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    新型幽门螺杆菌培养方法.pdf

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    新型幽门螺杆菌培养方法.pdf

    (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010327980.1 (22)申请日 2020.04.23 (71)申请人 深圳市鸿美诊断技术有限公司 地址 518000 广东省深圳市大鹏新区葵涌 街道三溪社区金业大道140号生命科 学产业园A22栋201、 301、 401 (72)发明人 侯志波巴里马歇尔郑敬元 蔡永权张伟 (74)专利代理机构 深圳市精英专利事务所 44242 代理人 于建 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/58(2006.01) C12Q 1/26(2006.01) C12Q 1/30(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/543(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种新型幽门螺杆菌培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种新型幽门螺杆菌培养方 法, 涉及细菌培养技术领域。 该方法包括磁微粒 溶液的制备、 样本的分离、 细菌培养与鉴定步骤。 本发明首次利用偶联抗体的磁微粒捕获样本中 的幽门螺杆菌, 并保持幽门螺杆菌的活性状态进 行培养, 与现有技术相比, 本申请采用特异性识 别幽门螺杆菌表面抗原的单抗/多抗和磁微粒富 集技术, 显著提高了活体幽门螺杆菌的聚集数 量, 有利于后续的扩增培养和其他检测, 具有一 定的临床应用前景。 权利要求书1页 说明书4页 CN 111454866 A 2020.07.28 CN 111454866 A 1.一种新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 包括以下步骤: S1, 将1-1000mg磁微粒、 1-100ml缓冲液与0.1-100mg抗体溶液充分混合后, 加入交联 剂, 于室温下反应2-4h, 获得包被抗体的磁微粒溶液; S2, 将0.01-1g携带有幽门螺杆菌的样本加入至0.01-100ml所述磁微粒溶液, 混合1- 20min, 震荡离心, 弃上清液, 得到待培养物; S3, 将所述待培养物均匀涂于培养基表面, 在35-38、 CO2体积分数为1-15的环境下, 培养2-7天, 得到样本菌落; S4, 对所述样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功; 所述缓冲液浓度为10-100mM。 2.如权利要求1所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述磁微粒携带羧基。 3.如权利要求2所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述缓冲液选自MES、 MOPSO、 MOPS、 HEPES、 PBS缓冲液中的至少一种, pH 3.010.0。 4.如权利要求3所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述交联剂选自EDC/ EDAC、 N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺、 碳化亚胺、 酰肼、 异氰酸钾中的一种或多 种的组合。 5.如权利要求4所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述样本选自胃粘膜组 织、 胃液或粪便的一种或多种。 6.如权利要求5所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述抗体溶液可识别幽 门螺杆菌表面的抗原, 所述抗原包括尿素酶、 过氧化氢酶、 氧化酶中的至少一种。 7.如权利要求6所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述抗体为单克隆抗体 或多克隆抗体。 8.如权利要求7所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述培养基为固体培养 基。 9.如权利要求8所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述步骤S4中, 对所述 样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功, 具体采用以下方法进行细菌鉴定: 对样 本菌落同时进行尿素酶试验、 氧化酶试验、 过氧化氢酶试验, 三个试验结果都呈阳性, 则说 明所述样本菌落为幽门螺杆菌, 判定幽门螺杆菌培养成功。 10.如权利要求9所述的新型幽门螺杆菌培养方法, 其特征在于, 所述步骤S4中, 对所述 样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功, 还包括对所述样本菌落进行形态学鉴 定。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111454866 A 2 一种新型幽门螺杆菌培养方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物培养技术领域, 尤其涉及一种新型幽门螺杆菌培养方法。 背景技术 0002 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)是1983年由澳大利亚学者巴里马歇尔 (Barry J.Marshall)和罗宾沃伦(J.Robin Warren)首次从胃黏膜组织中分离得到的一 种革兰氏阴性杆菌, 在胃黏膜定植, 与上消化道疾病, 如十二指肠溃疡、 胃溃疡、 消化不良、 胃非霍奇金氏淋巴瘤甚至胃癌的发生有关。 因此, 有效根除幽门螺杆菌对治疗消化道疾病、 预防胃癌发生非常重要。 但幽门螺杆菌治疗存在耐药问题, 临床根除治疗的效果受到抗生 素耐药的影响, 这个问题严重困扰临床医生。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种全新的培养幽门螺杆菌的方法, 为研究幽 门螺杆菌的抗生素耐药性测试提供活体菌株。 0004 为了解决上述问题, 本发明提出以下技术方案: 0005 一种新型幽门螺杆菌培养方法, 包括以下步骤: 0006 S1, 将1-1000mg磁微粒、 1-100ml缓冲液与0.1-100mg抗体溶液充分混合后, 加入交 联剂, 于室温下反应2-4h, 获得包被抗体的磁微粒溶液; 0007 S2, 将0.01-1g携带有幽门螺杆菌的样本加入至0.01-100ml所述磁微粒溶液, 混合 1-20min, 震荡离心, 弃上清液, 得到待培养物; 0008 S3, 将所述待培养物均匀涂于培养基表面, 在35-38、 CO2体积分数为,1-15的 环境下, 培养2-7天, 得到样本菌落; 0009 S4, 对所述样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功; 0010 所述缓冲液浓度为10-100mM。 0011 在其他实施例中, 也可以通过离心或磁力吸引方式沉淀下来, 0012 其进一步地技术方案为, 所述磁微粒携带羧基。 0013 其进一步地技术方案为, 所述缓冲液选自MES、 MOPSO、 MOPS、 HEPES、 PBS缓冲液中的 至少一种, pH 3.010.0。 0014 其进一步地技术方案为, 所述交联剂选自EDC/EDAC、 N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫 代琥珀酰亚胺、 碳化亚胺、 酰肼、 异氰酸钾中的一种或多种的组合。 0015 其进一步地技术方案为, 所述样本选自胃粘膜组织、 胃液或粪便的一种或多种。 0016 其进一步地技术方案为, 所述抗体溶液可识别幽门螺杆菌表面的抗原, 所述抗原 包括尿素酶、 过氧化氢酶、 氧化酶中的至少一种。 0017 其进一步地技术方案为, 所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 0018 其进一步地技术方案为, 所述培养基为液体培养基或固体培养基。 0019 其进一步地技术方案为, 所述步骤S4中, 对所述样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门 说明书 1/4 页 3 CN 111454866 A 3 螺杆菌培养成功, 具体采用以下方法进行细菌鉴定: 对样本菌落同时进行尿素酶试验、 氧化 酶试验、 过氧化氢酶试验, 三个试验结果都呈阳性, 则说明所述样本菌落为幽门螺杆菌, 判 定幽门螺杆菌培养成功。 0020 其进一步地技术方案为, 所述步骤S4中, 对所述样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门 螺杆菌培养成功, 还包括对所述样本菌落进行形态学鉴定。 0021 与现有技术相比, 本发明所能达到的技术效果包括: 0022 本发明首次利用偶联抗体的磁微粒捕获样本中的幽门螺杆菌, 并保持幽门螺杆菌 的活性状态进行培养, 与现有技术相比, 本申请采用特异性识别幽门螺杆菌表面抗原的单 抗/多抗和磁微粒富集技术, 显著提高了活体幽门螺杆菌的聚集数量, 有利于后续的扩增培 养和其他检测, 具有一定的临床应用前景。 具体实施方式 0023 下面将结合对实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述。 显然, 以下将描述的实 施例仅仅是本发明一部分实施例, 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例, 本领域普 通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例, 都属于本发明保护的 范围。 0024 应当理解, 当在本说明书和所附权利要求书中使用时, 术语 “包括” 和 “包含” 指示 所描述特征、 整体、 步骤、 操作、 元素和/或组件的存在, 但并不排除一个或多个其它特征、 整 体、 步骤、 操作、 元素、 组件和/或其集合的存在或添加。 0025 还应当理解, 在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施 例的目的而并不意在限制本发明实施例。 如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所 使用的那样, 除非上下文清楚地指明其它情况, 否则单数形式的 “一” 、“一个” 及 “该” 意在包 括复数形式。 0026 本发明提供一种新型幽门螺杆菌培养方法, 包括以下步骤: 0027 S1, 将1-1000mg磁微粒、 1-100ml缓冲液与0.1-100mg抗体溶液充分混合后, 加入交 联剂, 于室温下反应2-4h, 获得包被抗体的磁微粒溶液; 0028 S2, 将0.01-1g样本加入至0.01-100ml所述磁微粒溶液, 混合1-20min, 震荡离心, 弃上清, 得到待培养物; 0029 S3, 将所述待培养物均匀涂于培养基表面, 在35-38、 CO2体积分数为,1-15的 环境下, 培养2-7天, 得到样本菌落; 0030 S4, 对所述样本菌落进行细菌鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功; 0031 所述缓冲液浓度为10-100mM。 所述磁微粒携带羧基。 0032 需要说明的是, 本发明提供的磁微粒溶液用于捕捉样本中的幽门螺杆菌, 其含有 可识别幽门螺杆菌表面抗原的抗体, 抗体通过化学键联的方法偶联于磁微粒表面, 含羧基 的磁微粒通过化学交联剂在交联缓冲液中与抗体的氨基形成酰胺键连接, 获得成功包被抗 体的磁微粒。 0033 抗体用于识别幽门螺杆菌表面抗原, 这些表面抗原包括但不局限于尿素酶、 过氧 化氢酶、 氧化酶等, 可以是通过幽门螺杆菌表面抗原制备的单克隆或多克隆抗体。 0034 本发明提供的包被抗体的磁微粒可以高效捕捉到样本中的活体幽门螺杆菌, 又不 说明书 2/4 页 4 CN 111454866 A 4 破坏幽门螺杆菌的结构和活性, 利于富集菌量和扩增培养。 0035 目前幽门螺杆菌的耐药情况普遍, 临床上根除幽门螺杆菌的治疗方法是以质子泵 抑制剂、 铋剂为基础的三联或四联疗法, 这两种疗法是得到广泛公认的治疗方案。 治疗幽门 螺杆菌的抗生素一般选择阿莫西林、 克拉霉素、 甲硝唑、 呋喃唑酮、 左氧氟沙星、 四环素等, 但是随着抗生素的广泛应用, 幽门螺杆菌的耐药菌株也逐渐增多, 导致治疗失败。 为了减少 幽门螺杆菌的抗生素耐药率, 建议个体化根除幽门螺杆菌, 其中包括对幽门螺杆菌进行培 养和药敏检测后, 根据药敏结果选择抗生素。 0036 利用本发明提供的方法培养出来的活性幽门螺杆菌可以用于药敏分析和基因分 析等临床应用。 例如, 可以用于多种抗生素(阿莫西林, 克拉霉素, 甲硝唑, 左氧氟沙星, 呋喃 唑酮, 四环素, 利福平、 替硝唑、 头孢克肟、 多西环素)的耐药性测试。 0037 实施例1: 0038 磁微粒溶液的制备: 100mg含羧基的磁微粒在5ml MES缓冲液中(50mM,pH 6.0), 与 5mg抗体溶液充分混合, 然后加入100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)溶解于混合液中, 室温下反应24h, 获得成功包被抗体的磁微粒溶液。 0039 样本的分离、 细菌培养与鉴定: 在胃镜室用无菌活检钳在胃窦部位钳取胃粘膜活 检组织标本2-3块, 迅速挑进偶联抗体磁微粒溶液中震荡10分钟后离心, 弃掉上清后, 把磁 微粒涂于固体培养基表面, 放入二氧化碳培养箱中, 培养温度为37, 二氧化碳浓度为 10。 3-7天后观察菌落形态: 长出的菌落全部为针尖水滴样菌落, 半透明状。 对菌落扩增后 进行尿素酶、 氧化酶、 过氧化氢酶实验鉴定, 确定幽门螺杆菌培养成功。 0040 细菌鉴定方法如下: 0041 (1)尿素酶鉴定: 滴2滴尿素溶液(100mM)和2滴酚红溶液(0.1g/L)至八排管孔内, 再加20 l菌液吹打混匀, 观察颜色变化情况。 若10分钟内由淡黄色变成红色或者紫罗兰色, 说明尿素酶试验结果呈阳性, 所述样本菌落为幽门螺杆菌, 判定幽门螺杆菌培养成功。 若10 分钟内没有颜色变化, 则培养结果为阴性。 0042 (2)氧化酶鉴定: 将底物四甲基苯二胺溶于纯化水中(浓度为1mg/ml), 加入20 l菌 液吹打混匀。 若5分钟内变成蓝色, 说明氧化酶试验结果呈阳性, 所述样本菌落为幽门螺杆 菌, 判定幽门螺杆菌培养成功。 若5分钟内没有颜色变化, 则培养结果为阴性。 0043 (3)过氧化氢酶鉴定: 将底物过氧化氢溶液(浓度为1)与20 l菌液吹打混匀, 观 察气泡情况。 若3分钟内有大量气泡产生, 说明过氧化氢酶试验结果呈阳性, 所述样本菌落 为幽门螺杆菌, 判定幽门螺杆菌培养成功。 若3分钟内没有气泡变化, 则培养结果为阴性。 0044 本发明培养成功的幽门螺杆菌可用于药敏试验, 指导临床医生精准使用抗生素, 根治幽门螺杆菌。 例如, 0045 将培养成功的幽门螺杆菌用无菌生理盐水洗脱下来, 接种至药敏检测试剂盒中 (一种测定幽门螺杆菌药敏及抗生素最小杀菌浓度的试剂盒, 专利号: ZL201621132807.1), 包含: 阿莫西林(0.5mg/L和1mg/L)、 克拉霉素(0.5mg/L和1mg/L)、 甲硝唑(4mg/L和8mg/L)、 左氧氟沙星(0.5mg/L和1mg/L)、 呋喃唑酮(0.5mg/L和1mg/L)、 四环素(2mg/L和4mg/L)、 利福 平(0.5mg/L和1mg/L)、 替硝唑(4mg/L和8mg/L)、 头孢克肟(0.5mg/L和1mg/L)、 多环西素 (2mg/L和4mg/L)。 培养3天以上, 将底物四甲基苯二胺溶于纯化水中(浓度为1mg/ml), 混匀 配制成底物反应液, 在每个微孔中加入50 l底物反应液, 通常10分钟即可辨别出微孔中的 说明书 3/4 页 5 CN 111454866 A 5 变色情况。 若变蓝色, 说明幽门螺杆菌生长。 若不变色, 证明幽门螺杆菌不生长。 0046 实施例2 0047 本实施例与实施例1的不同之处在于样本的分离、 细菌培养与鉴定的步骤: 0048 通过吞入取样线到胃部, 取样线浸入胃液, 将取样线取出后放入偶联抗体磁微粒 溶液中震荡10分钟后离心, 弃掉上清后, 把磁微粒涂于固体培养基表面, 放入二氧化碳培养 箱中, 培养温度为37, 二氧化碳浓度为10。 3-7天后观察菌落形态: 长出的菌落全部为针 尖水滴样菌落, 半透明状。 对菌落扩增后进行尿素酶、 氧化酶、 过氧化氢酶实验鉴定, 确定幽 门螺杆菌培养成功。 0049 实施例3 0050 本实施例与实施例1的不同之处在于样本的分离、 细菌培养与鉴定的步骤: 0051 通过粪便取样器取少量新鲜粪便, 将粪便提取液与偶联抗体磁微粒溶液混合震荡 10分钟后离心, 弃掉上清后, 把磁微粒涂于固体培养基表面, 放入二氧化碳培养箱中, 培养 温度为37, 二氧化碳浓度为10。 3-7天后观察菌落形态: 长出的菌落全部为针尖水滴样 菌落, 半透明状。 对菌落扩增后进行尿素酶、 氧化酶、 过氧化氢酶实验鉴定, 确定幽门螺杆菌 培养成功。 0052 需要说明的是, 本发明提供的磁微粒溶液用于捕捉样本中的幽门螺杆菌, 其含有 可识别幽门螺杆菌表面抗原的抗体, 抗体通过化学键联的方法偶联于磁微粒表面, 含羧基 的磁微粒通过化学交联剂在交联缓冲液中与抗体的氨基形成酰胺键连接, 获得成功包被抗 体的磁微粒。 0053 抗体用于识别幽门螺杆菌表面抗原, 这些表面抗原包括但不局限于尿素酶、 过氧 化氢酶、 氧化酶等, 可以是通过幽门螺杆菌表面抗原制备的单克隆或多克隆抗体。 0054 本发明提供的包被抗体的磁微粒可以高效捕捉到样本中的活体幽门螺杆菌, 又不 破坏幽门螺杆菌的结构和活性, 利于富集菌量和扩增培养。 0055 目前幽门螺杆菌的耐药情况普遍, 临床上根除幽门螺杆菌的治疗方法是以质子泵 抑制剂、 铋剂为基础的三联或四联疗法, 这两种疗法是得到广泛公认的治疗方案。 治疗幽门 螺杆菌的抗生素一般选择阿莫西林、 克拉霉素、 甲硝唑、 呋喃唑酮、 左氧氟沙星、 四环素等, 但是随着抗生素的广泛应用, 幽门螺杆菌的耐药菌株也逐渐增多, 导致治疗失败。 为了减少 幽门螺杆菌的抗生素耐药率, 建议个体化根除幽门螺杆菌, 其中包括对幽门螺杆菌进行培 养和药敏检测后, 根据药敏结果选择抗生素。 0056 利用本发明提供的方法培养出来的活性幽门螺杆菌可以用于药敏分析和基因分 析等临床应用。 例如, 可以用于多种抗生素(阿莫西林, 克拉霉素, 甲硝唑, 左氧氟沙星, 呋喃 唑酮, 四环素, 利福平、 替硝唑、 头孢克肟、 多西环素)的耐药性测试。 0057 在上述实施例中, 对各个实施例的描述都各有侧重, 某个实施例中没有详细描述 的部分, 可以参见其他实施例的相关描述。 0058 以上所述, 为本发明的具体实施方式, 但本发明的保护范围并不局限于此, 任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内, 可轻易想到各种等效的修改或替 换, 这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。 因此, 本发明的保护范围应以权利 要求的保护范围为准。 说明书 4/4 页 6 CN 111454866 A 6

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