一种从南极磷虾中纯化制备2,6二叔丁基对甲酚的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610565552.6 (22)申请日 2016.07.18 (71)申请人 山东师范大学 地址 250014 山东省济南市历下区文化东 路88号 (72)发明人 马善利刘代成 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 董洁 (51)Int.Cl. C07C 37/70(2006.01) C07C 37/82(2006.01) C07C 39/06(2006.01) G01N 30/02(2006.01) G01N 30/90(2006.01。

2、) (54)发明名称 一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基 对甲酚的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从南极磷虾中纯化制备 2,6-二叔丁基对甲酚的方法， 通过薄层层析刮板 法制备含有2,6-二叔丁基对甲酚的粗样品。 将标 准品与粗样品进行高效液相色谱分析， 根据保留 时间确定粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚， 但 同时也发现部分杂质， 为了得到纯度更高的样 品， 采用制备型色谱柱进一步分离纯化， 得到了 纯度更高的样品， 纯度为96.05%。 本发明所述方 法操作简单、 结果准确、 可靠、 稳定， 样品纯度高， 是一种良好的纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的 方法。 权利要求书1页 说。

3、明书6页 附图4页 CN 106187705 A 2016.12.07 CN 106187705 A 1.一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法， 其特征是， 包括以下工序： 制备粗体物的工序： 将南极磷虾与甲醇接触而进行提取， 得到2,6-二叔丁基对甲酚粗 提物； 第一次纯化工序： 该工序采用薄层层析刮板法对2,6-二叔丁基对甲酚粗提物进行纯 化， 得到2,6-二叔丁基对甲酚粗样品； 其中， 所述薄层层析中以体积比石油醚： 乙酸乙酯： 正 己烷4-5:1-2:0.5-1为展开剂； 定性工序： 该工序采用分析型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行定性 分析， 根据保留。

4、时间确定所述第一次纯化工序的粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚； 第二次纯化工序： 该工序采用制备型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进 行分离纯化， 得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚样品。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述制备粗提物的工序中， 所述提取方法采用 超声波提取， 超声波提取条件为： 室温、 300-400W、 20-或40kHz、 提取10-20分钟， 优选的， 所 述超声波提取条件为： 20-40、 350W、 40kHz、 提取15分钟。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述第一次纯化工序中， 选取高效薄层硅胶板H 板， 展距为810cm；。

5、 染色采用氯化铁水溶液进行染色， 100110烘烤5-10分钟， 优选的， 所述氯化铁水溶液的质量分数为46； 洗脱时采用甲醇进行溶解。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述定性工序和第二次纯化工序中， 所述高效 液相色谱法参数均如下： 色谱柱为C18柱， 流动相为甲醇： 水的体积比为810:1； 洗脱模式 为等度洗脱。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征是： 所述流动相为甲醇： 水的体积比为9:1。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征是： 所述高效液相色谱法参数还包括： 流速为0.8 1.2mL/min， 洗脱时间为16-18min， 进样量为812 L； 检测器为紫外/可见光。

6、检测器， 检测波 长为210nm， 优选的， 流速为1mL/min， 进样量为10 L。 7.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述定性工序中， 所述分析型高效液相色谱法 采用的色谱柱为YMC-Pack ODS-A， 优选的， 其内径和长度2504.6mm， 粒径： 5 m， 孔径： 12nm。 8.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述第一次纯化工序和定性工序中， 采用的标 准液的制备方法如下： 称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg， 加色谱级甲醇定容至1mL， 得到 浓度为1mg/mL的标准液。 9.如权利要求1所述的方法， 其特征是： 所述第二次纯化工序中， 所述制备型高效液相。

7、 色谱法采用的色谱柱为YMC-Pack ODS-A， 优选的， 其内径和长度： 25010mm， 填料粒径： 5 m， 孔径： 12nm。 10.采用权利要求19中任一项所述的方法制备得到的含有2,6-二叔丁基对甲酚的南 极磷虾样品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106187705 A 2 一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基对甲酚的方法 技术领域 0001 本发明属于食品和化学领域， 具体涉及一种从南极磷虾中纯化制备2,6-二叔丁基 对甲酚的方法。 背景技术 0002 南极磷虾(Euphausia superba)是生活于南极生态系统中的一种重要的生物资 源， 属于节肢动物门、 甲。

8、壳纲、 磷虾目， 磷虾的寿命一般为5-7年， 2龄以后即成熟， 体长最大 可达到60mm以上。 南极磷虾具有结群的习性， 经常生活在200m以内的浅水层形成密集的群 体， 是鸟类和鱼类等南极生物主要的食物来源。 南极磷虾是地球上数量最大繁衍最成功的 单种生物资源之一， 其生物蕴藏量约为6.510810108吨， 最新估算量为3.79108吨。 南极磷虾含有丰富的油脂， 油脂中的抗氧化物质如虾青素、 虾青素酯、 不饱和脂肪酸、 2， 6- 二叔丁基对甲酚等。 0003 2， 6-二叔丁基对甲酚(缩写为BHT)是国内外广泛使用的油溶性抗氧化剂， 抗氧化 能力较强， 耐热及稳定性好。 主要可以用于油。

9、脂等食品添加中， 防止其酸败， 维持食品的颜 色和气味等， 还广泛用于高分子材料、 石油制品、 和食品加工工业中。 0004 目前2， 6-二叔丁基对甲酚较常见的制备方法为化学合成方法， 并未见在南极磷虾 中的提取纯化的研究报道。 因此， 研究一种从南极磷虾中提取纯化的2， 6-二叔丁基对甲酚 的方法， 这对南极磷虾资源的开发利用以及2， 6-二叔丁基对甲酚的制备具有十分重要的意 义。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、 准确、 可靠的南极磷虾2， 6-二 叔丁基对甲酚的纯化制备方法。 0006 本发明采用下述技术方案： 0007 一种从南极磷虾中纯化制备2,6-。

10、二叔丁基对甲酚的方法， 包括以下工序： 0008 制备粗提物的工序： 南极磷虾用甲醇进行提取， 得到2,6-二叔丁基对甲酚粗提物； 0009 第一次纯化工序： 该工序采用薄层层析刮板法对2,6-二叔丁基对甲酚粗提物进行 纯化， 得到2,6-二叔丁基对甲酚粗样品； 所述薄层层析中以体积比石油醚： 乙酸乙酯： 正己 烷4-5:1-2:0.5-1为展开剂； 0010 定性工序： 该工序采用分析型高效液相色谱法对2,6-二叔丁基对甲酚粗样品进行 定性分析， 根据保留时间确定所述第一次纯化工序的粗样品中含有2,6-二叔丁基对甲酚； 0011 第二次纯化工序： 该工序采用制备型高效液相色谱法对2,6-二叔。

11、丁基对甲酚粗样 品进行分离纯化， 在目标保留时间内将含有2,6-二叔丁基对甲酚的洗脱液接出， 蒸发除去 溶剂得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚样品。 0012 本发明的制备粗提物的工序中， 所述提取方法采用超声波提取， 超声波提取条件 为： 室温、 300-400W、 20或40kHz， 提取时间为10-20分钟； 优选的， 所述超声波提取条件为： 室 说明书 1/6 页 3 CN 106187705 A 3 温、 350W、 40kHz、 提取时间为15分钟。 0013 制备2,6-二叔丁基对甲酚粗体物的具体操作方法为： 将南极磷虾与甲醇进行超声 波提取， 过滤提取液， 得到滤液， 将所述滤。

12、液蒸干， 然后用甲醇溶解， 即得到2,6-二叔丁基对 甲酚粗提物。 0014 其中， 所述南极磷虾选用新鲜南极磷虾， 从提高2,6-二叔丁基对甲酚的观点出发， 所述南极磷虾与甲醇的添加量比例为1g： (36)mL， 采用此比例的南极磷虾和甲醇提取为 后续纯化提供了良好的基础。 0015 本发明的第一次纯化工序中： 所述薄层层析刮板法的基本操作为本领域技术人员 所公知的技术手段， 基本操作步骤为： 点样、 展开、 显色、 刮板、 洗脱。 0016 对于薄层层析方法的分离纯化的效果十分重要的因素是展开剂， 在展开剂的选取 过程中， 尝试了多种组合： 氯仿： 甲醇： 乙酸、 氯仿： 乙酸乙酯、 氯仿。

13、： 乙酸乙酯： 乙酸、 乙酸乙 酯： 丙酮： 石油醚等， 但是2,6-二叔丁基对甲酚的Rf值偏高， 且拖尾严重。 因此选取极性较低 的展开剂组合， 通过尝试各溶剂间组合和体积的配比， 最终确定了石油醚： 乙酸乙酯： 正己 烷4-5:1-2:0.5-1(V/V/V)为最适展开剂， 此时南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚得到了 很好的分离纯化， 且Rf值合适。 0017 本发明中的薄层层析刮板法， 本发明选取高效薄层硅胶板H板(1020cm)， 展距为 810cm(优选9cm)； 染色采用氯化铁水溶液进行染色， 100110烘烤5-10分钟， 根据显色 结果， 确定2,6-二叔丁基对甲酚的Rf0.。

14、79， 其中， 所述氯化铁水溶液的质量分数为4 6； 洗脱时采用甲醇进行溶解； 采用甲醇溶解后， 进行超声波提取， 超声波条件为： 超声时 间为58min， 功率为300400W。 0018 优选的， 制备2,6-二叔丁基对甲酚粗样品的具体操作方法为： 0019 取2,6-二叔丁基对甲酚粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板上， 以体积比石 油醚： 乙酸乙酯： 正己烷4-5:1-2:0.5-1为展开剂， 展距9.0cm， 展完后晾干展板； 在距离高 效薄层硅胶板H板设定处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板， 将割下的薄层硅胶板H 板用氯化铁水溶液进行染色， 然后进行烘烤， 根据显色结果， 确定。

15、割下的薄层硅胶板H板中 2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf0.79)处， 对照薄层硅胶板H板上未被染色部分， 将处于同 一Rf值处的色谱带刮下， 将硅胶粉末放入离心管中， 用色谱级甲醇溶解、 震荡。 将离心管进 行超声提取5-8min， 功率设置为300400W。 超声完成后， 将离心管放入离心机中进行离心， 收集上清液， 重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程若干次(优选10次)， 将收集到的上 清液蒸发除去甲醇， 得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液， 即为2,6-二叔丁基对甲酚 粗样品。 其中， 所述标准液的制备方法如下： 称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg， 加色谱级 甲醇定。

16、容至1mL， 得到浓度为1mg/mL的标准液。 0020 分析型高效液相色谱法能够全面反映样品组成信息， 并对各组分进行定量和定 性， 采用分析型高效液相色谱仪完成； 而制备型液相色谱方法主要是对产品的单体进行提 取纯化和鉴别。 本发明中的定性工序和第二次纯化工序中， 高效液相色谱法参数均如下： 色 谱柱为C18柱， 流动相为甲醇： 水810:1(v/v)； 洗脱模式为等度洗脱， 流速为0.8 1.2mL/min， 进样量为812 L。 优选的参数如下， 流动相为甲醇： 水9:1； 流速为1mL/min； 洗脱时间为16-18min； 进样量为10 L； 检测器为紫外/可见光检测器， 检测波长。

17、为210nm。 0021 本发明的定性工序中， 所述分析型高效液相色谱法的条件为： 色谱柱为C18柱， 优 说明书 2/6 页 4 CN 106187705 A 4 选的型号是YMC-Pack ODS-A， 内径和长度2504.6mm， 粒径： 5 m， 孔径： 12nm。 0022 定性工序的具体操作方法为： 按照设定好的参数和条件， 称取2,6-二叔丁基对甲 酚标准品1mg， 加色谱级甲醇定容至1mL， 得到浓度为1mg/mL的标准液， 经微孔滤膜(优选孔 径为0.45 m)过滤后进样。 取2,6-二叔丁基对甲酚粗样品， 用色谱级的甲醇进行溶解， 用微 孔滤膜(优选孔径为0.45 m)过滤。

18、后进样， 用色谱柱(YMC-Pack ODS-A 2504.6mm， 5 m， 12nm)进行检测， 对检测结果中的峰进行分析， 比较标准品与样品中峰的保留时间， 通过保 留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性； 对色谱峰手动积分， 显示样品中目标物的 峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积分结果进行对比， 确定样品的纯度。 0023 本发明的第二次纯化工序中， 所述制备型高效液相色谱法的条件为： 色谱柱为C18 柱， 优选的型号是YMC-Pack ODS-A， 内径和长度： 25010mm， 填料粒径： 5 m， 孔径： 12nm。 0024 第二次纯化工序的具体操作方法为： 002。

19、5 将2,6-二叔丁基对甲酚粗样品， 结合对粗样品的纯度分析， 按照设定好的参数和 条件， 利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 25010mm， 5 m， 12nm)将粗样品进行进一步纯 化与制备。 在目标保留时间内， 将含有样品的洗脱液接出， 重复操作， 收集合并洗脱液后进 行蒸发， 得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。 0026 采用以上方法制备得到的含有2,6-二叔丁基对甲酚的南极磷虾样品， 该样品中2, 6-二叔丁基对甲酚的含量较高， 可达96以上。 0027 上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果： 0028 (1)本发明首次发现了南极磷虾中存在天然抗氧化剂2。

20、,6-二叔丁基对甲酚， 打破 了2,6-二叔丁基对甲酚只能人工合成的传统观点， 为2,6-二叔丁基对甲酚的制备提供一种 新的思路和途径， 对南极磷虾资源的开发和利用也具有十分重要的意义。 0029 (2)针对南极磷虾这一特定的海洋动物， 本发明提供了纯化制备南极磷虾2,6-二 叔丁基对甲酚的良好方法， 该方法简单、 准确、 可靠、 稳定， 得到的样品中2,6-二叔丁基对甲 酚的纯度可达96以上。 0030 (3)本发明针对南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚， 首先采用甲醇预处理南极磷 虾得到含有2,6-二叔丁基对甲酚的粗提物， 然后选取薄层层析刮板法制备含有2,6-二叔丁 基对甲酚的粗样品， 。

21、再通过分析型高效液相色谱法进行成分分析， 根据保留时间确定粗样 品中含有2,6-二叔丁基对甲酚， 但同时还发现部分杂质， 最后采用制备型高效液相色谱法 分离得到高纯度的2,6-二叔丁基对甲酚。 本发明在制备南极磷虾中的2,6-二叔丁基对甲酚 选用了合适的提取、 分离和纯化的方法， 使得本发明能够顺利高效从南极磷虾中制备得到 高纯度的2,6-二叔丁基对甲酚。 附图说明 0031 图1是2,6-二叔丁基对甲酚标准品的高效液相色谱图。 0032 图2是2,6-二叔丁基对甲酚标准品的高效液相色谱峰面积积分图。 0033 图3是实施例1中的BHT粗样品的高效液相色谱图。 0034 图4是实施例1中的纯化。

22、后样品的高效液相色谱图。 0035 图5是实施例1中的纯化后样品的高效液相色谱峰面积积分图。 0036 图6是实施例1中的纯化后的高效薄层硅胶板， 其中， A、 2,6二叔丁基对甲酚样品， 说明书 3/6 页 5 CN 106187705 A 5 B、 2,6-二叔丁基对甲酚标准品。 0037 图7是实施例2中的纯化后的高效薄层硅胶板， 其中， A、 2,6二叔丁基对甲酚样品， B、 2,6-二叔丁基对甲酚标准品。 0038 图8是实施例3中的纯化后的高效薄层硅胶板， 其中， A、 2,6二叔丁基对甲酚样品， B、 2,6-二叔丁基对甲酚标准品。 具体实施方式 0039 下面结合实施例对本发明。

23、作进一步的说明。 0040 实施例1 0041 取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:3的比例在室温、 350w、 40kHz的条件下超 声提取15分钟， 过滤提取液。 将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干， 用甲醇溶解， 得到2， 6-二叔丁 基对甲酚的粗提物。 精密称取1mg 2， 6-二叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇， 得浓度为 1mg/ml的标准液。 取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板(1020cm)上， 以体 积比石油醚： 乙酸乙酯： 正己烷4:1:0.5为展开剂， 展距9.0cm， 展完后晾干展板； 在距离薄 层板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板， 将割。

24、下的薄层板用5氯化铁水溶液 进行染色， 105烘烤5分钟， 根据显色结果， 确定割下的薄层板中2,6-二叔丁基对甲酚的位 置(Rf0.79)处， 如图6， 对照薄层板上未被染色部分， 将处于同一Rf值处的色谱带刮下， 一 般为每块板5-6mg， 将硅胶粉末放入4mL离心管中， 用2mL色谱级甲醇溶解、 震荡。 将离心管进 行超声提取5min， 功率设置为350W。 超声完成后， 将离心管放入离心机中， 调控转速为 8000rpm， 离心5min， 收集上清液， 重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程10次， 将收集 到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇， 得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓。

25、缩液， 作 为初步制备得到的粗样品。 0042 高效液相色谱法分离参数如下： 流动相为甲醇： 水9:1； 洗脱模式为等度洗脱； 流 速为1mL/min； 洗脱时间为16min； 进样量为10 L； 检测器为紫外/可见光检测器， 检测波长为 210nm。 按照设定好的参数和条件， 称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg， 加色谱级甲醇定容 至1mL， 得到浓度为1mg/mL的标准液， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样。 取经刮板得到的粗样 品， 用色谱级的甲醇进行溶解， 用0.45 m的微孔滤膜过滤后进样， 用色谱柱(YMC-Pack ODS- A 2504.6mm， 5 m， 12nm)进行检。

26、测， 检测结果如图1、 图2和图3， 对检测结果中的峰进行分 析， 比较标准品与样品中峰的保留时间， 通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行 定性； 对色谱峰手动积分， 显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积 分结果进行对比， 确定样品的纯度。 以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品， 结合对粗 样品的纯度分析， 利用制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A25010mm， 5 m， 12nm)将粗样品进行 进一步纯化与制备。 在目标保留时间内， 将含有样品的洗脱液接出， 重复操作， 收集合并洗 脱液后用旋转蒸发仪进行旋转蒸发， 得到纯化后的2,6-二叔丁基对。

27、甲酚浓缩物。 取纯化后 的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物用色谱级甲醇溶解， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样检测， 检 测结果如图4和图5， 对色谱峰手动积分， 显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分 比， 与标准品积分结果进行对比， 确定样品的纯度为96.05。 0043 实施例2 0044 取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:5的比例在室温、 300w、 20kHz的条件下超 说明书 4/6 页 6 CN 106187705 A 6 声提取10分钟， 过滤提取液。 将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干， 用甲醇溶解， 得到2， 6-二叔丁 基对甲酚的粗提物。 精密称取1mg 2， 6-二。

28、叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇， 得浓度为 1mg/ml的标准液。 取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板(1020cm)上， 以体 积比石油醚： 乙酸乙酯： 正己烷4-2:1为展开剂， 展距9.0cm， 展完后晾干展板； 在距离薄层 板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板， 将割下的薄层板用5氯化铁水溶液进 行染色， 105烘烤8分钟， 根据显色结果， 确定割下的薄层板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置 (Rf0.79)处， 如图7， 对照薄层板上未被染色部分， 将处于同一Rf值处的色谱带刮下， 一般 为每块板5-6mg， 将硅胶粉末放入4mL离心管中， 用2mL色谱级甲醇。

29、溶解、 震荡。 将离心管进行 超声提取6min， 功率设置为350W。 超声完成后， 将离心管放入离心机中， 调控转速为 8000rpm， 离心6min， 收集上清液， 重复进行刮板-超声-离心-收集上清液过程10次， 将收集 到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇， 得到2,6-二叔丁基对甲酚色谱带的浓缩液， 作 为初步制备得到的粗样品。 0045 高效液相色谱法分离参数如下： 流动相为甲醇： 水9:1； 洗脱模式为等度洗脱； 流 速为1mL/min； 洗脱时间为16-18min； 进样量为10 L； 检测器为紫外/可见光检测器， 检测波 长为210nm。 按照设定好的参数和条件， 称取2,6。

30、-二叔丁基对甲酚标准品1mg， 加色谱级甲醇 定容至1mL， 得到浓度为1mg/mL的标准液， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样。 取经刮板得到的 粗样品， 用色谱级的甲醇进行溶解， 用0.45 m的微孔滤膜过滤后进样， 用色谱柱(YMC-Pack ODS-A 2504.6mm， 5 m， 12nm)进行检测， 对检测结果中的峰进行分析， 比较标准品与样品 中峰的保留时间， 通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性； 对色谱峰手动积 分， 显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积分结果进行对比， 确定 样品的纯度。 以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品， 结合。

31、对粗样品的纯度分析， 利用 制备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 25010mm， 5 m， 12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。 在目标保留时间内， 将含有样品的洗脱液接出， 重复操作， 收集合并洗脱液后用旋转蒸发仪 进行旋转蒸发， 得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。 取纯化后的2,6-二叔丁基对甲 酚浓缩物用色谱级甲醇溶解， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样检测， 对色谱峰手动积分， 显示 样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积分结果进行对比， 确定样品的 纯度为96.05 0046 实施例3 0047 取新鲜的南极磷虾10g(w)和甲醇(v)以1:6的比。

32、例在室温、 400w、 40kHz的条件下超 声提取20分钟， 过滤提取液。 将上述滤液置于旋蒸仪中蒸干， 用甲醇溶解， 得到2， 6-二叔丁 基对甲酚的粗提物。 精密称取1mg 2， 6-二叔丁基对甲酚标准品溶于1.0mL甲醇， 得浓度为 1mg/ml的标准液。 取待检测的粗提物和标准液点于高效薄层硅胶板H板 0048 (1020cm)上， 以体积比石油醚： 乙酸乙酯： 正己烷5:1:1为展开剂， 展距9.0cm， 展完后晾干展板； 在距离薄层板1cm处用玻璃钢刀沿竖直方向割下小部分薄层板， 将割下的 薄层板用5氯化铁水溶液进行染色， 105烘烤5-10分钟， 根据显色结果， 确定割下的薄层。

33、 板中2,6-二叔丁基对甲酚的位置(Rf0.79)处， 如图8， 对照薄层板上未被染色部分， 将处 于同一Rf值处的色谱带刮下， 一般为每块板5-6mg， 将硅胶粉末放入4mL离心管中， 用2mL色 谱级甲醇溶解、 震荡。 将离心管进行超声提取8min， 功率设置为350W。 超声完成后， 将离心管 放入离心机中， 调控转速为8000rpm， 离心8min， 收集上清液， 重复进行刮板-超声-离心-收 说明书 5/6 页 7 CN 106187705 A 7 集上清液过程10次， 将收集到的上清液利用旋转蒸发仪蒸发除去甲醇， 得到2,6-二叔丁基 对甲酚色谱带的浓缩液， 作为初步制备得到的粗样。

34、品。 0049 高效液相色谱法分离参数如下： 流动相为甲醇： 水9:1； 洗脱模式为等度洗脱； 流 速为1mL/min； 洗脱时间为16-18min； 进样量为10 L； 检测器为紫外/可见光检测器， 检测波 长为210nm。 按照设定好的参数和条件， 称取2,6-二叔丁基对甲酚标准品1mg， 加色谱级甲醇 定容至1mL， 得到浓度为1mg/mL的标准液， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样。 取经刮板得到的 粗样品， 用色谱级的甲醇进行溶解， 用0.45 m的微孔滤膜过滤后进样， 用色谱柱(YMC-Pack ODS-A2504.6mm， 5 m， 12nm)进行检测， 对检测结果中的峰进行分析。

35、， 比较标准品与样品中 峰的保留时间， 通过保留时间对2,6-二叔丁基对甲酚的存在进行定性； 对色谱峰手动积分， 显示样品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积分结果进行对比， 确定样 品的纯度。 以刮板法制得的2,6-二叔丁基对甲酚粗样品， 结合对粗样品的纯度分析， 利用制 备型色谱柱(YMC-Pack ODS-A 25010mm， 5 m， 12nm)将粗样品进行进一步纯化与制备。 在 目标保留时间内， 将含有样品的洗脱液接出， 重复操作， 收集合并洗脱液后用旋转蒸发仪进 行旋转蒸发， 得到纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚浓缩物。 取纯化后的2,6-二叔丁基对甲酚 浓缩物用色谱级甲醇溶解， 经0.45 m微孔滤膜过滤后进样检测， 对色谱峰手动积分， 显示样 品中目标物的峰面积占样品总面积的百分比， 与标准品积分结果进行对比， 确定样品的纯 度为96.05。 说明书 6/6 页 8 CN 106187705 A 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 106187705 A 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 106187705 A 10 图5 图6 图7 说明书附图 3/4 页 11 CN 106187705 A 11 图8 说明书附图 4/4 页 12 CN 106187705 A 12 。