc.,Plymouth,UK)中,立即通过在4℃ 1300g离心10分钟而分离血浆。然后,向所产生的血浆样品中加入不含EDTA的抑制剂混合物(来自美国Thermo Scientific的Halt蛋白酶抑制剂)(10μL/mL血浆)和另外20μL/mL的Pefablock SC(Pentapharm Ltd,瑞士)。所产生的血浆平分成小部分,并且立即在干冰上冷冻,然后转移至(-80℃)进一步存储。从血液收集到冷冻的整个程序在20分钟内完成。

3.质谱分析(SELDI-TOF)

按照BioRad的标准流程准备CM10蛋白芯片阵列表面。具有8个点的CM10蛋白芯片阵列(携带COOH官能团)用100μL缓冲液(低严格性0.1M醋酸钠,pH 4)平衡5分钟,并且重复一次。使用磷酸钠缓冲液(25mM,pH-7.0)制备血浆稀释液(1∶50稀释)。将稀释的血浆应用在生物处理器孔中。芯片阵列在激烈震荡下温育45分钟。温育后,将样品用150μL 25mM磷酸钠缓冲液pH-7(与稀释缓冲液相同)洗涤三次,然后用150μL 1mMHEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸),pH 7快速润洗两次。将芯片阵列从生物处理器中取出,并且晾干。之后,向每个点加入0.8μL饱和的CHCA(25mg/mL),并且允许晾干,该步骤再重复1次。然后,芯片阵列由BioRad蛋白便宜的读数仪SELDI系统个人版(BioRad protein cheap reader SELDI system personal Edition)(PCS 4000读数仪)读取。在读取芯片阵列之前,使用Biorad“整套肽标准(all in one peptide standard)”进行外部校准,Biorad“整套肽标准(all in one peptide standard)”是范围在约1000-7000Da内的7种不同的肽的混合物。

在该研究中,通过上文所述的SELDI-TOF分析来自22名对照者和25名患者的样品。测量的数据通过自然对数标准化(表I,图3)。

在来自健康对照儿童和ASD组的质谱中检测到多种差异性表达的肽,诸如具有已经观察到的分子量1865,1978和2021的肽。图2显示来自8名受试者(4名不同的患者和4名不同的对照者)的代表性SELDI-TOF质谱。

表I:对于分别具有约1865、1978和2021的分子量(MWs)的标记的标准化(自然对数)峰强度

组 ID 1865 1978 2021 对照 c1 2.451 5.237 4.61 对照 c10 2.397 5.146 5.06 对照 c11 3.231 3.972 5.19 对照 c12 3.33 3.963 5.136 对照 c13 3.436 5.154 4.256

对照 c17 3.426 5.781 3.847 对照 C18 3.415 5.046 5.206 对照 c2 3.827 4.28 4.592 对照 c20 3.633 5.287 5.308 对照 c21 3.105 4.689 4.733 对照 c22 2.819 4.782 4.355 对照 c23 5.327 6.463 6.723 对照 c24 2.549 5.526 4.516 对照 c25 3.476 5.307 4.292 对照 c26 3.543 4.542 4.207 对照 c28 3.041 5.766 4.708 对照 c29 2.801 4.116 4.52 对照 c3 2.734 4.464 5.199 对照 c31 2.978 3.653 4.454 对照 c33 2.567 5.514 4.739 对照 c4 3.908 4.742 5.003 对照 c6 3.519 4.917 4.976 对照 c7 2.361 3.925 5.039 对照 c8 2.508 3.112 5.038 对照 c9 2.628 4.078 4.358 患者 d10 4.253 4.504 6.548 患者 d11 3.534 5.209 7.229 患者 d13 6.522 4.731 5.353

患者 d14 5.462 4.483 6.577 患者 d15 3.427 4.244 5.13 患者 d17 3.934 4.358 5.135 患者 d19 3.811 3.522 5.055 患者 d20 1.937 3.214 5.328 患者 d21 3.616 3.517 6.03 患者 d22 3.623 3.883 5.791 患者 d25 3.229 3.064 6.077 患者 d26 3.497 3.467 4.5 患者 d27 3.288 4.105 5.311 患者 d28 2.662 3.312 5.547 患者 D3 5.297 5.76 6.936 患者 d30 3.379 6.022 4.273 患者 d4 3.311 4.072 4.987 患者 D5 3.745 4.116 5.153 患者 D6 4.652 4.146 4.651 患者 d7 5.667 4.016 6.23 患者 d8 3.528 3.448 6.404 患者 d9 3.559 3.362 5.15

4.确定差异性表达的生物标记的结构

通过使用MALDI-TOFTOF MS确定在实施例3中差异性表达的生物标记的结构并且通过LC-FTICR MS/MS信息验证。鉴定目的肽(通过SELDI-TOF鉴定的并且在对照组和孤独症组之间明显不同的那些)并测序。

将100μL血浆样品用300μL缓冲液(25mM磷酸钠缓冲液,pH 7.0)和100μL乙腈(AcN)稀释并且充分混合,然后使用10kDa截止Microcon膜(Millipore Bedford,MA,USA)进行超滤。超滤物在Speed vac离心机中干燥,然后重建在10μL缓冲液(25mM磷酸钠,pH 7.0)中,在C18柱(Millipore,Bedford,MA,美国)上脱盐。将5μL重建的样品应用制备的SELDI-TOF CM-10靶标(Biorad,USA)上,温育,洗涤并且干燥。

将1.0μL饱和基质CHCA(25mg/mL)添加到样品点上,并且允许晾干,该步骤再重复1次。

用于验证所述肽的MALDI-TOF-MS仪器是Ultraflex II TOF/TOF(Bruker Daltonik GmbH,Bremen,德国)。该仪器装备有SmartBeamTM激光。使用反射模式(reflectron mode)获得所有的质谱。为了获得MS/MS谱,进行通过激光诱发的解离的源后衰变(post source decay,PSD)TOF/TOF。

对于MALDI方法选择的靶标是SELDI-TOF靶标(BioRad,USA)。将在SELDI-TOF靶标上制备的基质/样品点引入到Ultraflex II中,并且记录来自制备的样品点的MS谱。使用的校准是外部近邻校准(external near neighbor calibration)。用于校准的样品是覆盖1000-5000Da的质量范围的肽的混合物。从所得到的肽质量(TOF MS数据),手工选择候选肽用于后续实验/测序。质谱用数据处理软件(FlexAnalysisTM)注解,并且最终由软件辅助的从头序列分析(BioToolsTM)解译。关于差异性表达的肽的结果显示在下表II中。

表II:差异性表达的肽的结构确定

5.差异性表达的生物标记的诊断价值

使用计算机软件如软件(MedCalc Software,Mariakerke,比利时)进行实施例3得到的结果(表I)的统计学分析。

所有标记在对照组和孤独症组之间显示统计学显著性差异(p<0.05)(双侧t-检验)。见表III。

表III:表II所示的数据的统计学分析

新的1978标记清楚地显示相当好的区分患有和不患有孤独症的受试者的潜力,具有与已知的标记2021和1865相当水平的区分力。

对于1978标记,作出接受者操作特征(ROC)曲线(图5)。为了比较目的,也对已知的2021标记作出ROC曲线(图6)。

为了分析上述生物标记组合的效用,使用判别分析按照其对预期可以在临床上用于诊断所述疾病的区分的贡献给出峰值(对数值)不同权重。

表IV:用于ROC-曲线构建的标记组合的判别分析

标记组合 基于判别分析的权重 产生的ROC-曲线 1865和1978 1865*(1.73)+1978*(-1.87) 没有显示 1865和2021 2021*(1.48)+1865*(0.62) 没有显示 1978和2021 2021*(1.99)+1978*(-1.36) 图7 1865,1978和 2021*(1.52)+1978*(-1.90)+1865*(1.33) 图8

2021    

图7和8的ROC-曲线清楚地显示新的标记1978与已知的标记的组合产生提高的区分力。

6.在孤独症患者中补体因子I过度活跃。

本研究早前由Momeni等公布(Autism Research and Treatment Volume2012(孤独症研究和治疗卷2012)(2012),Article ID 868576,doi:10.1155/2012/868576)。所述公布通过引用完全结合于本文。某些关键章节在下文中重现。

6.1材料和方法

6.1.1参与者

30名患有ASD的儿童和30名典型的对照儿童参与本研究。ASD组包括23名男孩和7名女孩,平均年龄为4.5岁(年龄在3-9岁范围内)。对照组包括13名男孩和17名女孩,平均年龄为6.0岁(年龄在3-12岁范围内)(表V)。

表V:参与者的年龄/y、性别和用药。*ASD与对照者之间的差异。对于年龄用Mann-Whitney U-检验,对于年龄范畴和性别用Fisher’s精确性检验。

ASD组中的儿童从伊朗德黑兰的社会福利和康复科学大学(University of Social Welfare and Rehabilitation Sciences)的孤独症康复中心招募。在得到家长的知情同意后,采集血液样品。所有患有ASD的儿童由临床专家检查孤独症。儿童精神病医师和儿童神经科医师或儿童心理医师检查所有的儿童。所有会诊者同意依据DSM-IV标准诊断为孤独症。然而,在伊朗所用的诊断方法不使用在欧洲和美国/加拿大所用的使用孤独症诊断观察方案(autism diagnostic observation schedule,ADO S)和孤独症诊断检查-修订版(Autism Diagnostic Interview Revised)的诊断程序。这一缺点通过儿童神经科医师/儿童精神病医师的广泛的临床经验得以补偿,所述儿童神经科医师/儿童精神病医师熟悉美国小儿科学会(American Academy of Pediatrics)在其自2007年以来的Embargo中所述的孤独症的核心行为。对照组由从与患有ASD的儿童相同的地区招募的不表现神经发育疾病的征兆的典型发育和健康的儿童组成。在检查时前的两周内具有任意类型的感染/传染病的儿童排除在该研究之外。

该研究得到德黑兰的伊朗医学大学的伦理委员会的核准(,MT/1247)。

6.1.2步骤

6.1.2.1血液样品采集

血液样品由儿科护士采集,并且来自诊断患有孤独症的儿童的血液样品在具有儿童期精神病领域的专业训练的儿童精神病医师的监督下采集。将静脉血采集到3mL EDTA管(Vacutainer System;Becton-Dickinson Inc.,Plymouth,UK)中,并且然后立即通过在4℃以1,300g离心10分钟分离血浆。然后,向得到的血浆样品中加入抑制剂混合物(30μL/1mL血浆)(混合物抑制剂溶液:2.0M Tris,0.9M Na-EDTA,0.2M苄胺,92μM E-64,和48μM胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin);Sigma,St.Louis,Mich,USA)。血浆保存在-80℃。

6.1.2.2测定

先前Tsiftoglou和Sim(Journal of Immunology(免疫学杂志),vol.173,no.1,pp.367-375,2004)和Gupta等(Journal of Autism and Developmental Disorders(孤独症和发育疾病杂志),vol.26,no.4,pp.439-452,1996)已经描述了基于荧光底物的水解的方法。发现下述测定步骤最适于测定血浆中的补体因子I(fI)活性。将20μL血浆用80μL缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液,pH 7.5,含有1mM EDTA,1mM DTT和1mM叠氮化钠)在37℃温育10分钟,以达到热平衡。然后加入100μL在25mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中的底物溶液(200μM Boc-Asp(OBz)-Pro-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素;Bachem,Bubendorf,瑞士),混合物在37℃温育60分钟(见图9)。通过加入1mL 1.5M的乙酸抑制反应,并且通过荧光分光光度计(Hitachi-f 2000;λex:360nm;λem:440nm;隙缝宽度:2.5)测量7-氨基-4-甲基香豆素的释放。所有测量随机并且一式两份进行。通过使用不存在底物的血浆监测测定中的背景荧光,并且从在存在底物时得到的值中减去背景荧光。

6.1.3数据分析和统计

血浆fI活性对数正态分布,并且因此,在分析ASD组和对照组之间的差异时,使用对数值。为了按年龄(用中值(5岁)对分)和性别调整,使用因素ANOVA(factorial ANOVA)。认为<0.05的值是统计学显著的。使用Statistica 8.0(Tulsa,Okla,USA)。血浆fI活性的测定内变异性和测定间变异性用下式表示为单次确定的标准误差(S方法):

其中di是第i个(i:th)成对测量之间的差异,n是差异的数目。S方法表示为变异系数(%)

6.2结果

当与对照组:361(135-967;ANOVA P=0.015,按年龄和性别调整;图10a)相比时,患有ASD的儿童中存在显著更高的血浆fI活性(几何平均值(95%置信界限)):523(154-1776)。

关于性别和年龄,没有发现统计学显著的相互作用,并且在fI活性和年龄或性别之间没有发现显著相关性(ANOVA;对于性别p=0.25,对于两个年龄组为0.42,图10b)。在ASD组中,一些患有严重孤独症的儿童用维思通用药,以减轻活动过度和暴力行为,少数用利他林用药以提高注意力(表V)。以控制实验设计的目的中断用药将具有伦理学问题。我们已将图10a所示的数据与ASD组儿童所接受的用药类型相关。尽管我们没有看出在用药和散点图数据分布之间任何清楚的相关性,但是不能排除图中的一些差异可能受用药影响。

在患有ASD的儿童中,数值在统计学意义上显著更高,并且与性别弱相关。然而,在年龄组之间没有发现统计学显著性差异。

方法的测定内误差小,为0.5%。测定间方法误差为13%。与大约相同年龄的对照组相比,我们在患有ASD的儿童中发现显著更高的补体因子I酶活性。据我们所知,这是关于在患有ASD的儿童中fI活性的机能障碍的首次报道。尽管不是统计学显著的,男孩倾向于表现出比女孩更高的fI活性,并且对照组与ASD组之间的差异在年龄较小的儿童中更令人信服,如图10所示。由于fI作为补体系统途径中的调节因子的作用,fI异常可在ASD发作中起作用。该途径的缺陷使得个体更易感各种炎症。

7.用补体因子I治疗孤独症

苏拉明

用苏拉明治疗诊断患有孤独症的患者,以0.1g/单次每周静脉内注射起始。必要时,剂量以0.1g的增量逐渐增加直至每次注射1g。剂量进一步由指导临床医师按个体调整。在严重副作用的情形中,剂量降低或治疗中止。通过按照上述6.1.1所述的范例每周评估与基线比较监测功能的改善。与基线相比,在治疗过程中观察到显著的功能改善。

FUT-175(对-胍基苯甲酸6-脒基-2-萘基酯二甲磺酸盐)

诊断患有孤独症的患者用FUT-175口服治疗。剂量以0.1mg/kg/天(分成每天两次剂量)开始,并且必要时,增加为0.25mg/kg/天(分成每天两次或四次剂量),随后增加至0.5mg/kg/天(分成每天四次剂量)。剂量进一步由指导临床医师按个体调整。通过按照上述6.1.1所述的范例每周评估与基线比较监测功能的改善。与基线相比,在治疗过程中观察到显著的功能改善。

抑制性蛋白酶蛋白

诊断患有孤独症的患者用抑制性蛋白酶蛋白通过静脉内注射进行治疗,以10mg每天两次起始。必要时,剂量逐渐升高至每次注射20,100,200mg和然后的400mg。剂量进一步由指导临床医师按个体调整。在严重副作用的情形中,剂量降低或治疗中止。通过按照上述6.1.1所述的范例每周评估与基线比较监测功能的改善。与基线相比,在治疗过程中观察到显著的功能改善。

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