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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811041119.8 (22)申请日 2018.09.04 (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗1号 申请人 南京福斯弗瑞生物科技有限公司 (72)发明人 陆兆新孙静别小妹吕凤霞 赵海珍李金良 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 程斯佳 (51)Int.Cl. C12N 15/75(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/125(200。
2、6.01) (54)发明名称 通 过 过 表 达 c o m A 基 因 提 高 抗 真 菌 肽 bacillomycin D产量的方法 (57)摘要 本发明涉及通过过表达comA基因提高抗真 菌肽bacillomycinD产量的方法， 属于生物技术 领域。 本方法首先以CGMCCNo.0943枯草芽孢杆 菌fmbJ为出发菌株， 以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌 穿梭克隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达 载体pCBS-LPComAR， 利用同源重组原理， 通过双 交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ 基因组 com A基因的 方法 构建 了一 个高 产 bacillomycinD菌株， 命。
3、名为fmbJcomA。 经过高 效液相色谱分析， 确定改良菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。 权利要求书2页 说明书6页 序列表2页 附图4页 CN 109136250 A 2019.01.04 CN 109136250 A 1.通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法， 包括以下步骤： (1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建 设计引物ComA-F和ComA-R， 以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ 基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA。
4、基因657bp； 设计引物PamyJ-F和PamyJ-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI 和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片段349bp； 设计引物L-amy-F和L-amy-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI 和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段1012bp； 扩增得到的三个基因片段分别克隆至pMD19-T载体， 转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a， 经验证、 测序正确后， 分别命名为pComA-T、 pPamyJ-T、 pLamy-T， 于-20条件下 保存备用； pCom。
5、A-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段， 与经过相同双酶切处理的pMAD载体， 用 T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-ComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备用； pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段， 与经过相同双酶切处理的pCBS-ComA 载体， 用T4DNA连接酶连接， 构建pCBS-PComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备 用； pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段， 与经过SalI和BamHI双酶切处理的 pCBS-PComA载体， 利用BglII和BamHI为同尾酶的原因， 消除载体上的Ba。
6、mHI酶切位点， 用 T4DNA连接酶连接， 构建pCBS-LPComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备用； 设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增 带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段952bp以及pCBS-LPComA载体的部分 片段30bp， 与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS-LPComA载体， 用同源重组酶连接， 构建 pCBS-LPComAR载体， 酶切验证正确后， 转化大肠杆菌JM110， 用于进一步的电转化； (2)过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株的获得 以枯草芽孢杆菌。
7、fmbJ制备感受态细胞， 采用电转化方法， 将获得的comA基因过表达载 体pCBS-LPComAR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ， 在基因组淀粉酶位点发生双交换， 在红霉素抗 性的LB平板上不长， 但在无抗性的LB平板能够生长， 且PCR验证出现PamyJ+comA的基因片 段， 此时获得的菌株即为过表达comA的菌株， 命名为fmbJcomA； 该菌株既包括的原本基因组 权利要求书 1/2 页 2 CN 109136250 A 2 上的comA基因， 且在淀粉酶位点处插入了同样的comA基因， 成为过表达comA基因菌株， 即为 所得到的提高抗菌肽bacillomycin D产量的菌株。 2.。
8、权利要求1所述方法获得的过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA。 3.权利要求2所述过表达comA基因菌株fmbJcomA的应用。 4.权利要求2所述过表达comA基因菌株fmbJcomA在生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽 bacillomycin D中的应用。 5.权利要求2所述过表达comA基因菌株fmbJcomA生产的枯草芽孢杆菌抗菌脂肽 bacillomycin D相关的产品。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109136250 A 3 通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的 方法 一、 技术领域 0001 本发明通过过表达comA基因提高抗真菌肽b。
9、acillomycin D产量的方法， 具体涉及 通过过表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽bacillomycin D产量的方法， 属于生物技术 领域。 二、 背景技术 0002 作为促进植物生长的根际微生物， 芽孢杆菌属在可持续农业方面显示出光明的前 景。 它们不仅能分泌促进植物生长的物质， 还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物。 0003 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ是一种可以分泌bacillomycin D、 surfactin、 fengycin等抗菌脂肽物质的芽孢杆菌。 其中， bacillomycin D属于iturin家族 成员， 是通过非核糖。
10、体多肽合成酶催化形成的由一个14-17个C的 -氨基脂肪酸和7个氨基 酸缩合而成的环状脂肽结构。 它对黄曲霉、 赭曲霉以及禾谷镰刀菌等具有很强的抑制作用。 其中， 真菌毒素是霉变食品的最大危害， 严重威胁人类健康。 而化学合成防腐剂具有食品安 全的风险， 研究和开发新的天然安全的农产品保鲜剂在保障粮食和食品安全以及防治真菌 污染等方面具有重要的意义。 但实际中， 其并未在可持续农业以及环境保护中广泛应用， 究 其原因， 是由于它的生产成本高， 因此， 提高其产量便成为降低其生产成本的关键问题。 0004 目前， 国内外研究成果显示， 提高bacillomycin D产量的方法主要是筛选优良菌 。
11、株， 以及优化其发酵条件， 而很少采用分子生物学手段对菌种进行改良的方法来提高 bacillomycin D产量。 但随着对抗菌肽合成分泌机制研究的日益深入， 已经逐渐开始采用 分子生物学技术， 通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良， 从 而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。 0005 ComA基因(Gene ID:5462124)的表达产物是双组份调控系统中的ComA调控蛋白。 这个系统涉及磷酸化以及DNA结合活性， 在抗菌物质的形成中发挥着重要的作用， 相关研究 表明， ComA调控蛋白对于抗菌物质的合成具有一定的促进作用。 0006 本方法首先以枯草芽孢杆菌fmbJ为出。
12、发菌株， 以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克 隆载体pMAD为骨架构建一个基因过表达载体pCBS-LPComAR， 利用同源重组原理， 通过双交 换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组comA基因的方法构建了一个高产 bacillomycin D菌株fmbJcomA。 三、 发明内容 0007 技术问题 0008 本发明的目的是利用分子生物学技术， 构建comA基因过表达载体， 经过电转化通 过同源重组在淀粉酶位点将枯草芽孢杆菌fmbJ基因组中comA基因敲入， 从而构建一种高产 抗菌肽bacillomycin D的枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA的方法。 0009 技术方案 说明书 1。
13、/6 页 4 CN 109136250 A 4 0010 1、 通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法， 其特征在于： 0011 (1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建 0012 根据枯草芽孢杆菌comA基因设计引物ComA-F和ComA-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因 组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因(657bp)； 根据枯草芽孢 杆菌淀粉酶的启动子设计引物PamyJ-F和PamyJ-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板 PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动。
14、子基因片段(349bp)； 根据枯草芽 孢杆菌淀粉酶基因设计引物L-amy-F和L-amy-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR 扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(1012bp)； 扩增得到的三个基 因片段分别克隆至pMD19-T载体， 转化大肠杆菌DH5a， 经酶切验证、 测序正确后， 分别命名为 pComA-T、 pPamyJ-T、 pLamy-T， 于-20条件下保存备用； 0013 0014 PCR扩增体系如下： 0015 0016 PCR程序为953min； 35个循环： 9530s， 5530s， 721min； 7210min； 0。
15、017 pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段， 与经过相同双酶切处理的pMAD载 体， 用T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-ComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备用； 0018 pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段， 与经过相同双酶切处理的pCBS- ComA载体， 用T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-PComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保 存备用； 0019 pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段， 与经过SalI和BamHI双酶切处理 的pCBS-PComA载体， 利用BglII和Bam。
16、HI为同尾酶的原理， 消除载体上的BamHI酶切位点， 用 T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-LPComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备用； 0020 设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR 扩增带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因片段(952bp)以及pCBS-LPComA载体 的部分片段(30bp)， 与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS-LPComA载体， 用同源重组酶连 接， 构建pCBS-LPComAR载体， 酶切验证正确后， 转化大肠杆菌JM110， 用于进一步的电转化。 说明。
17、书 2/6 页 5 CN 109136250 A 5 0021 0022 2)过表达comA基因枯草芽孢杆菌菌株的获得 0023 以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株制备感受态细胞， 采用电转化方法， 将获得的 comA基因过表达载体pCBS-LPComAR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ， 在基因组淀粉酶位点发生双 交换， 在红霉素抗性的LB平板上不长， 但在无抗性的LB平板能够生长， 且PCR验证出现PamyJ +comA的基因片段， 此时获得的菌株即为过表达comA的菌株， 命名为fmbJcomA， 该菌株既包 括的原本基因组上的comA基因， 且在淀粉酶位点处插入了同样的comA基因， 成为过表。
18、达 comA基因的突变菌株， 即为所得到的菌株。 0024 以上所述过表达comA基因的枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA可以在生产抗菌脂肽中 应用， 生产抗菌脂肽bacillomycin D产品。 0025 有益效果 0026 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不仅能分泌促进植物生长的物质， 还能产生 许多具有抗菌活性的次级代谢产物， 其中抗菌肽占主导地位。 由于它具有广泛的抗菌活性、 生物可降解性以及毒性低等特点， 因此， 愈来愈受到人们的重视。 特别针对目前农药残留、 化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响， 研究天然的抗菌物质对农产品安全生产 具有重要的现实意义。 0。
19、027 国内外针对抗菌肽的发酵工艺和分离技术开展了大量的研究。 虽然通过发酵工艺 的优化能够在一定程度上提高抗菌肽的生产水平， 但发酵产量仍然是大规模工业化生产的 难题。 因此， 在分子生物学水平上， 采用基因工程技术对菌种进行定向改造将成为一种提高 抗菌肽产量的新手段。 0028 本发明通过分子生物学技术， 成功构建一株高产bacillomycin D菌株fmbJcomA。 与原始菌株fmbJ相比， 经过菌种改良的菌株fmbJcomA合成分泌bacillomycin D能力大幅度 提高， 产量从218.321.8mg/L提高到386.615.7mg/L， 提高了1.77倍。 此外， 该发明还。
20、揭 示了ComA调控蛋白对bacillomycin D合成分泌有促进作用， 可以通过这种方法， 利用pCBS- LPComAR载体对任何枯草芽孢杆菌进行基因改良， 以获得相应的改良菌种， 达到提高抗菌肽 产量的目的。 四、 附图说明 0029 图1.技术方案； 0030 图A基因过表达载体的构建； 0031 图A基因过表达菌株的构建； 0032 图A基因过表达菌株的PCR验证。 五、 具体实施方式 0033 本发明首先构建comA基因过表达载体pCBS-LPComAR， 经过电转化将pCBS-LPComAR 说明书 3/6 页 6 CN 109136250 A 6 载体转化入枯草芽孢杆菌(Ba。
21、cillus subtilis)fmbJ(公知公用， 中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， CGMCC No.0943)， 经过同源重组双交换过程在其基因组内淀粉酶 基因位点插入带有启动子的comA基因， 达到过表达comA基因的目的， 从而构建一株高产抗 菌肽的枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA。 通过PCR方法对突变菌株进行鉴定； 利用高效液相色谱 (HPLC)分析改良菌株bacillomycin D的产量。 具体实施方式如下： 0034 (1)comA基因过表达载体pCBS-LPComAR的构建 0035 根据枯草芽孢杆菌comA基因(Gene ID:5462124)设计引物Co。
22、mA-F和ComA-R， 以枯 草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有酶切位点KpnI和NcoI的完整的comA基因 (657bp)； 根据枯草芽孢杆菌淀粉酶的启动子设计引物PamyJ-F和PamyJ-R， 以枯草芽孢杆菌 fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和KpnI酶切位点的完整fmbJ淀粉酶启动子基因片 段(349bp)； 根据枯草芽孢杆菌淀粉酶基因设计引物L-amy-F和L-amy-R， 以枯草芽孢杆菌 fmbJ基因组DNA为模板PCR扩增带有SalI和BglII酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因(Gene ID:5462160)片段(1012bp)； 扩增得到的。
23、三个基因分别克隆至pMD19-T载体(购自Takara公 司)， 转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司)， 经酶切验证、 测序正确后， 分 别命名为pComA-T、 pPamyJ-T、 pLamy-T， 于-20条件下保存备用； 0036 0037 PCR扩增体系如下： 0038 0039 PCR程序为953min； 35个循环： 9530s， 5530s， 721min； 7210min； 0040 pComA-T用KpnI和NcoI双酶切后获得comA片段， 与经过相同双酶切处理的pMAD载 体(Rita Kamar,Agns Rjasse,Isabelle Jhanno,。
24、Zaynoun Attieh,Pascal Courtin, Marie-Pierre Chapot-Chartier,Christina Nielsen-Leroux,Didier Lereclus,Laure el Chamy,Mireille Kallassy and Vincent Sanchis-Borja ,DltX of Bacillus thuringiensis Is Essential for D-Alanylation of Teichoic Acids and Resistance to Antimicrobial Response in Insects,Frontie。
25、r in Microbiology,2017,8:doi: 10.3389/fmicb.2017.01437)， 用T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-ComA载体， 酶切验证正确后 于-20条件下保存备用； 0041 pPamyJ-T用SalI和KpnI双酶切后获得PamyJ片段， 与经过相同双酶切处理的pCBS- ComA载体， 用T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-PComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保 说明书 4/6 页 7 CN 109136250 A 7 存备用； 0042 pLamy-T用SalI和BglII双酶切后获得Lamy片段， 与经过SalI和BamHI。
26、双酶切处理 的pCBS-PComA载体， 利用BglII和BamHI为同尾酶的原因， 消除载体上的BamHI酶切位点， 用 T4 DNA连接酶连接， 构建pCBS-LPComA载体， 酶切验证正确后于-20条件下保存备用； 0043 设计同源重组引物R-amy-F和R-amy-R， 以枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DNA为模板PCR 扩增带有BglII和NcoI酶切位点的部分fmbJ淀粉酶基因(Gene ID:5462160)片段(952bp)以 及pCBS-LPComA载体的部分片段(30bp)， 与经过BglII和NcoI双酶切处理的pCBS-LPComA载 体， 用同源重组酶(购自南京诺唯赞。
27、生物科技有限公司， 产品编号C112)连接， 构建pCBS- LPComAR载体， 酶切验证正确后， 转化大肠杆菌JM110(购自北京全式金生物技术有限公司)， 用于进一步的电转化。 0044 0045 (2)过表达comA基因菌株的构建 0046 以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株制备感受态细胞， 采用电转化方法， 将获得的 comA基因过表达载体pCBS-LPComAR转化入枯草芽孢杆菌fmbJ， 在基因组淀粉酶位点发生双 交换， 在红霉素抗性的LB平板上不长， 但在无抗性的LB平板能够生长， 且PCR验证出现PamyJ +comA的基因片段， 此时获得的菌株即为过表达comA的菌株， 命名。
28、为fmbJcomA； 该菌株既包 括的原本基因组上的comA基因， 且在淀粉酶位点处插入了同样的comA基因， 成为过表达 comA基因的突变菌株， 即为所得到的菌株。 0047 (3)过表达comA基因菌株的分子验证 0048 对枯草芽孢杆菌fmbJcomA突变菌是否过表达comA基因进行分子验证。 由于在菌株 的淀粉酶基因位点插入淀粉酶的启动子以及comA基因， 所以我们采用已设计的淀粉酶启动 子的上游引物PamyJ-F以及comA基因的下游引物ComA-R， 以经抗性平板与非抗性平板共同 筛选得到的枯草芽孢杆菌fmbJcomA基因组DNA为模板进行PCR扩增， 扩增出与预期结果大小 一致。
29、的产物(图4， 第1， 2泳道)。 经过分子生物学验证， 我们确实得到了过表达comA基因的改 良枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA。 0049 (4)改良枯草芽孢杆菌菌株fmbJcomA抗菌脂肽bacillomycin D产量HPLC分析 0050 将枯草芽孢杆菌fmbJcomA种子液以5浓度接种于Landy发酵培养基中， 在33， 180rpm下培养72h， 得抗菌物质发酵液。 发酵液5000g离心20min去除菌体， 用6M HCl将上清 液调节到pH 2， 然后-4静置过夜， 8000g离心收集沉淀， 加入甲醇后用NaOH中和至pH 7， 获 得抗菌肽粗提物。 0051 经过HPLC的分。
30、析， 与原始菌株fmbJ相比， 改良菌株fmbJcomA中bacillomycin D产 量从218.3mg/L提高到386.6mg/L， 提高了1.77倍。 说明书 5/6 页 8 CN 109136250 A 8 0052 说明书 6/6 页 9 CN 109136250 A 9 序列表 南京农业大学 南京福斯弗瑞生物科技有限公司 通过过表达comA基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法 2018-08-24 8 SIPOSequenceListing 1.0 1 26 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 。
31、1 ggtaccatga aaaagatact agtgat 26 2 26 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 2 ccatggttat agtacgttat ctgact 26 3 24 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 3 gtcgactggt ggtttctttt tttg 24 4 22 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 4 ggtaccagtt tcagcgtttg ca 22。
32、 5 24 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 5 gtcgactcgt ttaggctggg cagt 24 6 序列表 1/2 页 10 CN 109136250 A 10 26 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 6 agatctttaa tgcggaagat aaccat 26 7 47 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 7 acacattaac tagacagatc tatgttt。
33、aaa aaacgattca aaacctc 47 8 44 DNA 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 8 gataacgtac tataaccatg gtggcatacg tatcatgtga ttcc 44 序列表 2/2 页 11 CN 109136250 A 11 图1 说明书附图 1/4 页 12 CN 109136250 A 12 图2 说明书附图 2/4 页 13 CN 109136250 A 13 图3 说明书附图 3/4 页 14 CN 109136250 A 14 图4 说明书附图 4/4 页 15 CN 109136250 A 15 。