技术领域
本发明涉及银杏内酯B在制备眼科药物中的应用，具体地是涉及银杏内酯B在制备防治 视网膜变性疾病的药物中的应用。
背景技术
随着感染性疾病的控制，视网膜变性性疾病已成为主要致盲眼病之一。据估计，目前世 界上约2×107人患有各种视网膜变性。这类变性性疾病主要受损的是光感受器细胞，而光感 受器细胞被认为是受损后不能再生的神经细胞，故目前尚无理想的治疗方法。
对于视网膜变性性疾病的治疗，目前主要有基因治疗，人工视网膜，视网膜移植，药物 干预等。基因治疗为人类最终治愈视网膜变性性疾病带来了曙光，但基因治疗距离最终临床 应用的道路还很漫长，还存在诸多障碍。一、基因位点多。目前发现被鉴定的人类光感受器 变性基因已经超过80个。二、基因导入良好载体的筛选问题。三、如何提高目的基因转染率 及如何延长表达时间。四、临床应用的安全性。人工视网膜目前仍存在很多问题难以解决。 如视觉系统信息编码的具体机制？电子眼长期存在于体内，是否会发生蜕变失效？视网膜或 视皮层神经细胞是否能忍受其长期刺激，这种刺激是否引起神经细胞形态和功能改变？电子 眼本身及其移植技术是否损害患者残存的周边视力？视网膜移植要推广用于治疗，仍有：排 斥反应、手术并发症、长期疗效、功能重建等许多问题需要进一步研究和探讨。故前三种方 法目前临床较少应用。药物治疗：生长因子和神经营养因子，其不足在于绝大多数的生长因 子口服不能吸收，也无法通过血一眼屏障，其效力在动物体内维持的时间通常只有一个月。 经常性应用眼内注射给药会导致感染、视网膜脱离等并发症。维生素等营养物质临床应用较 多，疗效不显著。近年来关于中医治疗RP的报道较多，且收到较好的效果，但多为病例报 道和回顾性研究，关于其作用机理方面的报道较少，临床推广理论依据不足，此是中医组方 的不足之处。
银杏(Ginkgo biloba L.)系银杏科多年生木本植物，仅一科一属，果、叶均可药用。银 杏叶制剂是当前植物药开发研究的热点之一，其来源于银杏的叶，有效成分主要为银杏内酯 (Ginkgolides)。银杏内酯为萜类化合物，主要成分为银杏内酯A、B、C、M、J和白果内酯， 由于具有高度专属性拮抗血小板活化因子(Platelet-activatingfactor，PAF)的作用而引起国际 医药界的关注，现已临床用于脑血栓、脑缺血、神经系统疾病等病症的治疗。随着对银杏叶 中有效成分的明确，开发银杏类单一有效成分新药成为近十年来国际研究的目标，正在进行 临床实验的银杏内酯类新药主要有：银杏内酯混合物(BN52063)和银杏内酯B纯品 (BN52021)，后者效力大大高于前者。
对神经细胞作用的实验研究由研究表显示：银杏内酯能显著减少小鼠电惊厥休克和脑缺 血及脑损伤后脑组织中游离脂肪酸(FFA)含量及对小鼠脑缺血再灌注期脑组织谷光甘肽过 氧化物酶活性的抑制，同时还能降低沙土鼠脑缺血再灌注90min时前脑和中脑FFA含量， 从而表明银杏内酯对神经细胞的保护作用。季风清等采用胎龄15～17d大鼠的皮层神经细胞 建立缺氧复氧神经元损伤模型，通过观察神经细胞NOS的动态表达，从体外培养细胞水平 研究银杏叶提取物对神经细胞的保护作用。结果发现，银杏叶提取物可通过抑制缺氧复氧过 程中神经细胞的NOS活性，降低NO的产生发挥其保护缺氧所致神经细胞损伤的作用。
吴小梅等对小鼠皮层神经细胞缺氧的保护作用的研究显示，银杏内酯对缺氧损伤的皮层神经 元有明显的保护作用，作用机制可能与其提高神经细胞抗氧化能力、减少自由基的生成，保 护细胞的结构和功能有关。
银杏内酯具有神经元保护和抗细胞凋亡两方面作用，而且银杏叶提取物具有来源方便、 价格低廉、能被机体吸收、容易透过血脑屏障等诸多优点。已临床用于脑血栓、脑缺血、神 经系统疾病等病症的治疗，但尚无视网膜变性疾病方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供银杏内酯B在制备防治视网膜变性疾病的药物中的应用。 作用机理如下：
银杏内酯B能剂量依赖性对抗谷氨酸兴奋性毒性，保护视网膜神经细胞。
银杏内酯B对抗谷氨酸兴奋性毒性这一作用可能是通过竞争血小板活化因子受体阻断 PAF介导的兴奋性神经毒信号传递过程、提升bcl-2表达、降低bax表达和升高视网膜神经 细胞线粒体膜电位来实现的。
银杏内酯B对实验性大鼠视网膜变性所致的大鼠视网膜光感受器细胞损伤和视功能损害 具有保护作用，并且这种作用呈剂量依赖性。
银杏内酯B能抑制N-甲基-N-亚硝脲诱导的视网膜损伤大鼠的光感受器细胞的凋亡。
银杏内酯B能抑制MNU诱导的视网膜损伤大鼠的光感受器细胞的凋亡。其作用机制可 能与上调Bcl-2的表达量，轻度降低Bax表达，提高Bcl-2/Bax比值有关。
银杏内酯B对视网膜变性所致的大鼠视网膜光感受器细胞损伤和视功能损害具有保护作 用，并且这种作用呈剂量依赖性。银杏内酯B在制备防治视网膜变性疾病的药物中的应用， 为视网膜变性疾病提供一种新的、有效的治疗途径。
附图说明
图1是各药物处理组对视网膜神经细胞存活率的影响结果示意图；
图2是流式细胞仪检测不同药物作用组视网膜神经细胞凋亡结果示意图；
图3是各药物处理组视网膜神经细胞内Bcl-2/Bax比值的变化结果示意图；
图4是大鼠视网膜神经细胞Rh123标记像(共聚焦显微镜下400×)结果示意图，其 中图4A：银杏内酯B作用下视网膜神经细胞Rh123标记像；图4B：谷氨酸作用下视网膜 神经细胞Rh123标记像；图4C：左图为60S时加入谷氨酸后视网膜神经细胞Rh123标记 像；右图为继续加入银杏内酯B后视网膜神经细胞Rh123标记像；
图5是银杏内酯B对视网膜神经细胞线粒体Rh123荧光强度影响曲线图；
图6是谷氨酸对视网膜神经细胞线粒体Rh123荧光强度影响曲线图；
图7是银杏内酯B对谷氨酸作用后视网膜神经细胞线粒体Rh123荧光强度的影响曲线 图；
图8是MNU模型对照组与GB(40mg/kg)治疗组不同时段的ERG的结果示意图；
图9是模型组与银杏内酯B(40mg/kg)治疗组不同时间的大鼠视网膜形态(HE×200) 示意图，其中，图9a、b、c分别为模型组3d、5d、7d的大鼠视网膜形态，图9d、e、f分 别为银杏内酯B(40mg/kg)治疗组3d、5d、7d的大鼠视网膜形态；
图10是各组MNU给药后不同时间段中心视网膜的外视网膜厚度比较结果示意图；
图11是TUNEL法检测视网膜细胞凋亡(TUNEL×200)结果示意图；
图12是模型对照组和GB治疗组在不同时间段大鼠视网膜Bcl-2表达水平的变化的结果 示意图；
图13是GB治疗组和模型组不同时间Bcl-2/β-actin的表达量比较结果示意图；
图14是GB治疗组和模型组不同时间Bax/β-actin的表达量比较结果示意图；
图15是GB治疗组和模型组不同时间Bcl-2/Bax比值改变结果示意图。
具体实施方式
实施例1：银杏内酯B对体外培养的大鼠视网膜神经细胞凋亡的影响
材料和方法：
材料：SD(Sprague-Dawley)乳鼠，生后8天，雌雄不拘。银杏内酯B(Ginkgolide B， GB)，广州药检所提供。
方法：1.银杏内酯B抗视网膜神经细胞凋亡作用的体外研究
采用体外原代培养的15d大鼠视网膜神经细胞，共分六组：A组为正常对照组；B组为 谷氨酸模型组；C组为银杏内酯B(50μmol/L)+谷氨酸组；D组为银杏内酯B(100μmol/L) +谷氨酸组；E组为银杏内酯B(50μmol/L)预处理+C组；F组为银杏内酯B(100μmol/L) 预处理+D组。在培养14d时，E、F组分别预先加入银杏内酯B50、100μmol/L培养24h， 然后在15d时与B～D组一起加入相应浓度的银杏内酯B及终浓度为0.8mmol/L谷氨酸，建 立谷氨酸损伤的视网膜神经细胞凋亡模型。用噻唑蓝(MTT)法测定神经细胞存活率，流式 细胞仪观察神经细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达并应用激光共聚焦显微镜 (Confocal)进行线粒体膜电位(MMP)测定。
2.银杏内酯B对视网膜神经细胞线粒体功能的影响
取已制备视网膜神经细胞(含1×106个/ml活细胞)悬液各0.15ml，分别接种于直径35 mm的Petri培养皿(皿底部涂有0.1％多聚赖氨酸)中，静置15min，使细胞紧密粘于培 养皿底部，加入含10％小牛血清的DMEM/F12，37℃，5％CO2培养箱中培养。每3d半 量换液1次，待长至70％融合时(通常在培养后10d时)，将待测细胞用无血清的 DMEM/F12培养液洗3次，加入无血清的DMEM/F12培养液800μl，0.1％罗丹明123(Rh123) 荧光染料2μl标记1h，倾去上清液，用相同培养基清洗1次，加入无血清的DMEM/F12培 养液800μl，用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal)检测，进行荧光强度测定，随机标记视 网膜神经细胞，预扫描待曲线平稳后，进行药物作用测试。
每次随机标记细胞4～6个，共重复实验4次。视网膜神经细胞经预扫描待荧光强度曲 线稳定后，进行药物作用下各视网膜神经细胞荧光强度测定。按如下方法加药，观察时限为 180s。
A组：在60s时，加入终浓度为100μmol/L的银杏内酯B10μl。
B组：在60s时，加入终浓度为2mmol/L的谷氨酸10μl。
C组：在60s时，加入终浓度为2mmol/L的谷氨酸10μl，待图形平稳后加入终浓度为100μmol/L 的银杏内酯B10μl。
根据每组被扫描细胞的荧光强度值进行统计分析。基于Rh123浓度高低与荧光强度成正 比，根据荧光强度即可判断Rh123变化情况。以10S为一间隔，动态记录从0S到180S时 各处理组荧光强度值，比较加药前后荧光强度曲线的变化情况。由于样本和药物作用效应时 程差异，本研究只做实验效应变化趋势的观察。
统计分析：
所有统计学采用SPSS12.0软件包中的单因素方差分析法(ANOVA)对数据进行分析， 结果以平均数±标准差()表示。以P＜0.05表示差别具有显著性意义，P＜0.01表示 差别具有非常显著性意义。
结果
1.MTT法检测银杏内酯B对视网膜神经细胞存活率影响
由图1可见B～D组与A组比较未见显著性差异。F～L组与E(谷氨酸 8mmol/L)组比较均有显著性差异：F、G、H三组和I、J、K三组组间比较有显著性差异 (P＜0.01)，可见GB在10～100μmol/L之间，随浓度增加，细胞存活数增加，具有浓度依 赖性。F与I组间比较P＜0.0 5，G与J，H与K组间比较P＜0.01，可见GB处理组优于 GB预处理组，细胞存活率高。L与K组间比较P＜0.05，可见联合预处理组作用优于单独处 理组。
2.银杏内酯B抗视网膜神经细胞凋亡作用的体外研究
各药物处理组视网膜神经细胞凋亡的百分率比较见表1-1及图1-10。
由表1-1和图2可见：C～F组与B组比较均有显著性差异(P＜0.01)，C和D组间比较 P＜0.01，提示GB能对抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡，此作用具有浓度依赖性。C与 E、D与F组间比较有显著性差异(P＜0.01)，提示在谷氨酸作用于细胞前预先用GB处理 细胞，能明显降低细胞凋亡率。
表1-1各药物处理组视网膜神经细胞凋亡的百分率(％)
组别 样本数(n) 凋亡细胞数(％) A(正常对照组) B(谷氨酸处理组) C(GB50μmol/L处理组) D(GB100μmol/L处理组) E(GB50μmol/L预处理+C组) F(GB100μmol/L预处理+D组) 6 6 6 6 6 6 2.3±0.3 49.6±2.0 27.1±0.6＊＊ 12.9±0.2＊＊ 11.4±0.5＊＊ 8.2±0.3＊＊
注：＊＊与B组比较P＜0.01
各药物作用组视网膜神经细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达及二者的比值比较见表1-2及图3：
表1-2各药物处理组视网膜神经细胞内Bd-2和Bax阳性蛋白表达及其比值的变化(％，n＝6)
组别 Bcl-2蛋白表达(％) Bax蛋白表达(％) Bcl-2/Bax A(正常对照组) B(谷氨酸处理组) C(GB50μmol/L处理组) D(GB100μmol/L处理组) E(GB50μmol/L预处理+C组) F(GB100μmol/L预处理+D组) 2.7±0.2 2.2±0.2 3.6±0.3＊＊ 5.7±0.3＊＊ 8.1±0.2＊＊ 11.1±0.2＊＊ 2.9±0.4 10.4±0.4 7.6±0.4＊＊ 5.3±0.3＊＊ 4.4±0.4＊＊ 3.3±0.3＊＊ 0.95 0.21 0.48＊＊ 1.08＊＊ 1.81＊＊ 3.36＊＊
注：＊＊与B组比较P＜0.01
表1-2及图3显示：GB不同时间及不同剂量作用组与谷氨酸处理组，视网膜神经细胞内 Bcl-2和Bax阳性蛋白表达及二者比值比较均有显著性差异(P＜0.01)。Bcl-2蛋白表达随 GB作用浓度增加而增强，进行GB预处理组，增强显著。Bax蛋白表达则随GB作用浓度 增加而减低，进行GB预处理组，下降显著。二者比值的变化趋势也随GB作用浓度增加而 增大，进行GB预处理组，上升显著。
3.银杏内酯B对视网膜神经细胞线粒体功能的影响
各处理组大鼠视网膜神经细胞Rh123标记像见图14。
图5显示：A组在60s时，加入终浓度为100μmol/L的银杏内酯B10μl，荧光强度曲线 逐渐上移，96S时荧光强度上升为1669.9±5.3，并逐渐开始下降，120S恢复至正常水平， 直到测试结束。
图6显示：B组在60s时，加入终浓度为2mmol/L的谷氨酸10μl，荧光强度曲线逐渐下 移，120S时荧光强度下降为7.4±2.8，并维持此荧光强度直到测试结束。
图7显示：C组在60s时，加入终浓度为2mmol/L的谷氨酸10μl，荧光强度曲线逐渐下 移，80S时荧光强度下降为81.6±3.5，并维持此荧光强度。120S加入终浓度为100μmol/L 的银杏内酯B10μl，荧光强度曲线逐渐上移，130S时荧光强度上升为784.6±5.2，并维持此 荧光强度直到测试结束。
本研究结果显示，单独使用银杏内酯B对培养细胞无明显影响。只有在加入谷氨酸处理 后，才能对神经细胞有明显的保护作用。这间接表明PAF可能作为第二信使之一参与了谷氨 酸诱导视网膜神经细胞损伤的信号传递过程。银杏内酯B具有高度专属性拮抗PAF的作用， 它可能通过竞争PAF受体阻断PAF介导的兴奋性神经毒信号传递过程，从而提供神经保护 作用。
实验显示：加入谷氨酸后大鼠视网膜神经细胞发生超极化，MMP(线粒体膜电位)下 降；加入GB，细胞迅速去极化，MMP上升，随后恢复至正常水平。加入谷氨酸后，再加入 GB，可以使MMP回升，提示GB能对抗谷氨酸兴奋性毒性保护视网膜神经细胞，这一作用 可能通过升高视网膜神经细胞MMP，从而影响线粒体功能来实现。
综上所述，GB能剂量依赖性对抗谷氨酸兴奋性毒性保护视网膜神经细胞，这一作用可 能是通过竞争PAF受体阻断PAF介导的兴奋性神经毒信号传递过程、提升bcl-2表达、降低 bax表达和升高视网膜神经细胞MMP来实现的。
实施例2：银杏内酯B对MNU诱导的大鼠视网膜变性的保护作用
实验动物和试剂
SD大鼠84只，生后46天，雌雄不拘。全部动物饲养在标准鼠笼内，维持12h白昼， 12h夜晚的时间周期。银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)广州市药检所提供，临用前用生理 盐水溶解、稀释至所需质量浓度。
方法
取生后46天的SD大鼠86只，随机抽取6只为正常对照组(A组)；余下80只为实验组， 又随机分为4大组，每组20只，其中B组：模型对照组(腹腔注射MNU 40mg/kg)，C组： 银杏内酯B大剂量组(腹腔注射GB 60mg/kg)，D：银杏内酯B中剂量组(腹腔注射GB 40mg/kg)，E：银杏内酯B小剂量组(腹腔注射GB 20mg/kg)。上述大鼠从生后46天开始 胃给药，银杏内酯B治疗组给予相应剂量的GB，模型对照组给等量生理盐水，每日1次， 连续7日。第50天模型对照组及银杏内酯B治疗组均一次性腹腔注射MNU 40mg/kg，建立 大鼠视网膜变性模型。各组每次4只分别于24h、48h、3d、5d、7d行右眼闪光ERG检查， 并于腹腔注射MNU后3d、5d、7d处死动物，取眼球做病理切片。
统计分析
所有统计学采用SPSS12.0软件包中的单因素方差分析法(ANOVA)对数据进行分析， 结果以平均数±标准差()表示。以P＜0.05表示差别具有显著性意义，P＜0.01表示差 别具有非常显著性意义。
结果
1.视网膜电图检测
各组ERGa、b波振幅的变化见表3-1，3-2，图8所示：
正常对照组大鼠ERG波形清晰，a波振幅为105.4±16.8μV，a波潜伏期为22.8±1.3ms； b波振幅为292.6±19.6μV，b波潜伏期为38.8±3.7ms。模型对照组MNU40mg/kg处理24h 后，a波消失，72hb ERG呈熄灭型。
GB(20mg/kg)治疗组在MNU40mg/kg处理2d后，a波消失，b波振幅下降为正常的 32％；3d时，其中2只大鼠ERG呈熄灭型，另2只b波振幅下降为正常的8％；5d ERG 呈熄灭型。
GB(40mg/kg)治疗组在MNU40mg/kg处理3d后，a波消失，b波振幅下降为正常 的22％；5d时，其中1只大鼠ERG呈熄灭型，另3只b波振幅下降为正常的14％；7d ERG 呈熄灭型。
GB(60mg/kg)治疗组在MNU40mg/kg处理3d后，a波消失，b波振幅下降为正常 的20％；5d时，b波振幅下降为正常的14％；7d时b波振幅下降为正常的8％。
表3-2各组MNU造模后不同时间段ERGb波振幅(μm，n＝8)
组别 b波振幅 1d 2d 3d 5d 7d 正常对照组 模型组(MNU40mg/kg) GB(20mg/kg)治疗组 GB(40mg/kg)治疗组 GB(60mg/kg)治疗组 309.6±49.0 121.8±27.4 146.6±35.2 262.4±16.4 265.4±37.8 56.3±9.4 99.8±19.9 157.6±25.0 145.1±25.8 0 25.0±27.5 67.2±11.5 60.9±14.1 0 0 42.2±28.3 42.2±16.3 0 0 0 25.0±27. 5
2.视网膜形态的变化
我们以中心视网膜(与视神经相邻)为观察对象观察各处理组视网膜形态的变化，如图 9示：模型对照组的大鼠视网膜在处理后第3d光感受器细胞大量破坏，外核层明显变薄 (3-2a)，5d光感受器细胞明显减少，外核层剩下2～4层(3-2b)；7d后光感受器细胞层消 失，但仍有少量外核层(3-2c)。
GB(40mg/kg)治疗组MNU40mg/kg给药后3d，可见光感受器细胞轻度破坏，外核层 轻度变薄(3-2d)；第5d，未见明显变化(3-2e)，7d后光感受器细胞大量破坏，外核层明 显变薄，约4～5层(3-2f)。
模型对照组和GB治疗组各时间段外视网膜厚度比较见表3-3，可见GB小、中、大剂量 治疗组与模型组比较均可见显著性差异(P＜0.01)。且GB治疗组三组间比较均有显著性差异 (P＜0.01)，可见给药剂量在20～60mg/kg间，呈剂量依赖性。
研究表明：正常组大鼠中心视网膜的外视网膜厚度为98.4±1.8μm。MNU处理7天B 组外视网膜厚度为17.8±2.1μm，而GB小、中、大剂量组分别为25.2±2.7μm、38.3±2.3μm、 45.8±2.3μm，与模型组外视网膜厚度比较均可见显著性差异(P＜0.01)。且三组间比较具有 显著性差异(P＜0.01)，提示GB对MNU引起的中心视网膜损伤有一定的保护作用；给药 剂量在20～60mg/kg间，呈剂量依赖性。
综上所述，银杏内酯B对MNU诱导的实验性大鼠视网膜变性所致的大鼠视网膜光感受 器细胞损伤和视功能损害具有保护作用，并且这种作用呈剂量依赖性。
表3-3各组给药后不同时间中心视网膜的外视网膜厚度(μm，n＝6)
组别 外视网膜厚度(μm) 3d 5d 7d 正常对照组 模型组(MNU40mg/kg) GB(20mg/kg)治疗组 GB(40mg/kg)治疗组 GB(60mg/kg)治疗组 98.4±1.8 57.8±2.9 64.7±1.7＊＊ 70.7±2.1＊＊ 79.8±1.9＊＊ 42.0±2.7 50.0±2.0＊＊ 59.4±2.0＊＊ 65.9±2.6＊＊ 17.8±2.1 25.2±2.7＊＊ 38.3±2.3＊＊ 45.8±2.3＊＊
注：＊＊与模型组(MNU 40mg/kg)比较P＜0.01
实施例3：银杏内酯B对MNU诱导的大鼠视网膜变性的保护作用机制的研究 材料：
SD大鼠26只，出生后46天，雌雄不拘，由中山大学实验动物中心提供，许可证号粤 监证字2004A089。主要药物和试剂：银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)，广州市药检所提供。
方法：
出生后46天的SD大鼠26只，随机分为A：正常对照组；B：模型对照组；C：GB治 疗组，A组6只，其余两组各10只。GB治疗组于生后46天GB40mg/kg灌胃给药，模型 对照组给等量生理盐水灌胃，每日一次，连续灌服7日，并于生后第50天将2组分别按体 重一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠视网膜变性模型。各组每次2只分别于腹腔注射 MNU后24h、48h、3d、5d、7d处死动物，取1只大鼠眼球做病理切片，TUNEL检测细 胞凋亡同时行免疫组织化学染色观察视网膜Bcl-2和Bax的表达；另1只分离出视网膜提取 RNA，RT-PCR检测视网膜Bcl-2和Bax的表达水平。
统计分析：
所有统计学采用SPSS12.0软件包中的单因素方差分析法(ANOVA)对数据进行分析， 结果以平均数±标准差()表示。以P＜0.05表示差别具有显著性意义，P＜0.01表示 差别具有非常显著性意义。
结果：
1.TUNEL检测大鼠视网膜的凋亡(图11)
正常组大鼠视网膜内未见凋亡细胞核。模型对照组MNU作用1d，视网膜外核层出现 TUNEL阳性细胞核，2d时大量增多，达高峰，随后逐渐减少，5d时仍见少量TUNEL阳性 细胞核。GB40mg/kg治疗组与模型组比较外核层细胞凋亡指数有显著性差异(P＜0.01)(见 表4-1)。GB40mg/kg治疗组在MNU造模后5d时未见TUNEL阳性细胞核。
表4-1各组大鼠视网膜外核层细胞凋亡指数(％)
组别 眼数 外核层细胞凋亡指数(％) 1d 2d 3d 5d 7d 正常对照组 模型对照组 GB治疗组 6 6 6 0 22.4±5.3 14.0±5.6＊＊ 38.8±3.5 25.5±5.0＊＊ 14.0±5.6 7.9±2.8＊＊ 6.8±4.3 0＊＊ 0 0
＊＊与模型组比较P＜0.01
2.RT-PCR检测视网膜Bcl-2和Bax的表达水平
治疗组及模型对照组Bcl-2、Bax和内参照β-actin mRNA的表达情况见图4-2，其中，A： 正常对照组；B：GB40mg/kg治疗后12h；C：GB40mg/kg治疗后1d；D：GB40mg/kg 治疗后2d；E：GB40mg/kg治疗后3d；F：GB40mg/kg治疗后5d；G：模型对照组12h； H：模型对照组1d；I：模型对照组2d；J：模型对照组3d；K：模型对照组5d。根据条 带的积分光密度值(OPTDI)，计算各组Bcl-2、Bax mRNA相对于β-actin mRNA表达量随 时间的变化情况见表4-2，4-3，图4-3，44：
表4-2各组不同时间视网膜Bcl-2mRNA相对于β-actin mRNA的表达量 (Bcl-2/β-actin，n＝3)
组别 MNU给药后不同时间
12h 1d 2d 3d 5d 正常对照 组 GB治疗组 模型对照 组 0.44±0.08 0.98±0.07 0.39±0.09 1.19±0.26 0.14±0.08 0.81±0.18 0.61±0.11 0.48±0.11 0.71±0.12 0.67±0.18 0.81±0.19
如图13所示，正常对照组可检测到Bcl-2mRNA的表达。模型对照组在MNU作用后 12h视网膜中Bcl-2mRNA表达量下降，第1d降至最低，表达量约低至正常的1/4，此后开 始回升。GB治疗组在MNU处理12h时，Bcl-2mRNA的表达升高高于正常的2倍，24h时 达到最高，此后渐下降，第3d降低最显著，第5d时又开始回升。
如图14所示，正常组可检测到Bax mRNA的表达。模型组MNU腹腔注射后12h视网 膜中Bcl-2mRNA表达量上升，第2d升至最高，表达量约至正常的9倍，此后开始下降， 第5d时仍为正常的5倍。GB治疗组在MNU处理12h时，Bax mRNA的表达升高，高于正 常，2d升至最高，表达量约至正常的6倍，此后渐下降，第5d时仍为正常的4倍。
Bcl-2/Bax比值(图15)：模型对照组12h降为0.36，1d降至0.15，2d上升为0.29， 3d和5d分别为0.42和0.64。GB治疗组在MNU处理12h、1d、2d、3d、5d时，Bcl-2/Bax 比值分别为0.98、0.92、0.53、0.45、0.68，高于模型组。
3.免疫组织化学染色(见表4-4)
正常对照组视网膜各层均未见Bcl-2和Bax阳性表达。模型对照组1d后，视网膜外核层 可见Bax阳性表达，2d时表达最强，此后逐渐表达减弱，5d时仍有少量阳性表达。MNU处 理组各时间点均未见视网膜Bcl-2阳性表达。
GB治疗组Bcl-2在1d表达最强，2d阳性表达下降，3d后阳性表达消失。Bax在2d表 达最强，3d阳性表达下降，5d后仍有阳性表达。
表4-4模型组和治疗组不同时间视网膜Bcl-2和Bax的表达(n＝6)
组别 MNU给药后不同时间
1d 2d 3d 5d 模型对照组 Bcl-2 Bax GB治疗组 Bcl-2 Bax 0 20.1±3.2 30.5±3.4 15.5±2.4 0 38.6±3.4 16.1±2.3 23.8±2.9 0 25.8±2.9 0 10.2±1.9 0 13.2±2.2 0 6.2±1.5
结果显示：正常对照组大鼠视网膜内未见凋亡细胞核。模型对照组1d时，视网膜外核层 出现TUNEL阳性细胞核，2d时大量增多，达高峰，随后逐渐减少，5d时仍见少量TUNEL 阳性细胞核。GB40mg/kg治疗组与模型组比较外核层细胞凋亡指数有显著性差异(P＜0.01) GB40mg/kg治疗组在MNU造模后5d时未见TUNEL阳性细胞核。提示GB能抑制MNU诱 导的视网膜损伤大鼠的光感受器细胞的凋亡。
RT-PCR和免疫组织化学两种方法结果显示，Bcl-2和Bax的表达的趋势在两种方法中 具有一致性。
RT-PCR结果显示：模型对照组在MNU处理12h视网膜中Bcl-2mRNA表达量下降， 第1d降至最低，表达量约低至正常的1/4，此后开始回升。GB治疗组在MNU处理12h时， Bcl-2mRNA的表达升高高于正常的2倍，1天时达到最高，此后渐下降，第3天降低最显 著，第5天时又开始回升。
模型对照组腹腔注射MNU后12h视网膜中Bcl-2mRNA表达量上升，第2d升至最高， 表达量约至正常的9倍，此后开始下降，第5天时仍为正常的5倍。GB治疗组在MNU处 理12h时，Bax mRNA的表达升高，高于正常，2d升至最高，表达量约至正常的6倍，此 后渐下降，第5天时仍为正常的4倍。
Bcl-2/Bax比值：MNU腹腔注射后12h降为0.36，1d降至0.15，2d上升为0.29，3d 和5d分别为0.42和0.64。GB治疗组在MNU处理12h、1d、2d、3d、5d时，Bcl-2/Bax 比值分别为0.98、0.92、0.53、0.45、0.68，高于模型组。
免疫组织化学分析可见GB治疗组Bcl-2阳性表达在MNU给药后1d表达最强，2d阳 性表达下降，3d后阳性表达消失。模型组未见视网膜Bcl-2阳性表达。Bax在MNU给药后 2d表达最强，3d阳性表达下降，5d后仍有阳性表达。与模型组比较明显减低。提示银杏内 酯B抑制视网膜光感受器细胞发生凋亡的机制可能与上调Bcl-2的表达量，轻度降低Bax表 达，提高Bcl-2/Bax比值有关。
1)GB能剂量依赖性对抗谷氨酸兴奋性毒性，保护视网膜神经细胞。且在GB与谷氨酸共同 作用前，对视网膜神经细胞给予GB预处理，较单独作用效果更佳。
2)GB对抗谷氨酸兴奋性毒性这一作用可能是通过竞争PAF受体阻断PAF介导的兴奋性神 经毒信号传递过程、提升bcl-2表达、降低bax表达和升高视网膜神经细胞MMP来实现 的。
3)MNU可选择性地诱导视网膜光感受器细胞发生凋亡，引起视网膜电图的改变，作用呈剂 量和时间依赖性。作用机制可能与上调Bax和Caspase-3表达有关。
4)MNU诱导的大鼠视网膜变性模型操作简单、重复性好，是研究药物对活体光感受器细胞 凋亡抑制作用较好的模型；制作模型的最佳剂量为40mg/kg。
5)GB对MNU诱导的实验性大鼠视网膜变性所致的大鼠视网膜光感受器细胞损伤和视功能 损害具有保护作用，并且这种作用呈剂量依赖性。
6)GB能抑制MNU诱导的视网膜损伤大鼠的光感受器细胞的凋亡。其作用机制可能与上调 Bcl-2的表达量，轻度降低Bax表达，提高Bcl-2/Bax比值有关。