发明背景
转化生长因子-β(TFGbeta；TGFβ(TGF-β))是信号转导分子，其 通过与TGFbeta受体(TGFbetaR；TGFβR(TGF-βR))结合而介导到细胞 内的信号转导。TGFbeta信号转导活性调节细胞分化和生长，其作用 (即作为细胞生长促进剂、生长阻抑剂或其它细胞功能诱导剂)的特性 取决于细胞类型(参见Roberts等，The transforming growth factor-betas， Peptide Growth Factors and Their Receptors(转化生长因子β、肽生长因 子及其受体)，第I部分，Sporn，M.B.& Roberts，A.B.编辑， Springer-Verlag，Berlin，1990，第419-472页)。
TGFbeta由各种各样的细胞类型产生，其关联受体在各种各样的 器官和细胞中表达(参见Shi和Massague，Cell，第113卷，第6期，2003 年6月13日，第685-700页；Biol.Signals.，第5卷，第232页，1996 和Pulmonary Fibrosis，Lung Biology in Health and Disease Series.第80 卷，Phan等编辑，第627页，Dekker，New York，1995)。已将TGFbeta 受体鉴定为3种类型：TGFbetaRI(TGFβRI)(TGFbeta I型受体(Franzen 等，Cell，第75卷，第4期，第681页，1993；GenBank检索号： L11695))；TGFbetaRII(TGFβRII)(TGFbeta II型受体(Herbert等，Cell， 第68卷，第4期，第775页，1992；GenBank检索号：M85079))和 TGFbetaRIII(TGFbeta III型受体(Lopez-Casillas，Cell，第67卷，第4 期，第785页，1991；GenBank检索号：L07594))。已经证明TGFbetaRI 和TGFbetaRII是TGF-beta信号转导所必需的(Laiho等，J.Biol.Chem.， 第265卷，第18518页，1990和Laiho等，J.Biol.Chem.，第266卷，第 9108页，1991)，但并不认为TGFbetaRIII是必需的。
TGFbeta信号转导是通过它与TGFbetaRI和RII两者结合而介导。 当配体与胞外配体结合结构域结合时，使这两个受体聚集，通过Smad 蛋白磷酸化而允许RII将RI磷酸化并开始信号转导级联(参见上述Shi 和Massague)。
在哺乳动物中已经鉴定了TGFbeta的3个同种型：TGFbeta1、 TGFbeta2和TGFbeta3。每个同种型都是多功能的并以自我调节的反 馈机制起作用，以控制发育过程的生物利用度并维持组织内稳态(有关 综述可见ten Dijke和Arthur，Nature Reviews，Molecular Cell Biology， 第8卷，2007年11月，第857-869页)。通过TGFbeta表达以及通过与 蛋白聚糖即胞外基质(ECM)结合的调节而控制TFGbeta水平。
异常调节的TGFbeta信号转导，例如过量TGFbeta信号转导和高 水平的生物可利用的TGFbeta，涉及多种病理学，包括不同组织的纤 维化(例如肺纤维化和肝硬化)、慢性肝炎、类风湿性关节炎、眼病、 血管再狭窄、皮肤瘢痕瘤和肾硬化发作。
因此，需要提供以特定方式阻断或破坏TGFbeta信号转导的化合 物，所述方式例如通过与TGFbeta受体II结合。这样的化合物可用于 治疗。
发明概述
第一方面，本发明提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域。 适宜地，第一方面的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域与 TGFbetaRII结合的解离常数(Kd)范围为10pM至50nM，优选10pM至 10nM，优选250pM至10nM。在一个实施方案中，所述抗TGFbetaRII 免疫球蛋白单可变结构域与TGFbetaRII以高亲和力(高效力)结合并且 解离常数为10pM至500pM。在另一个实施方案中，所述抗TGFbetaRII 免疫球蛋白单可变结构域与TGFbetaRII以中等亲和力(低效力)结合并 且解离常数为500pM至50nM，优选500pM至10nM。另一方面，本 发明提供包含抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域的分离的多肽。 适宜地，所述分离的多肽包含与选自SEQ ID NO：1-23所示的任何氨 基酸序列的至少一个氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列并 且其与TGFbetaRII结合。适宜地，所述分离的多肽与人TGFbetaRII 结合。在另一个实施方案中，所述分离的多肽也与源自不同物种例如 小鼠、狗或猴(例如食蟹猴(cyno))的TGFbetaRII结合。适宜地，所述 分离的多肽与小鼠TGFbetaRII和人TGFbetaRII结合。这样的人与其 它物种的TGFbetaRII之间的交叉反应性使相同的抗体构建体能够用 于动物疾病模型，以及用于人类。
一方面，本发明提供包含选自SEQ ID NO：1-23所示氨基酸序列 的氨基酸序列的分离的多肽。在一个实施方案中，本发明提供包含 SEQ ID NO：4(DOM23h-271)、8(DOM23h-437)或10(DOM23h-439) 中任一项所示氨基酸序列的分离的多肽。
另一方面，本发明提供由核苷酸序列编码的并与TGFbetaRII结 合的分离的多肽，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO：24-46所示的任 何核酸序列的核苷酸序列具有至少60％同一性。适宜地，所述分离的 多肽与人TGFbetaRII结合。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含与选自SEQ ID NO：1-23所示的任何氨基酸序列的任一氨基酸序列 的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中， 所述抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域包含与SEQ ID NO：1-23 所示的任何氨基酸序列的氨基酸序列相同的氨基酸序列。适宜地，所 述抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域包含SEQ ID NO：4 (DOM23h-271)、8(DOM23h-437)或10(DOM23h-439)中任一项所示的 氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗TGFbetaRII免疫球蛋白单 可变结构域包含选自SEQ ID NO：1-23所示的任何氨基酸序列的氨基 酸序列。适宜地，所述抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域与 TGFbetaRII结合，优选与人TGFbetaRII结合。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR1序列具有至少50％同一性的CDR1序列。
再一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR2序列具有至少50％同一性的CDR2序列。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR3序列具有至少50％同一性的CDR3序列。
再一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR1序列具有至少50％同一性的CDR1序列和包含与 SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR2序列具有至少50％同一性的 CDR2序列。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR1序列具有至少50％同一性的CDR1序列和包含与 SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR3序列具有至少50％同一性的 CDR3序列。
再一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR2序列具有至少50％同一性的CDR2序列和包含与 SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR3序列具有至少50％同一性的 CDR3序列。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含SEQ ID NO：1-23所示的任一氨基酸序列的氨基酸序列，该氨基酸 序列在不超过25个氨基酸位置上被修饰并包含与SEQ ID NO：1-23的 任一项中的CDR1序列具有至少50％同一性的CDR1序列和包含与 SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR2序列具有至少50％同一性的 CDR2序列和包含与SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR3序列具有 至少50％同一性的CDR3序列。
再一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含与选自以下的CDR3序列具有至少50％同一性的CDR3序列：SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR3序列。
另一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含选自以下的CDR3序列：SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR3序 列。
再一方面，提供抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域，其包 含至少一个选自以下的CDR：CDR1、CDR2和CDR3，其中所述 CDR1、CDR2或CDR3与SEQ ID NO：1-23的任一项中的CDR1、 CDR2或CDR3序列相同。
适宜地，使用本文所述的Kabat方法确定CDR序列。在一个实 施方案中，各序列的CDR序列在图7中给出。
在一个实施方案中，提供本发明任何方面的抗TGFbetaRII免疫 球蛋白单可变结构域或多肽，其包含任何以下氨基酸：所述免疫球蛋 白单可变结构域的位置61的N、位置64的R、位置102的H、位置 39的R、位置53的D或位置103的S。在一个实施方案中，所述免 疫球蛋白单可变结构域或多肽包含这些氨基酸的组合。在另一个实施 方案中，所述免疫球蛋白单可变结构域或多肽包含61的N和64的R 氨基酸。在这些实施方案中，氨基酸编号是免疫球蛋白单可变结构域 的编号，例如SEQ ID NO：1-23中给出的那些序列所例示的那样。
另一方面，提供对TGFbetaRII具有结合特异性并抑制抗 TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域的结合的配体或结合部分，所述 单可变结构域包含选自SEQ ID NO：1-23的氨基酸序列。
本发明的再一方面提供包含本发明任何方面的免疫球蛋白单可 变结构域、多肽或配体的融合蛋白。
在一个实施方案中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、 配体或融合蛋白中和TGFbeta活性。适宜地，本发明的免疫球蛋白单 可变结构域或多肽抑制TGFbeta与TGFbetaRII的结合。在另一个实施 方案中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域或多肽通过TGFbetaRII 抑制TGFbeta信号转导活性。在另一个实施方案中，本发明的免疫球 蛋白单可变结构域或多肽阻抑TGFbeta活性，尤其是TGFbeta细胞生 长活性。适宜地，TGFbetaRII是人TGFbetaRII。
在一个实施方案中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、 配体或融合蛋白在10微摩尔浓度(μM)下不含TGFbetaRII激动剂活 性。
另一方面，提供还包含半寿期延长部分的本发明任何方面的免疫 球蛋白单可变结构域、多肽、配体或融合蛋白。适宜地，所述半寿期 延长部分是聚乙二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其 转铁蛋白-结合部分、或者包含增加体内半寿期的多肽结合位点的抗体 或抗体片段。在一个实施方案中，所述半寿期延长部分是包含血清白 蛋白或新生儿Fc受体的结合位点的抗体或抗体片段。在另一个实施 方案中，所述半寿期延长部分是dAb、抗体或抗体片段。
另一方面，本发明提供分离的或重组的核酸，其编码包含本发明 任何方面的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域、多肽、配体或融 合蛋白的多肽。
在一个实施方案中，所述分离的或重组的核酸分子包含选自具 有SEQ ID NO：24-46所示序列的任何核酸分子的核酸分子。
一方面，本发明提供分离的或重组的核酸，其中所述核酸包含与 具有SEQ ID NO：24-46所示序列的任何核酸分子的核苷酸序列具有 至少70％同一性的核苷酸序列，并且其中所述核酸编码包含与 TGFbetaRII特异性结合的免疫球蛋白单可变结构域的多肽。
另一方面，提供包含本发明核酸的载体。
再一方面，提供包含本发明核酸或载体的宿主细胞。本发明的还 一方面提供产生包含本发明的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构 域或多肽或配体的多肽的方法，所述方法包括在适合表达所述核酸或 载体的条件下维持本发明的宿主细胞，由此产生包含免疫球蛋白单可 变结构域、多肽或配体的多肽。任选地，所述方法还包括分离所述多 肽和任选产生变体的步骤，所述变体例如突变变体；在标准测定中， 与所述分离的多肽相比，所述变体具有改善的亲和力(Kd)；或对 TGFbeta中和具有改善的EC50。本文在例如实施例部分描述了TGFbeta 活性的合适测定方法，例如细胞传感器测定。
在本发明的一方面，本发明的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变 结构域、多肽或配体用作药物。因此，提供包含本发明的抗TGFbetaRII 免疫球蛋白单可变结构域、多肽或配体的组合物，用作药物。
适宜地，本发明的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域、多 肽或配体或组合物用于治疗TGFbeta信号转导相关疾病。适宜地，所 述疾病是组织纤维化，例如肺纤维化包括特发性肺纤维化、肝纤维化 包括肝硬化和慢性肝炎、类风湿性关节炎、眼病、或皮肤纤维化包括 皮肤瘢痕瘤，以及肾的纤维化例如肾炎、肾纤维化和肾硬化、或血管 病例如再狭窄。其它TGFbeta信号转导相关疾病包括血管病例如高血 压、先兆子痫、遗传性出血性毛细血管扩张I型(HHT1)、HHT2、肺 动脉高血压、主动脉瘤、马方综合征(Marfan syndrome)、家族型动脉 瘤病、Loeys-Dietz综合征、动脉血管纡曲综合征(arterial tortuosity syndrome，ATS)。其它TGFbeta信号转导相关疾病包括肌肉骨骼系统 疾病，例如杜兴肌营养不良和肌纤维化。更多的TGFbeta信号转导相 关疾病包括癌症，例如结肠癌、胃癌和胰腺癌、以及神经胶质瘤和 NSCLC。另外，本发明提供通过在肿瘤血管生成中调节TGFbeta信号 转导而靶向癌症的方法。其它疾病或病症包括组织疤痕化相关疾病或 病症。其它疾病包括肺病例如COPD(慢性阻塞性肺病)。一方面，本 发明提供用于肺部递送的抗TGFbetaRII单可变结构域或拮抗剂、组合 物或融合蛋白。一方面，本发明提供用于递送到患者肺的抗 TGFbetaRII单可变结构域或拮抗剂或融合蛋白。一方面，本发明提供 抗TGFbetaRII单可变结构域或拮抗剂或融合蛋白在制备供用于肺部 递送的药物中的用途。一方面，本发明提供本发明的抗TGFbetaRII 单可变结构域或拮抗剂或融合蛋白在制备用于递送到患者肺的药物 中的用途。
在一个实施方案中，所述可变结构域本身，或作为拮抗剂或融合 蛋白的一部分，对蛋白酶例如leucozyme和/或胰蛋白酶具有抗性。
在一个实施方案中，所述组合物用于肺部递送。适宜地，所述组 合物包含用于肺部递送的单体dAb。在另一个实施方案中，所述组合 物由用于肺部递送的单体dAb组成。
适宜地，所述组合物用于治疗或预防人的TGFbeta介导的病症。
因此，在一个实施方案中，提供用于治疗特发性肺纤维化的抗 TGFbetaRII dAb。适宜地，所述抗TGFbetaRII dAb是以用于肺部递送 的单体dAb形式提供，优选不含任何标签(即无标签的)，例如myc或 另一种纯化标签。
一方面，所述组合物是药物组合物并且还包含药学上可接受的载 体、赋形剂或稀释剂。
另一方面，提供治疗和/或预防人患者中的TGFbeta介导的病症 的方法，所述方法包括将包含本发明的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可 变结构域、多肽或配体的组合物给予所述患者。
再一方面，本发明提供含有本发明组合物的肺部递送装置。适宜 地，这样的装置是吸入器或鼻内给药装置。
附图简述
图1显示本发明dAb的氨基酸(SEQ ID NO：1-23)和核酸(SEQ ID NO：24-46)序列。
图2显示DOM23h幼稚(naive)dAb氨基酸序列的比对。氨基酸按 照Kabat来编号。CDR序列用粗体和下划线表示。点表示与DOM 23h-251(SEQ ID NO：2)的序列同一性。
图3显示DOM23h-262(SEQ ID NO：3)谱系氨基酸序列的比对。 氨基酸按照Kabat来编号。CDR序列用粗体和下划线表示。点表示与 DOM 23h-262(SEQ ID NO：3)的序列同一性。
图4显示DOM23h-271谱系氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。 氨基酸按照Kabat来编号。CDR序列用粗体和下划线表示。点表示与 DOM23h-271(SEQ ID NO：4)的序列同一性。
图5显示DOM23h-437谱系氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的比对。 氨基酸按照Kabat来编号。CDR序列用粗体和下划线表示。点表示与 DOM23h-437(SEQ ID NO：8)的序列同一性。
图6显示DOM23h-439谱系氨基酸序列(SEQ ID NO：10)的比对。 氨基酸按照Kabat来编号。CDR序列用粗体和下划线表示。点表示与 DOM23h-439(SEQ ID NO：10)的序列同一性。
图7显示详述CDR序列的表。
图8显示竞争BIAcore。将DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)注射 到hTFGβ-RII-Fc偶联芯片(注射1)上，紧接接着注射2，其由 DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)和DOM23h-271-3(SEQ ID NO：)(A) 或DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)和DOM23h-439-6(B)(SEQ ID NO： 22)的混合物组成。用两次10mM甘氨酸pH2.25的注射(注射3)再生芯 片。
图9显示竞争BIAcore。将DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)注射 到hTFGβ-RII-Fc偶联芯片(注射1)上，紧接着注射2，其由 DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)和DOM23h-262-10(SEQ ID NO：13) (C)或DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)和DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)(D)的混合物组成。用两次10mM甘氨酸pH 2.25的注射(注射 3)再生芯片。
图10显示竞争BIAcore。将DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)注射 到hTFGβ-RII-Fc偶联芯片(注射1)上，紧接着注射2，其由 DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)和DOM23h-439-8(SEQ ID NO：23) (E)的混合物组成。用两次10mM甘氨酸pH 2.25的注射(注射3)再生 芯片。
图11显示序列标识符(SEQ ID NO：)及其相应的鉴定的表。
发明详述
在本说明书中，参考实施方案描述了本发明，其方式使得能够书 写清楚和正确的说明书。预期和应当理解的是，在不偏离本发明的情 况下可将实施方案进行不同组合或分离。
除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语都具有本领 域(例如在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学领 域)普通技术人员通常理解的含义。标准技术用于分子、遗传和生化方 法(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第 2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版， John Wiley & Sons，Inc.，其通过引用结合到本文中)和化学方法。
免疫球蛋白：本文所用的“免疫球蛋白”是指保留抗体分子的免 疫球蛋白折叠特征的多肽家族，其含有两个β片层，并且通常含有保 守二硫键。
结构域：本文所用的“结构域”是指折叠的蛋白结构，其具有与 蛋白的其它部分无关的三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的无关 联的功能特性，在许多情况下，可以添加、除去或转移至其它蛋白， 而不丧失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。所谓单抗体可变结构域 或免疫球蛋白单可变结构域，是指折叠的多肽结构域，其包含为抗体 可变结构域特征的序列。因此其包括完整的抗体可变结构域和修饰的 可变结构域，例如其中一个或多个环已被不是抗体可变结构域特征的 序列替代，或者已被截短或包含N末端或C末端延长的抗体可变结构 域，以及至少部分地保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构 域的折叠片段。
免疫球蛋白单可变结构域：术语“免疫球蛋白单可变结构域”是 指独立于不同或其它V区或结构域地与抗原或表位特异性结合的抗 体可变结构域(VH、VHH、VL)或结合结构域。免疫球蛋白单可变结构 域可以以具有其它可变区或可变结构域的形式(例如同多聚体或异多 聚体)存在，其中所述其它区或结构域并非单免疫球蛋白可变结构域进 行抗原结合所需要的(即其中免疫球蛋白单可变结构域与抗原结合是 独立于其它可变结构域的)。当在本文中使用时，“结构域抗体”或 “dAb”是“免疫球蛋白单可变结构域”。当在本文中使用时，“单 抗体可变结构域”或“抗体单可变结构域”与“免疫球蛋白单可变结 构域”相同。在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是人抗体 可变结构域，但也包括其它物种如啮齿类动物(例如WO 00/29004中 所公开的，其内容整体通过引用结合到本文中)、铰口鲨和骆驼类 (Camelid)VHH dAb的单抗体可变结构域。骆驼类VHH是免疫球蛋白单 可变结构域多肽，其来源于包括骆驼、驼羊、羊驼、单峰驼和原驼的 物种，产生天然缺少轻链的重链抗体。VHH可被人源化。
在本发明的所有方面，免疫球蛋白单可变结构域独立选自抗体重 链和轻链单可变结构域，例如VH、VL和VHH。
本文所用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例 如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、封闭构象多特异性抗 体、二硫键连接的scFv、双抗体)，其无论是来源于天然产生抗体的 任何物种，或通过重组DNA技术产生；无论是分离自例如血清、B 细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。
抗体形式：在一个实施方案中，可以任何抗体形式提供本发明的 免疫球蛋白单可变结构域、多肽或配体。本文所用的“抗体形式”是 指任何合适的多肽结构，其中可掺入一个或多个抗体可变结构域以赋 予所述结构针对抗原的结合特异性。各种各样的合适抗体形式是本领 域已知的，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异 性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二 聚体、上述任一种的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、 二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、单抗体可变 结构域(例如dAb、VH、VHH、VL)和上述任一种的修饰形式(例如通过 与聚乙二醇或其它合适的聚合物共价连接而修饰或者人源化VHH)。在 一个实施方案中，备选的抗体形式包括备选支架，其中可将本发明任 何分子的CDR移植到合适的蛋白支架或骨架上，例如亲和体 (affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构域、亲合多聚体(avimer)(参 见例如美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)或EGF结构域。此外，配体可以是双价(异双价)或多价 (异多价)，如本文所述。在其它实施方案中，可使用“通用框架”， 其中“通用框架”是指这样的单抗体框架序列：按照Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，US Department of Health and Human Services)的定义对应于在序列中保守的抗体区的单抗体框架序 列或者按照Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：910-917的定义对 应于人种系免疫球蛋白库或结构的单抗体框架序列。本发明提供单框 架或一组这样的框架的用途，已经发现仅通过超变区的变异而允许事 实上的任何结合特异性的衍生。
在本说明书中描述的本发明实施方案中，在本发明的肽或配体中 不使用抗TGFbetaRII“dAb”，而是预期技术人员可使用包含与 TGFbetaRII结合的本发明dAb的一个或多个或全部3个CDR的多肽 或结构域(例如CDR移植到合适的蛋白支架或骨架上，例如亲和体、 SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域)。本说明书作为一个 整体因此可被视为使用这样的结构域替代dAb而提供多肽的公开内 容。在这一方面，参见WO2008096158，其公开内容通过引用结合到 本文中。
在一个实施方案中，所述抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构 域是任何合适免疫球蛋白可变结构域，并且任选是人可变结构域或者 包含或来自人构架区(例如DP47或DPK9框架区)的可变结构域。
抗原：本文所述的“抗原”是本发明的结合结构域所结合的分子。 通常，抗原与抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。它可以是例如 多肽、蛋白、核酸或其它分子。
表位：“表位”是免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表 位限定抗体的最小结合位点，因此代表抗体特异性靶标。在单结构域 抗体的情况下，表位代表分离的可变结构域所结合的结构单元。
结合：通常，特异性结合表示为解离常数(Kd)为50纳摩尔浓度 以下，任选250皮摩尔浓度以下。可通过合适的测定来确定抗原结合 蛋白与抗原或表位的特异性结合，所述测定包括例如Scatchard分析和 /或竞争性结合测定，例如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定例如 ELISA和夹心竞争测定，及其不同变体。
结合亲和力：使用表面等离子共振(SPR)和Biacore(Karlsson等， 1991)，使用Biacore系统(Uppsala，Sweden)，任选测定结合亲和力。 Biacore系统使用表面等离子共振(SPR，Welford K.1991，Opt.Quant. Elect.23：1；Morton和Myszka，1998，Methods in Enzymology 295：268) 实时监测生物分子的相互作用，并使用可检测玻璃支持物上的金薄膜 表面的光的共振角的改变的表面等离子共振，共振角的改变是至多离 开300nm的表面的折射率变化的结果。Biacore分析便利地产生缔合 速率常数、解离速率常数、平衡解离常数和亲和常数。通过使用Biacore 表面等离子共振系统(Biacore，Inc.)评价缔合速率常数和解离速率常数 来获取结合亲和力。按照制造商(Biacore)的使用指南，将生物传感器 芯片活化，用于共价偶联靶标。再稀释靶标并注射到芯片上以在固定 化材料的响应单元中获得信号。因为共振单元(RU)中的信号与固定化 材料的质量成比例，所以这表示基质上的一系列固定化靶标密度。将 解离数据与一位点模型拟合以得到koff+/-s.d.(测量的标准差)。对每 条缔合曲线都计算假一级速率常数(Pseudo-first order rate constant) (Kd)，并作为蛋白浓度的函数作图，得到kon+/-s.e.(拟合的标准误差)。 对于结合，从SPR测量中求出平衡解离常数Kd，为koff/kon。
本发明另一方面提供与人TGFbetaRII特异性结合的抗 TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域。在一个实施方案中，可变结构 域与人TGFbetaRII结合的解离常数(Kd)为约50nM、40nM、30nM、 20nM、10nM以下，任选约9、8、7、6或5nM以下，任选约4nM 以下，约3nM以下或约2nM以下或约1nM以下，任选约500pM以 下。适宜地，当可变结构域的解离常数范围为约50nM至500pM时， 特别适合局部给予给目标组织例如肺。在该实施方案中，可提供高浓 度的这类“中等亲和力”结合剂作为有效治疗药。在另一个实施方案 中，可变结构域与人TGFbetaRII结合的解离常数(Kd)为约500pM以 下、任选约450pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、150pM、 100pM、50pM以下，任选约40pM、30pM、20pM、10pM以下。适 宜地，当可变结构域的解离常数范围为约500pM至10pM时，特别适 合系统给予，使得在任一目标组织中的量均足以提供有效治疗。在该 实施方案中，可提供低浓度的这类“高亲和力”结合剂作为有效治疗 药。
在一个实施方案中，本发明的单可变结构域显示出人 TGFbetaRII和其它物种TGFbetaRII(例如小鼠TGFbetaRII)之间的交叉 反应性。在该实施方案中，可变结构域与人和小鼠的TGFbetaRII特异 性结合。这特别有用，因为药物开发通常需要先在小鼠系统中测试先 导药物候选者，然后再在人体内测试药物。供应可与人和小鼠物种结 合的药物，允许使用相同药物在这些系统中测试结果并进行数据的并 行比较。这就避免了分别寻找对小鼠TGFbetaRII起作用的药物和对人 TGFbetaRII起作用的药物的复杂需求，并且还避免了使用不同药物来 比较人和小鼠的结果的需求。同样预计了用于疾病模型的其它物种(例 如狗或猴例如食蟹猴)间的交叉反应性。
任选地，免疫球蛋白单可变结构域对至少小鼠TGFbetaRII的结 合亲和力和对人TGFbetaRII的结合亲和力相差不超过10、50或100 倍。
CDR：本文所述的免疫球蛋白单可变结构域(dAb)含有互补性决 定区(CDR1、CDR2和CDR3)。按照Kabat等(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991))定义了CDR 和框架(FR)区的位置和编号系统。根据众所周知的Kabat氨基酸编号系 统和CDR的定义，本文所公开的VH(CDRH1等)和VL(CDRL1等)(Vκ) dAb的CDR(CDR1、CDR2、CDR3)的氨基酸序列对于本领域技术人 员而言将会是显而易见的。根据Kabat编号系统，最常用方法基于序 列变异性，重链CDR-H3具有不同长度，插入序列的编号介于残基 H100和H101之间，其字母可到K(即H100、H100A...H100K、 H101)。还可备选地使用如下所述的Chothia系统(基于结构环区的位 置)(Chothia等，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature 342，第877-883页)，根据AbM(Kabat和Chothia两 者的折衷)或根据Contact(接触)法(基于结晶结构和与抗原接触残基的 预测)，确定CDR。确定CDR的合适方法参见 http://www.bioinf.org.uk/abs/。
一旦对每个残基编号后，就可以采用以下CDR定义：
Kabat：
CDR H1：31-35/35A/35B
CDR H2：50-65
CDR H3：95-102
CDR L1：24-34
CDR L2：50-56
CDR L3：89-97
Chothia：
CDR H1：26-32
CDR H2：52-56
CDR H3：95-102
CDR L1：24-34
CDR L2：50-56
CDR L3：89-97
AbM：
(使用Kabat编号)：(使用Chothia编号)：
CDR H1：26-35/35A/35B 26-35
CDR H2：50-58 -
CDR H3：95-102 -
CDR L1：24-34 -
CDR L2：50-56 -
CDR L3：89-97 -
Contact
(使用Kabat编号)：(使用Chothia编号)：
CDR H1：30-35/35A/35B 30-35
CDR H2：47-58 -
CDR H3：93-101 -
CDR L1：30-36 -
CDR L2：46-55 -
CDR L3：89-96 -
(“-”是指与Kabat编号相同)
TGFbetaRII：本文所用的“TGFbetaRII”(转化生长因子βII型 受体；TGFβRII)是指天然存在的或内源的哺乳动物TGFbetaRII蛋白 和与天然存在的或内源的相应哺乳动物TGFbetaRII蛋白(例如重组蛋 白、合成蛋白(即，使用合成有机化学的方法产生))具有相同氨基酸序 列的蛋白。因此，如本文中定义，该术语包括成熟TGFbetaRII蛋白、 多态变体或等位变体和TGFbetaRII的其它同种型和上述的经修饰的 或未经修饰的形式(例如脂化、糖基化)。天然存在的或内源的 TGFbetaRII包括在哺乳动物(例如人、非人灵长类)中天然存在的野生 型蛋白，例如成熟TGFbetaRII、多态变体或等位变体和其它同种型和 突变形式。可从例如天然表达TGFbetaRII的来源中回收或分离这样的 蛋白。这些蛋白和与天然存在的或内源的相应TGFbetaRII具有相同氨 基酸序列的蛋白，以相应哺乳动物的名称来提及。例如，当相应的哺 乳动物是人时，蛋白就称为人TGFbetaRII。人TGFbetaRII描述于例 如Lin等，Cell 1992，第68(4)卷，第775-785页和GenBank检索号 M85079。
人TGFbetaRII是由567个氨基酸组成的跨膜受体，并具有大约 159个氨基酸的胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域，其包含用于 信号转导的蛋白激酶结构域。
本文所用的“TGFbetaRII”也包括TGFbetaRII的部分或片段。在 一个实施方案中，这样的部分或片段包括TGFbetaRII的胞外结构域或 其部分。
与免疫球蛋白单可变结构域、多肽、配体、融合蛋白等有关的“抗 TGFbetaRII”是指识别TGFbetaRII并与之结合的部分。在一个实施方 案中，“抗TGFbetaRII”特异性识别和/或特异性结合蛋白TGFbetaRII， 蛋白TGFbetaRII适宜地为人TGFbetaRII。在另一个实施方案中，本 发明的抗TGFbetaRII免疫球蛋白单可变结构域也结合小鼠 TGFbetaRII(GenBank检索号NM_029575；描述于例如Massague等， Cell 69(7)，1067-1070(1992))。
“TGFbeta”包括同种型，例如TGFbeta1、TGFbeta2和TGFbeta3。
TGFbeta与TGFbetaRII结合，并且，以与TGFbetaRI的复合物形 式起始信号转导途径。因此，可通过测量TGFbeta信号转导输出的任 何测定来测定TGFbeta活性和对TGFbeta活性的抑制或中和。TGFbeta 信号转导的综述可参见例如Itoh等，Eur.J.Biochem 2000，第267卷， 第6954页；Dennler等，Journal of Leucocyte Biol.2002，71(5)，第731-40 页。因此，可在本领域技术人员熟悉的多种不同测定中测试TGFbeta 活性。“抑制”或“中和”是指：与在本发明的免疫球蛋白单可变结 构域不存在时的TGFbeta活性相比，在这种免疫球蛋白单可变结构域 存在时的TGFbeta的生物活性被完全地或部分地降低。
在一个实施方案中，在IL-11释放测定中测试TGFbeta活性的抑 制或中和。在该实施方案中，针对其对人TGFbeta1(TGFbeta1；TGF-β1) 刺激的细胞例如A549细胞的IL-11释放的抑制能力来测试本发明免 疫球蛋白单可变结构域的能力。TGFbeta1(TGF-β1)与TGFbetaRII (TGF-βRII)直接结合并诱导TGFbetaRI/RII(TGF-βRI/II)复合物的装 配。TGFbetaRI(TGF-βRI)被磷酸化并能通过包括Smad 4途径在内的 若干途径进行信号转导。Smad 4途径的激活导致IL-11的释放。IL-11 被分泌到细胞上清液中，然后通过比色ELISA测量。本文描述了合适 的IL-11释放测定，例如R & D systems(ref.D1100)供应的Human IL-11 Quantikine ELISA测定试剂盒。
在另一个实施方案中，针对在MC3T3-E1萤光素酶测定中本发明 免疫球蛋白单可变结构域抑制MC3T3-E1细胞中TGFbeta诱导的 CAGA-萤光素酶表达的能力，在测定中测试TGFbeta活性。3拷贝的 TGFbeta反应序列基序(称为CAGA盒)存在于人PAI-1启动子中并与 Smad3和4蛋白特异性结合。将多拷贝CAGA盒克隆到萤光素酶报道 基因构建体中，将TGFbeta反应性赋予转染了报道基因系统的细胞。 本文描述了一个合适的测定，其使用稳定转染了[CAGA]12-萤光素酶 报道基因构建体的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)(Dennler等，(1998) EMBO J.17，3091-3100)。
其它合适的测定包括人SBEβ-内酰胺酶细胞测定 (INVITROGEN，细胞传感器测定)。合适测定的实例描述于本文中。
适宜地，本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、配体或融合 蛋白本身并不激活TGFbetaRII受体信号转导。因此，在一个实施方案 中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、配体或融合蛋白在10 μM下不含激动剂活性。在本文所述的TGFbetaRII测定中，在TGFbeta 不存在时，可通过测试目标化合物来测定激动剂活性。当TGFbeta不 存在时，将通过检测TGFbetaRII信号转导来检测目标化合物的激动剂 活性。
同源性：与本发明所公开的序列类似或同源(例如至少约70％序 列同一性)的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸 水平上的序列同一性可为约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一 性可为约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。备选地，当核酸区 段在选择性杂交条件(例如极高严格性杂交条件)下将与链的互补链杂 交时，就存在基本同一性。核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中， 或者呈部分纯化的或基本纯化的形式。
本文所用的术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性” 或“极高严格性”条件描述了核酸杂交和洗涤的条件。有关进行杂交 反应的指南可参见Current Protocols in Molecular Biolo gy，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，其通过引用全部结合到本文中。在这 些参考资料中描述了含水和不含水方法，都可使用。本文所涉及的具 体杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中在约45℃，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中至少在50℃洗涤2次(对 于低严格性条件，洗涤温度可升至55℃)；(2)中等严格性杂交条件在 6X SSC中在约45℃，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中在60℃洗涤一 次或多次；(3)高严格性杂交条件在6X SSC中在约45℃，然后在0.2X SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤一次或多次；和任选(4)极高严格性杂 交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS在65℃，然后在0.2X SSC、1％SDS 中在65℃洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条件，除非 另有说明，应当使用该条件。
两个序列间“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(这些术 语在本文中可互换使用)的计算如下进行。将序列进行比对，用于最佳 比较目的(例如对于最佳比对，可在第一和第二氨基酸序列或核酸序列 之一或两者中引入空位，并且为了比较目的，可忽视非同源序列)。在 一个实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长 度的至少约30％，任选至少约40％、任选至少约50％、任选至少约 60％，和任选至少约70％、80％、90％或100％。然后比较相应氨基酸 位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置在 第二序列的相应位置上被相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则两分 子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨 基酸或核酸“同一性”)。两序列间的％同一性是这两序列共享的相同 位置数的函数，并考虑为了两序列的最佳比对而需要引入的空位数和 各空位长度。
任选准备和测定本文所定义的氨基酸序列和核苷酸序列的比对 和同源性、相似性或同一性，使用算法BLAST 2 Sequences，使用默 认参数(Tatusova，T.A.等.，FEMS Microbiol Lett，174：187-188(1999))。 备选地，BLAST算法(第2.0版)用于序列比对，参数设置为默认值。 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是blastp、blastn、blastx、 tblastn和tblastx程序所使用的启发式检索算法；这些程序使用Karlin 和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6)：2264-8)的统计学方 法将显著性归结于其发现。
配体：本文所用的术语“配体”是指包含至少一个具有TGFbetaRII 结合特异性结合位点的肽、多肽或蛋白部分的化合物。配体也可称为 “结合部分”。
本发明的配体或结合部分任选包含具有不同结合特异性的免疫 球蛋白可变结构域，并且不含一起形成靶化合物的结合位点的可变结 构域对(即不包含一起形成TGFbetaRII的结合位点的免疫球蛋白重链 可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域)。任选地，具有靶标结合特 异性结合位点的各结构域是对所需靶标(例如TGFbetaRII)具有结合特 异性的免疫球蛋白单可变结构域(例如免疫球蛋白单重链可变结构域 (例如VH、VHH)、免疫球蛋白单轻链可变结构域(例如VL))。
因此，“配体”包括含有两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域 的多肽，其中每个免疫球蛋白单可变结构域与不同靶标结合。配体也 包括含有至少两个以合适形式结合不同靶标的免疫球蛋白单可变结 构域或单可变结构域的CDR序列的多肽，所述形式例如抗体形式(例 如IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2)或合适的蛋白支架或骨架， 例如亲和体、SpA支架、LDL受体A类结构域、EGF结构域、亲合 多聚体和双特异性配体和多特异性配体，如本文所述。
具有靶标(例如TGFbetaRII)结合特异性结合位点的多肽结构域也 可以是包含所需靶标的结合位点的蛋白结构域，例如选自以下的蛋白 结构域：亲和体、SpA结构域、LDL受体A类结构域、亲合多聚体(参 见例如美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)。如有必要，“配体”还可包含一个或多个额外部分， 所述部分可各自独立地为肽、多肽或蛋白部分或非肽部分(例如聚亚烷 基二醇、脂质、碳水化合物)。例如，配体还可包含本文所述的半寿期 延长部分(例如聚亚烷基二醇部分，包含白蛋白、白蛋白片段或白蛋白 变体的部分，包含转铁蛋白、转铁蛋白片段或转铁蛋白变体的部分， 与白蛋白结合的部分，与新生儿Fc受体结合的部分)。
竞争：本文所用的术语“竞争”是指，第一靶标(例如TGFbetaRII) 与其关联靶标结合结构域(例如免疫球蛋白单可变结构域)的结合在对 所述关联靶标具有特异性的第二结合结构域(例如免疫球蛋白单可变 结构域)存在时被抑制。例如，可在空间上抑制结合，例如通过物理阻 断结合结构域或通过改变结合结构域的结构或环境，使得其对靶标的 亲和力或亲合力下降。如何进行竞争ELISA和竞争BiaCore实验以测 定第一和第二结合结构域间的竞争的详情可参见WO2006038027，所 述详情通过引用结合到本文中，以提供清楚的公开用于本发明。
TGFbeta信号转导：适宜地，本发明的单可变结构域、多肽或配 体可通过TGFbetaRII中和TGFbeta信号转导。“中和”是指TGFbeta 的正常信号转导作用被阻断，使得TGFbeta的存在对TGFbetaRII信号 转导具有中和作用。测量中和作用的合适方法包括用于本文所述的 TGFbeta信号转导的测定。在一个实施方案中，中和被观察为在 TGFbeta信号转导测定中TFGbeta活性的％抑制。在一个实施方案中， 单可变结构域或多肽与TGFbetaRII的胞外结构域结合，由此抑制/阻 断TGFbeta与TGFbetaRII的胞外结构域的结合。适宜地，当有过量的 生物可利用的TGFbeta存在，并且单可变结构域或多肽通过抑制 TGFbeta与其关联受体TGFbetaRII的结合而起到抑制生物可利用的 TGFbeta的信号转导活性的作用时，单可变结构域或多肽是有用的。
本文所用的术语“TGFbetaRII拮抗剂”或“抗TGFbetaRII拮抗剂” 等是指与TGFbetaRII结合并可抑制TGFbetaRII的功能(即一个或多个 功能)的物质(例如分子、化合物)。例如，TGFbetaRII拮抗剂可抑制 TGFbeta与TGFbetaRII的结合和/或抑制通过TGFbetaRII介导的信号 转导。因此，用TGFbetaRII拮抗剂可抑制TGFbeta-介导的过程和细 胞反应。
在一个实施方案中，与TGFbetaRII结合的配体(例如免疫球蛋白 单可变结构域)抑制TGFbeta与TGFbetaRII受体的结合，其抑制浓度 50(IC50)≤约10μM、≤约1μM、≤约100nM、≤约50nM、≤约 10nM、≤约5nM、≤约1nM、≤约500pM、≤约300pM、≤约 100pM、或≤约10pM。任选使用体外TGFbeta受体结合测定或细胞 测定，例如本文所述的测定，来测定IC50。
也预期在合适的体外测定中配体(例如免疫球蛋白单可变结构域) 任选抑制TGFbetaRII诱导的功能，其中和剂量50(ND50)≤约10μM、 ≤约1μM、≤约100nM、≤约50nM、≤约10nM、≤约5nM、≤约 1nM、≤约500pM、≤约300pM、≤约100pM、≤约10pM、≤约 1pM≤约500fM、≤约300fM、≤约100fM、≤约10fM。
“双特异性配体”：在一个实施方案中，本发明的免疫球蛋白单 可变结构域、多肽或配体可以是“双特异性配体”的组成部分，“双 特异性配体”是指包含第一抗原或表位结合位点(例如第一免疫球蛋白 单可变结构域)和第二抗原或表位结合位点(例如第二免疫球蛋白单可 变结构域)的配体，其中结合位点或可变结构域能够与通常不为单特异 性免疫球蛋白所结合的两种抗原(例如不同抗原或两拷贝相同的抗原) 或同一抗原上的两个表位结合。例如，两个表位可在同一抗原上，但 并非同一表位或并非彼此足够靠近而被单特异性配体所结合。在一个 实施方案中，本发明的双特异性配体由具有不同特异性的结合位点或 可变结构域组成，并且不含具有相同特异性(即不形成单一结合位点) 的相互互补的可变结构域对(即VH/VL对)。
在一个实施方案中，“双特异性配体”可与TGFbetaRII和另一 靶分子结合。例如，另一靶分子可以是组织-特异性靶分子，使得本发 明的双特异性配体能够将本发明的抗TGFbetaRII多肽或免疫球蛋白 单可变结构域靶向目标组织。这样的组织包括肺、肝等。
本发明的配体(例如多肽、dAb和拮抗剂)可被设计为含有与第二 免疫球蛋白单可变结构域直接融合的第一免疫球蛋白单可变结构域 的融合蛋白形式。如果需要的话，这样的形式还可包含半寿期延长部 分。例如，配体可包含与第二免疫球蛋白单可变结构域直接融合的第 一免疫球蛋白单可变结构域，第二免疫球蛋白单可变结构域与结合血 清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域直接融合。
通常，具有靶标结合特异性结合位点的多肽结构域的方向和配体 是否包含接头是设计选择的问题。然而，与其它方向相比，某些方向 在有或无接头的情况下可提供更好的结合特征。所有方向(例如dAb1- 接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)都涵盖在本发明内，含有提供所需结合 特征的方向的配体可通过筛选而容易地鉴定。
可将本发明的多肽和dAb(包括dAb单体、二聚体和三聚体)与包 含CH2和CH3结构域之一或两者的抗体Fc区和任选铰链区连接。例 如，编码以单核苷酸序列形式与Fc区连接的配体的载体可用于制备 这样的多肽。
此外，本发明提供上述dAb单体的二聚体、三聚体和聚合物。
靶标：本文所用的术语“靶标”是指具有结合位点的多肽结构域 可结合的生物分子(例如肽、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物)。靶标 可以是例如胞内靶标(例如胞内蛋白靶标)、可溶性靶标(例如分泌的靶 标)或细胞表面靶标(例如膜蛋白、受体蛋白)。在一个实施方案中，靶 标是TGFbetaRII。在另一个实施方案中，靶标是TGFbetaRII胞外结 构域。
互补：本文所用的“互补”是指两个免疫球蛋白结构域属于形成 关联对或组的结构家族或源自这样的家族并保留该特征的情况。例 如，抗体的VH结构域和VL结构域是互补的；两个VH结构域不互补， 两个VL结构域也不互补。在免疫球蛋白超家族的其它成员中可发现 互补结构域，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和δ)结构域。人工结 构域，例如基于不与表位结合(除非经工程改造而与表位结合)的蛋白 支架的结构域不互补。同样，基于(例如)免疫球蛋白结构域和纤连蛋 白结构域的两个结构域不互补。
“亲和力”和“亲合力”是描述结合相互作用力的专门术语。对于 本发明的配体，亲合力是指细胞上的靶标(例如第一靶标和第二靶标) 与配体间结合的合力。亲合力大于各单个靶标的亲和力之和。
核酸分子、载体和宿主细胞：本发明也提供编码本文所述的配体 (单可变结构域、融合蛋白、多肽、双特异性配体和多特异性配体)的 分离的和/或重组的核酸分子。
本文所述的“分离的”核酸是从其初始来源(例如存在于细胞或核 酸混合物例如文库中)的基因组DNA或细胞RNA核酸中分离出来的核 酸，和包括通过本文所述的方法或其它合适方法获取的核酸，包括基本纯 的核酸，通过化学合成、通过生物和化学方法组合而产生的核酸，和分 离的重组核酸(参见例如Daugherty，B.L.等，NucleicAcids Res.，19(9)： 2471-2476(1991)；Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302 (1991))。
本文所述的“重组的”核酸是经重组DNA方法产生的核酸，包括 通过依靠人工重组的方法例如聚合酶链式反应(PCR)的步骤产生的和/ 或使用限制酶克隆到载体中的那些核酸。
在某些实施方案中，分离的和/或重组的核酸包含编码本文所述的 免疫球蛋白单可变结构域、多肽或配体的核苷酸序列，其中所述配体 包含与结合本文所公开的TGFbetaRII的dAb的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1-23中任一项所示的氨基酸序列)具有以下氨基酸序列同一性 的氨基酸序列：至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、 至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、 至少约97％、至少约98％或至少约99％。可对编码所选抗TGFbetaRII dAb的核苷酸序列全长测定核苷酸序列同一性。
本发明也提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方 案中，载体是包含与本发明的重组核酸有效连接的一个或多个表达控 制元件或序列的表达载体。本发明也提供包含本发明重组核酸分子或 载体的重组宿主细胞。产生本发明重组宿主细胞的合适载体(例如质 粒、噬菌粒)、表达控制元件、宿主细胞和方法是本领域众所周知的， 其实例在本文有进一步描述。
合适的表达载体可含有多个组分，例如复制起点、选择标记基因、 一个或多个表达控制元件、例如转录控制元件(例如启动子、增强子、 终止子)和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。可通过 载体或其它来源提供可能存在的表达控制元件和信号序列。例如，编 码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于指导表达。
可提供启动子用于在所需宿主细胞中表达。启动子可以是组成型 或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的核酸有 效连接，使得其指导核酸的转录。原核宿主(例如大肠杆菌的lac、tac、 T3、T7启动子)和真核宿主(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳 斯肉瘤病毒长末端重复启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动 子)的各种合适启动子是可用的。
另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标 记，并且在可复制表达载体的情况下，还包含复制起点。赋予抗生素 或药物抗性的产物的编码基因是常用的选择标记，并可用于原核(例如 内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)、四环素抗性的Tet基因)和真核细胞 (例如新霉素(G418或geneticin)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素 抗性基因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许在多种宿主中用甲氨蝶呤来 选择。编码宿主营养缺陷标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、 HIS3)在酵母中常用作选择标记。也预期使用病毒(例如杆状病毒)或噬 菌体载体，以及能整合到宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒载 体)。用于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞(果蝇 (Drosophila Schnieder)S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P. methanolica)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae)) 中表达的合适表达载体是本领域众所周知的。
合适的宿主细胞可以是原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌、 枯草杆菌和/或其它合适细菌；真核细胞，例如真菌细胞或酵母细胞 (例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉(Aspergillus sp.)、酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))或其它低等真核细胞；以及 高等真核生物细胞，例如来自昆虫(例如果蝇S2细胞、Sf9昆虫细胞 (WO 94/26087(O’Connor))、哺乳动物(例如COS细胞，例如COS-1 (ATCC保藏号CRL-1650)和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO (例如ATCC保藏号CRL-9096、CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77(7)：4216-4220(1980)))、293(ATCC保藏 号CRL-1573)、HeLa(ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号 CCL-70)、WOP(Dailey，L.等，J.Virol.，54：739-749(1985)、3T3、293T (Pear，W.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993))NS0 细胞、SP2/0、HuT 78细胞等，或植物(例如烟草)的细胞。(参见例如 Ausubel，F.M.等，主编Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates和John Wiley & Sons Inc.(1993))。在某些实施方 案中，宿主细胞是分离的宿主细胞，不是多细胞生物(例如植物或动物) 的一部分。在某些实施方案中，宿主细胞是非人宿主细胞。
本发明也提供产生本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性 配体)的方法，该方法包括在适合本发明重组核酸表达的条件下维持包 含该重组核酸的重组宿主细胞，由此表达该重组核酸并产生配体。在 某些实施方案中，该方法还包括分离配体。
可用于本发明实施方案的公开内容的细节可参见WO200708515 第161页第24行到第189页第10行。该公开内容通过引用结合到本 文中，如同它在本说明书文本中明确表明的一样并涉及本发明的实施 方案，并且对公开内容提供明确支持以结合到所附权利要求书中。这 包括WO200708515第161页第24行到第189页第10行所给出的公 开内容，提供“基于免疫球蛋白的配体的制备”、“文库载体系统”、“文 库构建”、“组合单可变结构域”、“配体表征”、“配体结构”、“骨架”、 “蛋白支架”、“用于构建配体的支架”、“规范序列的多样化”和“治疗和 诊断组合物和用途”的细节，以及“有效连接”、“幼稚”、“预防”、“阻 抑”、“治疗”、“变应性疾病”、“Th2-介导的疾病”、“治疗有效剂量”和“有 效”的定义。
术语“半寿期”是指免疫球蛋白单可变结构域、多肽或配体的血 清浓度在体内降低50％所需的时间，例如因天然机制所致的配体降解 和/或配体的清除或隔离。本发明的配体在体内可被稳定并且可通过与 抵抗降解和/或清除或隔离的分子结合而增加其半寿期。通常，这类分 子是天然存在的蛋白，其本身在体内就具有长半寿期。与对半寿期增 加分子不具特异性的类似配体相比，如果配体的功能活性在体内持续 时间更长，则配体的半寿期增加。因此将对HSA和靶分子具有特异 性的配体与不存在对HSA的特异性(换言之，不与HSA结合，而是与 其它分子结合)的相同配体进行比较。通常，半寿期增加10％、20％、 30％、40％、50％以上。半寿期的在2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、 40x、50x以上的范围内的增加是可能的。备选地或另外，半寿期的在 可达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x的范围内的 增加是可能的。
形式：增加的半寿期可用于免疫球蛋白、尤其是抗体和最尤其是 小尺寸的抗体片段的体内应用。这样的片段(Fv、二硫键连接的Fv、 Fab、scFv、dAb)通常从体内快速被清除。本发明的dAb、多肽或配体 可适于提供增加的体内半寿期和因此提供配体功能活性在体内的更 长持续时间。
药物动力学分析和配体半寿期测定的方法是本领域技术人员熟 知的。细节可参见Kenneth，A等：Chemical Stability of Pharmaceuticals： A Handbook for Pharmacists和Peters等，Pharmacokinetic analysis：A Practical Approach(1996)。还参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)，其描述了药物动 力学参数例如tα和tβ半寿期和曲线下面积(AUC)。
可从配体的血清浓度对时间的曲线测定半寿期(和)和 AUC。可使用例如WinNonlin分析包(可获自Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA)，以模拟曲线。在第一阶段(α阶段)，配体主要 在患者体内进行分布，并伴有一些消除。第二阶段(β阶段)是末期，此 时配体已经分布并且血清浓度随着配体从患者的清除而降低。tα半寿 期是第一阶段半寿期，而tβ半寿期是第二阶段半寿期。因此，在一 个实施方案中，本发明提供配体或包含本发明配体的组合物，其tα半 寿期范围为15分钟以上。在一个实施方案中，范围下限是30分钟、 45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、 10小时、11小时或12小时。另外或备选地，本发明的配体或组合物 的tα半寿期范围至多为并包括12小时。在一个实施方案中，范围上 限是11、10、9、8、7、6或5小时。合适范围的实例是1-6小时、2-5 小时或3-4小时。
在一个实施方案中，本发明提供配体(多肽、dAb或拮抗剂)或包 含本发明配体的组合物，其tβ半寿期范围为约2.5小时以上。在一个 实施方案中，范围下限是约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、 约7小时、约10小时、约11小时或约12小时。另外或备选地，本 发明的配体或组合物的tβ半寿期范围至多为和包括21天。在一个实 施方案中，范围上限是约12小时、约24小时、约2天、约3天、约 5天、约10天、约15天或约20天。在一个实施方案中，本发明的配 体或组合物的tβ半寿期范围为约12至约60小时。在又一实施方案中， 范围为约12至约48小时。在再一实施方案中，范围为约12至约26 小时。
另外或备选地，对于上述标准，本发明提供配体或包含本发明配 体的组合物，其AUC值(曲线下面积)范围为约1mg·min/ml以上。在 一个实施方案中，范围下限是约5、约10、约15、约20、约30、约 100、约200或约300mg·min/ml。另外或备选地，本发明的配体或组 合物的AUC范围至多约600mg·min/ml。在一个实施方案中，范围上 限是约500、约400、约300、约200、约150、约100、约75或约50 mg·min/ml。在一个实施方案中，本发明配体的AUC范围选自以下： 约15至约150mg·min/ml、约15至约100mg·min/ml、约15至约75 mg·min/ml和约15至约50mg·min/ml。
本发明的多肽和dAb以及包含它们的拮抗剂可设计成具有较大 的流体力学尺寸的形式，例如通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁 蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区，或通 过与抗体结构域缀合。例如，多肽、dAb和拮抗剂被设计为抗体的较 大的抗原结合片段或抗体形式(例如设计为Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、 IgG、scFv形式)。
本文所用的“流体力学尺寸”是指基于分子通过水溶液扩散的分 子(例如蛋白分子、配体)的表观尺寸。可处理蛋白通过溶液的扩散或 运动以得到蛋白的表观尺寸，其中由蛋白颗粒的“斯托克斯半径 (Stokes radius)”或“流体力学半径”给出其尺寸。蛋白的“流体力学 尺寸”取决于质量和形状(构象)，使得具有相同分子量的两个蛋白基 于蛋白的总体构象可具有不同的流体力学尺寸。
可使用本领域众所周知的方法测定本发明配体(例如dAb单体和 多聚体)的流体力学尺寸。例如，凝胶过滤色谱可用于测定配体的流体 力学尺寸。用于测定配体的流体力学尺寸的合适凝胶过滤基质，例如 交联琼脂糖基质，是众所周知的并可容易获得。
配体形式的尺寸(例如与dAb单体连接的PEG部分的尺寸)可视所 需应用的不同而变。例如，当希望配体离开循环并进入外周组织时， 合意的是保持低的配体的流体力学尺寸，以利于外渗出血流。备选地， 当合意的是使配体在体循环中残留较长时间时，可增加配体尺寸，例 如通过设计为Ig样蛋白形式。
通过靶向增加体内半寿期的抗原或表位使半寿期延长：如本文所 述，也可通过将本发明的TGFbetaRII结合多肽、dAb或配体与结合增 加体内半寿期的抗原或表位的结合结构域(例如抗体或抗体片段)缀合 或缔合，来增加配体的流体力学尺寸及其血清半寿期。例如，可将 TGFbetaRII结合物(例如多肽)缀合或连接至抗血清白蛋白或抗新生儿 Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、 Fab’或scFv，或者缀合或连接至抗SA亲和体或抗新生儿Fc受体亲和 体或抗SA亲合多聚体、或抗SA结合结构域，其包含选自但不限于 以下的支架：CTLA-4、脂笼蛋白(lipocallin)、SpA、亲和体、亲合多 聚体、GroEl和纤连蛋白(参见WO2008096158，其公开了这些结合结 构域，这些结构域及其序列通过引用结合到本文中并构成本文说明书 的组成部分)。缀合是指包含本发明多肽、dAb或拮抗剂的组合物，其 结合(共价或非共价)至结合结构域，例如结合血清白蛋白的结合结构 域。
通常，增加体内血清半寿期的多肽是体内天然存在的多肽并且其 抵抗通过从生物体(例如人)除去非所需物质的内源机制进行的降解或 除去。例如，增加体内血清半寿期的多肽可选自来自胞外基质的蛋白、 血液中存在的蛋白、血脑屏障或神经组织中存在的蛋白、位于肾、肝、 肺、心脏、皮肤或骨的蛋白、应激蛋白、疾病-特异性蛋白或者参与 Fc转运的蛋白。合适的多肽描述于例如WO2008/096158。
这样的方法也可用于将本发明单可变结构域、多肽或配体靶向递 送至目标组织。在一个实施方案中，提供本发明的高亲和力单可变结 构域的靶向递送。
与血清白蛋白结合的dAb：在一个实施方案中，本发明提供多肽 或拮抗剂(例如包含与TGFbetaRII结合的抗TGFbetaRII dAb(第一 dAb))和与血清白蛋白(SA)结合的第二dAb(即第二dAb结合SA)的双 特异性配体)。双特异性配体的细节见WO03002609、WO04003019、 WO2008096158和WO04058821。
在配体和拮抗剂的具体实施方案中，该dAb与人血清白蛋白结合 并与选自以下的dAb竞争与白蛋白的结合：公开于WO2004003019 的任何dAb序列(这些序列及其核酸对应物通过引用结合到本文中并 构成本文说明书的组成部分)、公开于WO2007080392的任何dAb序 列(这些序列及其核酸对应物通过引用结合到本文中并构成本文说明 书的组成部分)、公开于WO2008096158的任何dAb序列(这些序列及 其核酸对应物通过引用结合到本文中并构成本文说明书的组成部分)。
在某些实施方案中，该dAb与人血清白蛋白结合，并包含与 WO2004003019、WO2007080392或WO2008096158的任一项中所述 的dAb氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至 少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，与人血清白蛋白结 合的dAb可包含与这些dAb中任一个的氨基酸序列具有至少约90％、 或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至 少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，该dAb 与人血清白蛋白结合，并包含与这些dAb中任何氨基酸序列的氨基酸 序列具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、 或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸 序列同一性的氨基酸序列。
在更具体的实施方案中，该dAb是与人血清白蛋白结合的VκdAb。在更具体的实施方案中，该dAb是与人血清白蛋白结合的VHdAb。
与血清白蛋白结合的合适的骆驼类VHH包括公开于WO 2004041862(Ablynx N.V.)和WO2007080392的那些(这些VHH序列及 其核酸对应物通过引用结合到本文中并构成本文说明书的组成部分)。 在某些实施方案中，骆驼类VHH与人血清白蛋白结合，并包含与公 开于WO2007080392的那些序列或SEQ ID NO：518-534(这些序列编 号对应于WO2007080392或WO 2004041862所用的编号)中任一项具 有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至 少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。
在一个备选实施方案中，拮抗剂或配体包含TGFbetaRII(例如人 TGFbetaRII)特异性结合部分，其中所述部分包含WO2008096158所述 的非免疫球蛋白序列，这些结合部分、其产生和选择方法(例如来自多 种文库)及其序列的公开内容通过引用结合到本文中，作为本文说明书 的组成部分)。
与半寿期延长部分(例如白蛋白)的缀合：在一个实施方案中，(一 个或多个)半寿期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段和类似物) 与本发明的TGFbetaRII结合多肽、dAb或拮抗剂缀合或缔合。用于 TGFbetaRII结合形式的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例 描述于WO2005077042，其公开内容通过引用结合到本文中并构成本 文说明书的组成部分。
用于TGFbetaRII结合形式的合适白蛋白、片段和类似物的更多 实例描述于WO 03076567，其公开内容通过引用结合到本文中并构成 本文说明书的组成部分。
当将(一个或多个)半寿期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片 段和类似物)用于设计本发明的TGFbetaRII结合多肽、dAb和拮抗剂 形式时，可使用任何合适的方法将其缀合，所述方法例如通过直接融 合至TGFbetaRII-结合部分(例如抗TGFbetaRII dAb)，例如通过使用编 码融合蛋白的单核苷酸构建体，其中所述融合蛋白被编码为单多肽 链，其中半寿期延长部分位于TGFbetaRII结合部分的N端或C端。 备选地，可通过在各部分间使用肽接头例如WO 03076567或WO 2004003019所述的肽接头(这些接头的公开内容通过引用结合到本说 明书中，以提供用于本发明的实例)而完成缀合。
与PEG缀合：在其它实施方案中，半寿期延长部分是聚乙二醇 部分。在一个实施方案中，拮抗剂包含(任选由其组成)与聚乙二醇部 分连接的本发明单可变结构域(任选地，其中所述部分的大小为约20 至约50kDa、任选约40kDa直链或支链PEG)。dAb和结合部分的PEG 化的更多细节参见WO04081026。在一个实施方案中，拮抗剂由与PEG 连接的dAb单体组成，其中dAb单体是本发明的单可变结构域。
在另一个实施方案中，可将本发明的单可变结构域、配体或多肽 与毒素部分或毒素连接。
蛋白酶抗性：本发明的单可变结构域、多肽或配体可经修饰以改 善其对蛋白酶降解的抗性。本文所用的“对蛋白酶降解具有抗性的” 肽或多肽(例如结构域抗体(dAb))在适于蛋白酶活性的条件下与蛋白 酶一起温育时基本上不被蛋白酶降解。当在适于蛋白酶活性的温度例 如在37或50度下与蛋白酶一起温育约1小时后，不超过约25％、不 超过约20％、不超过约15％、不超过约14％、不超过约13％、不超过 约12％、不超过约11％、不超过约10％、不超过约9％、不超过约8％、 不超过约7％、不超过约6％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约 3％、不超过约2％、不超过约1％的蛋白或基本上没有蛋白被蛋白酶 降解时，多肽(例如dAb)基本上不被降解。可使用任何合适的方法例 如通过SDS-PAGE或通过本文所述的功能测定(例如配体结合)评价蛋 白降解。
产生蛋白酶抗性增强的dAb的方法公开于例如WO2008149143。 在一个实施方案中，本发明的单可变结构域、多肽或配体抵抗 leucozyme和/或胰蛋白酶的降解。本发明的多肽、免疫球蛋白单可变 结构域和配体可抵抗以下的一种或多种酶：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸 蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、基质金属蛋白酶、羧肽酶(例 如羧肽酶A、羧肽酶B)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜 蛋白酶、弹性蛋白酶、leukozyme、胰酶制剂、凝血酶、纤溶酶、组织 蛋白酶(例如组织蛋白酶G)、蛋白酶(例如蛋白酶1、蛋白酶2、蛋白 酶3)、嗜热菌蛋白酶、凝乳酶、肠肽酶、胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶 1、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶5、胱天蛋白酶9、胱 天蛋白酶12、胱天蛋白酶13)、钙激活中性蛋白酶、无花果蛋白酶 (ficain)、梭菌蛋白酶、奇异果蛋白酶(actinidain)、菠萝蛋白酶和分离 酶。在具体的实施方案中，蛋白酶为胰蛋白酶、弹性蛋白酶或 leucozyme。蛋白酶还可通过生物提取物、生物匀浆化物或生物制备物 提供。在一个实施方案中，蛋白酶为存在于痰、粘液(例如胃粘液、鼻 粘液、支气管粘液)、支气管肺泡灌洗液、肺匀浆化物、肺提取物、胰 腺提取物、胃液、唾液中的蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶为存 在于眼睛和/或泪液中的蛋白酶。这种存在于眼中的蛋白酶的实例包括 胱天蛋白酶、钙激活中性蛋白酶、基质金属蛋白酶、解联蛋白、金属 蛋白酶(ADAM)和具有血小板反应蛋白基序的ADAM、蛋白体、组织 纤溶酶原激活物、分泌酶、组织蛋白酶B和D、抑半胱氨酸蛋白酶蛋 白C、丝氨酸蛋白酶PRSS1、泛素蛋白酶体途径(UPP)。在一个实施 方案中，蛋白酶为非细菌蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶为动物 (例如哺乳动物，例如人)蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶为GI道 蛋白酶或肺组织蛋白酶，例如存在于人体中的GI道蛋白酶或肺组织 蛋白酶。本文所列举的这样的蛋白酶还可以用于例如WO2008149143 所述方法，包括将文库所有成员与蛋白酶接触。
稳定性：在本发明的一方面，本发明的多肽、单可变结构域、dAb、 配体、组合物或制剂(在多肽或可变结构域浓度为1mg/ml时)在Britton Robinson或PBS缓冲液中在37-50℃温育14天之后基本稳定。在一 个实施方案中，至少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99％的多肽、拮抗剂或可变结构域等在37 ℃的这样的温育之后仍然不聚集。在一个实施方案中，至少65、70、 75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99％的多肽或可变结构域在37℃的这样的温育之后仍然是单体。
在一个实施方案中，至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99％的多肽、拮抗剂或可变结构域在50℃的这 样的温育之后仍然不聚集。在一个实施方案中，至少5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、 88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的多肽或可变结构 域在50℃的这样的温育之后仍然是单体。在一个实施方案中，在任一 种这样的温育之后，未观察到多肽、可变结构域、拮抗剂的聚集。在 一个实施方案中，在多肽或可变结构域浓度为1mg/ml时在Britton Robinson缓冲液中在37℃温育之后，多肽或可变结构域的pI保持不 变或基本不变。在本发明的一方面，本发明的多肽、可变结构域、拮 抗剂、组合物或制剂(在多肽或可变结构域浓度为100mg/ml时)在 Britton Robinson缓冲液或PBS中在pH 7-7.5(例如pH7或pH7.5)在4℃ 温育7天之后基本稳定。在一个实施方案中，至少95、95.5、96、96.5、 97、97.5、98、98.5、99或99.5％的多肽、拮抗剂或可变结构域在这 样的温育之后仍然不聚集。在一个实施方案中，至少95、95.5、96、 96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5％的多肽或可变结构域在这样的 温育之后仍然是单体。在一个实施方案中，在任一种这样的温育之后， 未观察到多肽、可变结构域、拮抗剂的聚集。
在本发明的一方面，本发明的多肽、可变结构域、拮抗剂、组合 物或制剂(例如在多肽或可变结构域浓度为40mg/ml时)在喷雾之后基 本稳定，喷雾例如在室温、20℃或37℃喷雾1小时，例如用喷射式 喷雾器，例如在百瑞LC+杯(Pari LC+cup)中。在一个实施方案中，至 少65、70、75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、 96、96.5、97、97.5、98、98.5、99或99.5％的多肽、拮抗剂或可变结 构域在这样的喷雾之后仍然不聚集。在一个实施方案中，至少65、70、 75、80、85、86、87、88、90、91、92、93、94、95、95.5、96、96.5、 97、97.5、98、98.5、99或99.5％的多肽或可变结构域在这样的喷雾 之后仍然是单体。在一个实施方案中，在任一种这样的喷雾之后，未 观察到多肽、可变结构域、拮抗剂的聚集。
单体形式：在一个实施方案中，本发明的dAb以单体形式提供。 适宜地，本发明提供(基本)纯的单体。在一个实施方案中，dAb是至 少98、99、99.5％纯或100％纯的单体。为了测定dAb在溶液中是单 体还是形成更高等级的寡聚体，可通过SEC-MALLS对其进行分析。 SEC MALLS(大小排阻层析-多角度激光散射)是用于表征溶液中的大 分子的无损伤技术。简而言之，通过大小排阻层析(柱：TSK3000； S200)，按照其流体力学性质来分离蛋白(浓度为1mg/mL，在缓冲液 Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中)。分离之后，使用多角度激光散射 (MALLS)检测器测量蛋白对散射光的倾向。测量蛋白通过检测器时的 散射光强度作为角度的函数。该测量以及使用折射率(RI)检测器所测 的蛋白浓度，使得能够使用合适的公式(分析软件Astra v.5.3.4.12的组 成部分)计算分子量。
治疗用途：本发明提供用于治疗、阻抑或预防TGFbeta信号转导 相关疾病的方法。在一个实施方案中，这样的疾病可归因于异常调节 的TGFbeta信号转导、TGFbeta的过量表达或高水平的生物可利用的 TGFbeta或由其引起。TGFbeta信号转导相关疾病包括涉及不同组织 纤维化的疾病，例如肺纤维化包括特发性肺纤维化(IPF)和其它间质性 肺病例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、肝纤维化包括肝硬化和慢性肝 炎、类风湿性关节炎、眼病、血管病症例如再狭窄、皮肤纤维化包括 伤口愈合之后的皮肤瘢痕瘤和疤痕化、以及肾的纤维化例如肾炎、肾 纤维化和肾硬化或血管病症例如再狭窄。其它TGFbeta信号转导相关 疾病包括血管病例如高血压、先兆子痫、遗传性出血性毛细血管扩张 I型(HHT1)、HHT2、肺动脉高血压、主动脉瘤、马方综合征、家族型 动脉瘤病、Loeys-Dietz综合征、动脉血管纡曲综合征(ATS)。其它 TGFbeta信号转导相关疾病包括肌肉骨骼系统疾病，例如杜兴肌营养 不良和肌纤维化。更多TGFbeta信号转导相关疾病包括癌症，例如结 肠癌、胃癌和胰腺癌、以及神经胶质瘤和NSCLC。另外，本发明提 供靶向癌症的方法，例如通过在肿瘤血管生成中调节TGFbeta信号转 导或通过治疗癌症基质。其它疾病或病症包括组织疤痕化相关的疾病 或病症。其它疾病包括肺病例如COPD(慢性阻塞性肺病)、肝病例如 肝衰竭(例如病毒性肝炎、酒精性、肥胖性、自身免疫性、代谢性、阻 塞性)、肾病包括肾衰竭(例如糖尿病、高血压)、肥厚性心肌病、移植 排斥(肺/肝/肾)和肥厚性疤痕化和瘢痕瘤疤痕化。
“纤维化”是胞外基质组分例如胶原的过量沉积的结果，导致组织 的过度生长、疤痕化和/或硬化。
已经观察到TGFbeta在肺纤维化中的作用(Wynn等，J.Pathology 2008，214，第199-210页；Sime等.J.Clinical Immunology 1997，第 100卷，第768-776页)。观察到由增加Th2细胞因子的产生到降低的 Th1细胞因子的产生的转换，作为未知肺损伤的结果。TGFbeta的过 量表达刺激血管生成、成纤维细胞激活、ECM沉积和纤维发生。动物 模型(例如TGFbeta过量表达、SMAD3KO、TGFbetaR信号转导的抑 制)显示TGFbeta是肺纤维化发展的关键介质。
“特发性肺纤维化(IPF)”是导致肺间质中不明原因的纤维化组织 异常和过量沉积的慢性和进行性疾病。在美国每年的发病率约为每十 万人10-20例。患病率随年龄急剧增加，在超过75岁的年龄达到每十 万人175例，通常在50-70岁之间发病。5年存活率为20％，平均存 活时间为2.8年。症状包括干咳和进行性气喘、异常胸部X光或HRCT 和肺体积缩小。目前的治疗包括皮质类固醇(泼尼松)、免疫抑制剂(环 磷酰胺)或移植，但是现有可用治疗都没有已证实的功效。在一个实施 方案中，本发明的单可变结构域或多肽提供对IPF的治疗。
适宜地，对特发性肺纤维化(IPF)的成功治疗将显示以下的任一 项：肺成纤维细胞增生的减少、肺成纤维细胞凋亡的增加、过量胞外 基质合成和沉积的减少、胞外基质分解和重塑的增加，或者将显示出 针对进行性组织损伤的某些保护和正常组织病理学的恢复。
适宜地，成功的治疗将减缓疾病进展。
在博来霉素诱导的肺纤维化模型中可证明对IPF的治疗功效。在 一个实施方案中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域与小鼠 TGFbetaRII交叉反应，使得其功效可在小鼠模型中测试。
TGFbeta是眼组织的细胞行为调节中的重要的细胞信号转导分 子。TGFbeta的过度活化涉及眼组织纤维化疾病的发病机理，其可以 是伤口愈合相关的并导致视觉和眼组织稳态受损(综述可参见例如 Saika，Laboratory Investigation(2006)，86，106-115)。
因此，在一个实施方案中，TGFbeta信号转导相关疾病包括眼病， 例如眼组织的纤维化疾病。眼的纤维化疾病可发生在角膜、结膜、晶 状体或视网膜。眼病包括增生性玻璃体视网膜病变(PVR)(一种视网膜 脱离后和视网膜纤维化的疾病)、糖尿病性视网膜病、青光眼(例如开 角型青光眼、闭角型青光眼、先天性青光眼)和假性剥脱综合征、晶状 体中的伤口愈合反应(例如化学灼伤或热灼伤后)、或Stevens-Johnson 综合征和白内障术后并发症。TGFbeta在白内障的发展中也起作用 (Wormstone等.Exp Eye Res；831238-1245，2006)。多种眼病的发生是 术后纤维化的结果。另外，认为在青光眼滤过手术后，TGFbeta2(转 化生长因子β2)的过度活性在眼中或周围引起疤痕化。TGFbeta2是参 与眼组织(包括角膜、视网膜、结膜和小梁网(trabelular meshwork))的 病理性疤痕化的主要同种型。小梁网的疤痕化或纤维化可导致正常泪 水流出途径受阻，致使眼内压升高并增加青光眼发展的风险。TGFbeta 2在青光眼疾病的临床前模型中已经证明是病理物质。在青光眼患者 中TGFbeta2水平升高，用TGFbeta-2体外治疗huTM细胞导致ECM 调节蛋白(MMP-2，PAI-I)的表型改变和上调(Lutjen-Drecol(2005)， Experimental Eye Research，第81卷，第1期，第1-4页；Liton(2005)， Biochemical and Biophysical Research Communications第337卷，第4 期，第1229-1236页；Fuchshofer等(2003)，Experimental Eye Research， 第77卷，第6期，第757-765页；Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)会议招贴(conference poster)#1631 2009)。此 外，TGFbeta在眼中的过量表达在小鼠中导致青光眼样病理学(ARVO 会议招贴#5108 2009)，并且使用AAV来递送TGFbeta-2在青光眼的 大鼠模型中已经证明抑制视网膜神经节细胞损失(ARVO会议招贴 #5510 2009)。新近，已经证明在培养的人视神经乳头星形胶质细胞中 的氧化应激诱导增加TFGbeta2的分泌(Yu等(2009)Invest.Ophthalmol. Vis.Sci.50：1707-1717)。这一切都表明TGFbeta 2水平的降低可使青 光眼中所见的特征性视神经乳头变化最小化。然而，已知TGFbeta也 具有免疫抑制功能并因此在某些方面可以是保护性的，因此降低 TGFbeta2的高水平而非完全敲减，在慢性眼病例如青光眼的治疗中可 能是优选的。因此，使用本发明的dAb和组合物等可治疗的疾病包括 青光眼滤过手术后的疤痕化。
因此，在一方面提供治疗、阻抑或预防TGFbeta信号转导、尤其 是异常调节的TGFbeta信号转导相关疾病的方法，所述方法包括将治 疗有效剂量或量的本发明多肽、融合蛋白、单可变结构域、拮抗剂或 组合物给予有需要的哺乳动物。
另一方面，本发明提供用作药物的本发明的免疫球蛋白单可变结 构域、多肽、配体或融合蛋白。合适的药物可包含如上所述地设计的 本发明免疫球蛋白单可变结构域等。
适宜地，药物是药物组合物。在本发明的再一方面，提供组合物 (例如药物组合物)，其包含本发明多肽、单可变结构域、配体、组合 物或拮抗剂以及生理学上或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。 在一个实施方案中，组合物包含用于递送的载体。在具体的实施方案 中，将多肽、融合蛋白、单可变结构域、拮抗剂或组合物通过以下途 径给予：通过肺部递送，例如通过吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸 入、鼻内例如通过滴剂)或通过系统递送(例如胃肠外、静脉内、肌内、 腹膜内、动脉内、鞘内、关节内、皮下、阴道或直肠给予)。在另一个 实施方案中，将本发明的多肽、单可变结构域、配体或融合蛋白或组 合物给予眼，例如通过局部给予，作为滴眼剂、颗粒聚合物系统、凝 胶或植入物，或通过眼内注射例如注射到玻璃体液中。递送可靶向眼 的特定区域，例如眼表面或泪管或泪腺，或靶向眼前房或后房(例如玻 璃体液)。如果将免疫球蛋白单可变结构域、组合物等连同眼渗透促进 剂(例如癸酸钠)或粘度促进剂(例如羟丙甲基纤维素(HPMC)递送至 眼，则也可以是有用的。
此外，本发明提供使用本发明的多肽、单可变结构域、组合物、 配体或拮抗剂来治疗疾病的方法。在一个实施方案中，疾病是组织纤 维化，例如肺纤维化，包括特发性肺纤维化。在另一个实施方案中， 疾病是眼病。
在本发明的一个方面，提供多肽、单可变结构域、配体、组合物 或拮抗剂用于治疗和/或预防人的TGFbeta信号转导相关疾病或病症。 另一方面，提供多肽、单可变结构域、组合物或拮抗剂在制备用于治 疗或预防人的TGFbeta信号转导相关疾病或病症的药物中的用途。另 一方面，提供治疗和/或预防人患者中的TGFbeta信号转导相关疾病或 病症的方法，该方法包括将多肽、单可变结构域、组合物或拮抗剂给 予患者。本发明也涉及治疗方法，其包括将治疗有效量的本发明配体 (例如拮抗剂或单可变结构域)给予有需要的受试者。
在其它实施方案中，本发明涉及治疗特发性肺纤维化的方法，其 包括给予有需要的受试者治疗有效量的本发明配体(例如拮抗剂或单 可变结构域)。
本发明也涉及包含本发明组合物(例如药物组合物)的药物递送装 置。在某些实施方案中，药物递送装置包含多个治疗有效剂量的配体。
在其它实施方案中，药物递送装置选自胃肠外递送装置、静脉内 递送装置、肌内递送装置、腹膜内递送装置、透皮递送装置、肺部递 送装置、动脉内递送装置、鞘内递送装置、关节内递送装置、皮下递 送装置、鼻内递送装置、眼内递送装置、阴道递送装置、直肠递送装 置、注射器、透皮递送装置、胶囊、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、 烟雾器、弥雾器(mister)、干粉吸入器、计量剂量吸入器、计量剂量喷 雾器、计量剂量弥雾器、计量剂量雾化器和导管。
适宜地，本发明提供含有本发明多肽、单可变结构域、组合物或 拮抗剂的肺部递送装置。装置可以是吸入器或鼻内给予装置。适宜地， 肺部递送装置可递送治疗有效剂量的本发明配体等。
在另一个实施方案中，本发明提供含有本发明多肽、单可变结构 域、组合物或拮抗剂的眼部递送装置。适宜地，眼部递送装置可递送 治疗有效剂量的本发明配体等。
本文所用的术语“剂量”是指一次性全部(单位剂量)或以在限定 时间间隔内两次以上的给予来给予受试者的配体量。例如，剂量可指 在1天(24小时)(日剂量)、2天、1周、2周、3周或一个或多个月(例 如通过单次给予或通过两次以上给予)的期间内给予受试者的配体(例 如包含与TGFbetaRII结合的免疫球蛋白单可变结构域的配体)的量。 剂量间的间隔可以是任何所需的时间量。
在一个实施方案中，本发明的单可变结构域以dAb单体形式提 供，任选未经设计形式(例如不是PEG化的或半寿期延长的)或与PEG 连接，任选作为干粉制剂，任选用于通过吸入(例如肺部递送)递送给 患者，任选用于治疗和/或预防肺病(例如特发性肺纤维化)。
本发明的配体提供若干优势。例如，如本文所述，该配体可经剪 裁而具有所需体内血清半寿期。结构域抗体比常规抗体小得多，与常 规抗体相比，给予结构域抗体可达到更好的组织渗透。因此，当给予 以治疗疾病例如TGFbeta信号转导介导的疾病时，dAb和包含dAb的 配体提供优于常规抗体的优势。具体地讲，肺部递送本发明的dAb以 治疗特发性肺纤维化，使能够特异性局部递送TGFbeta信号转导的抑 制剂。有利的是，特异性结合并抑制TGFbetaRII的未经设计形式的 dAb单体足够小，以通过肺部递送而被吸收到肺中。
WO2007085815的实例通过引用结合到本文中，以提供同样可用 于本发明配体的相关测定、形式设计和实验的细节。
在以下的实施例中，进一步描述本发明仅用于举例说明的目的。
实施例
实施例1.选择与TGFbetaRII结合的dAb
幼稚选择：使用4G和6G幼稚噬菌体文库、对于4G而言噬菌体 文库展示从GAS1前导序列表达的抗体单可变结构域(参见 WO2005093074)和对于6G而言还进一步经过热/冷预选(参见 WO04101790)。通过针对重组人TGF-βRII/Fc嵌合蛋白(R&D systems， Abingdon，UK，目录号341-BR)淘选VH和VK文库(鉴定为4G H11-19 和6G VH2-4(VH dAb)和4Gκ1、4Gκ2和6Gκ(VκdAb)的合并物， 分离DOM23h先导序列。该嵌合蛋白是通过在小鼠骨髓瘤细胞系NS0 中表达编码与人IgG1的Fc区融合的人TGF-β受体II型(Lin等，1992， Cell 68：775-785)的159个氨基酸残基的胞外结构域的DNA序列而制 备。
将重组人TGF-βRII/Fc嵌合蛋白固定在MaxisorpTM免疫管(Nunc， Denmark)上，即通过在4℃用10μg/ml抗原的磷酸缓冲盐水(PBS)对 该管包被过夜，用于第一轮淘选。免疫管用PBS洗涤3次，然后通过 用PBS中的2％Marvel奶粉(MPBS)将管子填充至溢出并在室温下温 育至少1小时，将管子封闭以防止噬菌体的非特异性结合。将噬菌体 文库合并为6组；4G κ1和κ2、6G κ、4G H11-13、4G H14-16、4G H17-19 和6G VH2-4。每文库合并1x1011噬菌体。将噬菌体在4ml 2％MPBS 中在室温下温育1小时。已封闭的免疫管用PBS洗涤3次。将已封闭 的噬菌体合并物转移到免疫管并在室温下旋转温育至少1小时。免疫 管用含有0.1％吐温-20的PBS(PBST)洗涤10次，然后用0.5ml 1mg/ml 胰蛋白酶的PBS洗脱结合的噬菌体。
使用包被有10μg/ml人TGF-βRII/Fc的免疫管进行第二轮淘选。 如上所述地将输入噬菌体合并成每合并物含有1x1010噬菌体，并在添 加50μg/ml对照Fc片段的0.5ml 2％MPBS中封闭。噬菌体在室温下 封闭1小时。将3.5ml MPBS加入到噬菌体中，再将其转移到已封闭 的免疫管并在室温下温育至少1小时。免疫管用PBST洗涤20次，然 后用0.5ml1mg/ml胰蛋白酶的PBS洗脱结合的噬菌体。
使用包被有1μg/ml人TGF-βRII/Fc的免疫管进行第三轮淘选。 如上所述地将输入噬菌体合并，除了将6G κ和4G κ1和κ2输入噬菌 体合并在一起之外。噬菌体在添加有100μg/ml人IgG Fc片段(来自 人骨髓瘤血浆IgG的天然IgG Fc片段，Calbiochem，California，US，目 录号401104)的4ml 2％MPBS中封闭至少1小时。免疫管用PBST洗 涤20次，然后用0.5ml 1mg/ml胰蛋白酶的PBS洗脱结合的噬菌体。 将第二和第三轮输出从fd-噬菌体载体pDOM4克隆到pDOM10中。 载体pDOM4是fd噬菌体载体衍生物，其中基因III信号肽序列被酵 母糖脂锚定表面蛋白(GAS)信号肽替代。它还在前导序列和基因III间 含有c-myc标签，其将基因III放回框内。该前导序列在噬菌体展示载 体中以及其它原核表达载体中良好地起作用，可普遍使用。pDOM10 是设计用于dAb的可溶性表达的质粒载体。它是基于pUC119载体， 其表达处于LacZ启动子控制之下。通过将dAb基因与通用GAS前导 信号肽(参见WO2005093074)在N末端融合，确保将dAb表达到上清 液中。另外，将FLAG标签添加在dAb的C末端。按照制造商的使 用指南使用QIAprep Spin MiniprepTM试剂盒(目录号27104，Qiagen)， 通过从感染所选dAb展示fd-噬菌体的细胞中分离pDOM4 DNA，进 行dAb基因的亚克隆。使用生物素化寡核苷酸DOM57 (5’-TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3’(SEQ ID NO：47)和DOM6 (5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO：48)，通过 PCR扩增DNA，用SalI和NotI限制酶消化并与经SalI和NotI消化的 pDOM10连接。通过电穿孔将连接产物转化到大肠杆菌HB2151细胞 中，并接种在添加有100μg/ml羧苄西林(TYE-carb)的TYE平板(胰蛋 白胨酵母浸膏)上。挑取单个克隆并在96孔板中在250rpm、37℃、 在添加有100μg/ml羧苄西林的0.2ml/孔的过夜表达自我诱导培养基 (高水平蛋白表达系统，Novagen)中表达过夜。再将这些板在1800g离 心10分钟。
通过ELISA鉴定与人TGF-βRII/Fc结合的dAb克隆。在4℃将 96孔MaxisorpTM免疫板(Nunc，Denmark)用人TGF-βRII/Fc包被过夜。 各孔用PBST洗涤3次，再用1％吐温的PBS(1％TPBS)在室温下封闭 1小时。除去封闭液，并加入1％TPBS和dAb上清液的1∶1混合物， 在室温下持续1小时。板用PBST洗涤3次，加入检测抗体(单克隆抗 FLAG M2-过氧化物酶抗体，Sigma-aldrich，UK)并在室温下温育1小 时。使用比色底物(SureBlue单组分TMB Microwell过氧化物酶溶液， KPL，Maryland，USA)使各板显色，并在450nM处测量光密度(OD)， OD450与结合的检测抗体量成比例。
在如上所述地进行的第二次证实性ELISA中重新测试阳性结合 物。在ELISA中鉴定的人TGF-βRII/Fc结合dAb在过夜表达自我诱 导培养基(OnEx，Novagen)中在30℃表达48-72小时，或在37℃表达 24小时。将培养物离心(4,600rpm，30分钟)，并将上清液与Streamline- 蛋白A珠(Amersham Biosciences，GE Healthcare，UK.结合能力：每毫 升珠结合5mg dAb)在4℃温育过夜或在室温下温育2小时。然后将 珠填入Unifilter 96孔板(Whatman，GE Healthcare，UK)中并用2x PBS (400μl/孔)洗涤，接着在室温下在1000rpm离心2分钟。洗涤过程用 2x PBS再重复一次，接着用10mM Tris-HCl pH 8.0(Sigma，UK)进行 最后一次洗涤。通过加入0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.0(210μl/孔)(Sigma， UK)洗脱结合的dAb，然后离心。流出物(flow through)收集于放在 Unifilter板之下的96孔圆底板(Corning Costar)中。96孔圆底板的各孔 含有40μl1M Tris pH 8.0(Sigma，UK)，以便中和洗脱的dAb。将洗脱 过程再重复一次。或者，将streamline-蛋白A珠填入色谱柱中并用 2xPBS洗涤，再用10mM Tris-HCl pH 7.4(Sigma，UK)洗涤。结合的 dAb用0.1M甘氨酸-HCl pH 2.0洗脱，并用1M Tris pH 8.0中和。测 量dAb在280nm处的OD，并使用由dAb氨基酸组成求出的消光系 数测定蛋白浓度。
如在A549IL-11释放测定中测量地测试dAb的效能，并如通过 SEC-MALLS和DSC评价地测试其生物物理特征(如下所述)。选择 DOM23h-33(SEQ ID NO：1)、DOM23h-251(SEQ ID NO：2)、 DOM23h-262(SEQ ID NO：3)、DOM23h-271(SEQ ID NO：4)、 DOM23h-348(SEQ ID NO：5)、DOM23h-435(SEQ ID NO：6)、 DOM23h-436(SEQ ID NO：7)、DOM23h-437(SEQ ID NO：8)、 DOM23h-438(SEQ ID NO：9)、DOM23h-439(SEQ ID NO：10)和 DOM23h-440(SEQ ID NO：11)文库，用于易错亲和力成熟。
实施例2.易错亲和力成熟
进行DOM23h-33(SEQ ID NO：1)、DOM23h-251(SEQ ID NO：2)、 DOM23h-262(SEQ ID NO：3)、DOM23h-271(SEQ ID NO：4)、 DOM23h-348(SEQ ID NO：5)、DOM23h-435(SEQ ID NO：6)、 DOM23h-436(SEQ ID NO：7)、DOM23h-437(SEQ ID NO：8)、 DOM23h-438(SEQ ID NO：9)、DOM23h-439(SEQ ID NO：10)和 DOM23h-440(SEQ ID NO：11)的易错诱变，以改善这些dAb的亲和 力。
噬菌体文库构建：使用GeneMorphII随机诱变试剂盒 (Stratagene，目录号200550)，制备DOM23h-33(SEQ ID NO：1)、 DOM23h-251(SEQ ID NO：2)、DOM23h-262(SEQ ID NO：3)、 DOM23h-271(SEQ ID NO：4)、DOM23h-348(SEQ ID NO：5)、 DOM23h-435(SEQ ID NO：6)、DOM23h-436(SEQ ID NO：7)、 DOM23h-437(SEQ ID NO：8)、DOM23h-438(SEQ ID NO：9)、 DOM23h-439(SEQ ID NO：10)和DOM23h-440(SEQ ID NO：11)的易 错文库。使用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸DOM008 (5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ ID NO：49))和 DOM009(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO： 50))，通过PCR扩增靶dAb基因，然后用寡核苷酸DOM172(5’ TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3’(SEQ ID NO：51))和DOM173 (5’-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3’(SEQ ID NO：52))和按照 制造商的使用指南使用MutazymeTM II DNA聚合酶，进行稀释PCR 产物的再次扩增。使用Taq DNA聚合酶和寡核苷酸DOM172和 DOM173进一步扩增该PCR产物，以增加DNA产物的产量。PCR产 物用Sal I和Not I限制酶消化。使用链霉抗生物素珠(Dynal Biotech， UK)从消化产物中除去未消化产物和消化末端。将消化产物连接到经 Sal I和Not I限制酶消化的pDOM4噬菌体载体中，并用于转化大肠 杆菌TB1细胞。将转化的细胞接种在添加有15μg/ml四环素的2x TY 琼脂上，得到＞1×107转化体的文库大小。
易错选择：用DOM23h-33、DOM23h-251、DOM23h-262、 DOM23h-271和DOM23h-348文库分别针对100、5、0.5和0.1nM生 物素化人TGF-βRII/Fc进行4轮选择。用DOM23h-435、DOM23h-436、 DOM23h-437、DOM23h-438、DOM23h-439和DOM23h-440易错文库 分别针对100、10、1和0.1nM生物素化人TGF-βRII/Fc进行4轮选 择。将人TGF-βRII/Fc生物素化，使用5倍摩尔过量的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂(Pierce，Rockford，USA)(Henderikx等，2002， Selection of antibodies against biotinylated antigens(针对生物素化抗原 选择抗体).Antibody Phage Display：Methods and protocols，O′Brien和 Atkin编著，Humana Press)。将第三和第四轮选择输出亚克隆到 pDOM10载体中，如上所述。挑取单个克隆并在96孔板中在850rpm、 37℃、90％湿度、在添加有100μg/ml羧苄西林的0.5ml/孔的过夜表 达自我诱导培养基中表达24小时。然后将这些板在1800g离心10分 钟。上清液在HBS-EP缓冲液中稀释1/5或1/2，并在BiacoreTM上筛 选与生物素化人TGF-βRII/Fc的结合(按照制造商的建议包被1000Ru 生物素化hRII-Fc的SA芯片)(BiacoreTM，GE Healthcare)。样品在 Biacore上运行，流速50μl/min。将与亲代克隆相比以高数量共振单 位(RU)或以改善的脱离率(off-rate)结合的克隆在50ml过夜表达自我 诱导培养基中在30℃表达48-72小时，并在4,600rpm离心30分钟。 将上清液在4℃与Streamline-蛋白A珠一起温育过夜。然后将珠填入 drip柱中，用5倍柱体积的2xPBS洗涤，再用1倍床体积的10mM Tris-HCl pH 7.4洗涤，结合的dAb在0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.0中洗脱 并用1M Tris-HCl，pH 8.0中和。测量dAb在280nm处的OD，并使 用由dAb氨基酸组成求出的消光系数测定蛋白浓度。
实施例3.将K61N D64R突变引入dAb序列
将D61N和K64R双重突变引入属于DOM23h-271、437和439 谱系的dAb，以改善效能。用DOM23h-262易错噬菌体文库进行的选 择中分离含有这些突变的dAb，并如A549IL-11释放测定所测量地， 发现比DOM23h-262(SEQ ID NO：3)更具效力。相对于DOM23h-262 (SEQ ID NO：3)，在DOM23h-262-6(SEQ ID NO：12)中D61N(以及 Y102H)的存在改善dAb效能达54倍，而相对于DOM23h-262(SEQ ID NO：3)，在DOM23h-262-10(SEQ ID NO：13)中D61N和K64R(以及 Q39R、E53D和W103S)的存在改善效能达540倍，如A549IL-11释 放测定中所测定的(表1)。
使用聚合酶链式反应(PCR)，通过重叠延伸将突变引入属于 DOM23h-271、DOM23h-437和DOM23h-439谱系的dAb(Ho等，Gene 1989 77(1))；互补寡核苷酸引物用于产生具有重叠或互补末端的两个 DNA片段。在后续装配PCR中将这些片段组合，其中重叠末端退火， 使每条链的3′重叠能够作为引物，用于互补链的3′延伸，并将所得融 合产物经PCR进一步扩增。可通过将核苷酸改变掺入到重叠寡核苷酸 引物中来引入核苷酸序列中的特定改变。使用Taq DNA聚合酶和寡 核苷酸对DOM008(侧接dAb基因的5’开始)和CD131 (5’-GAACCGGCCCCTCACGGAGTTTGCGTAGTA-3’(SEQ ID NO： 53))或DOM009(侧接dAb基因的3’端)和CD130 (5’-TACTACGCAAACTCCGTGAGGGGCCGGTTC-3’(SEQ ID NO： 54))(突变核苷酸残基有下划线)，通过两次单独的PCR扩增靶dAb基 因片段。在装配PCR中使用Taq DNA聚合酶在不加引物的情况下将 两个PCR片段重新组合。然后通过将侧翼引物DOM008和DOM009 加到PCR反应中扩增融合产物。PCR产物用Sal I和Not I限制酶消化 并连接到经Sal I和Not I限制酶消化的pDOM10或13表达载体中， 然后用于转化大肠杆菌HB2151细胞。pDOM13表达载体具有与 pDOM10相同的核苷酸序列，只是FLAG表位核苷酸序列被两个终止 密码子(5’-TAA TAA-3’)取代，导致可溶性dAb的表达没有C端FLAG 标签。将D61N和K64R核苷酸突变引入DOM23h-271-3(SEQ ID NO： 14)、DOM23h-271-7(SEQ ID NO：15)和DOM23h-437-6(SEQ ID NO： 19)中，分别产生DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)、DOM23h-271-13 (SEQ ID NO：17)和DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)。从已含有K64R 突变的易错选择输出中分离DOM23h-437-4(SEQ ID NO：18)和 DOM23h 439-6(SEQ ID NO：22)。将D61N突变引入这两种dAb中， 分别产生DOM23h-437-8(SEQ ID NO：20)和DM23h-439-8(SEQ ID NO：23)。
实施例4.TGF-βRII抑制的测定
在A549IL-11释放细胞测定和SBE-bla HEK 293T细胞传感器测 定中测试dAb。
A549IL-11释放测定：A549白介素-11(IL-11)释放测定测量dAb 对人TGF-β1刺激的从A549细胞释放IL-11的抑制能力。TGF-β1与 TGF-βRII直接结合并诱导TGF-βRI/II复合物的装配。TGF-βRI被磷 酸化并能通过包括Smad 4途径在内的若干途径进行信号转导。Smad 4 途径的激活导致IL-11的释放。IL-11被分泌到细胞上清液中，再通过 比色ELISA测定。
测试可溶性dAb通过Smad4途径阻断TGF-β1信号转导的能力。 简而言之，将1x105A549细胞/孔的测定培养基(DMEM高葡萄糖培养 基(GibcoTM，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)、10％热灭活胎牛血清(PAA， Austria)、10mM HEPES(Sigma，UK)和1％青霉素/链霉素(PAA， Austria))加入到组织培养96孔板(Nunc)，再加入dAb和TGF-β1(终浓 度3ng/ml)(R&D Systems，Abingdon，UK)，并在37℃、5％CO2中温 育过夜。将dAb透析到PBS中，然后进行测定。按照制造商的使用 指南，使用人IL-11DuosetTM(R&D systems，Abingdon，UK)测量释放 到上清液中的IL-11的浓度。
结果概述于表1。
SBE-bla HEK 293T细胞传感器测定：Smad信号转导分子家族成 员是将TGF-β信号从细胞表面传输到核的胞内途径的组分。TGF-β1 与TGF-βRII直接结合并诱导TGF-βRI/II复合物的装配。Smad2和 Smad3再通过TGF-βRI而磷酸化，然后与co-smad家族成员Smad4 形成异型复合物(heteromeric complex)。这些复合物易位到核，在此它 们与DNA结合并调节基因转录。
细胞传感器SBE-bla HEK 293T细胞含有处于Smad结合元件 (SBE)控制之下的β-内酰胺酶报道基因，其稳定整合到HEK 293T细 胞(Invitrogen，UK)。这些细胞响应TGF-βI并可用于检测Smad2/3信号 转导途径的激动剂/拮抗剂。
按照制造商推荐的方案(Invitrogen，UK)测试可溶性dAb通过该途 径阻断TGF-β1信号转导的能力。将dAb透析到PBS中，然后进行测 定。
结果概述于表1。
表1。
一式两份地进行各A549IL-11释放测定，每次测定都检测一条剂 量反应曲线和IC50值(n＝1)。测定进行1-6次，平均IC50值(n＝1-6)± 标准差(S.D)概述于表1。一式两份地进行各SBE-bla HEK 293T细胞 传感器测定，每次测定都检测两条剂量反应曲线和两个IC50值。求出 两个IC50值的平均值，得到每次测定的单个IC50值(n＝1)。测定进行 1-3次(n＝1-3)，并求出IC50值平均值±标准差(S.D)并概述于表1。
A549 phospho-Smad MSD测定：该测定在A549细胞(一种人肺 泡基底上皮细胞系)中测量dAb对TGF-β1刺激的Smad3磷酸化的抑 制能力。TGF-β1与TGF-βRII直接结合并诱导TGF-βRI/II复合物的装 配。TGF-βRI被磷酸化，继而Smad2和Smad3被磷酸化。
可使用抗Smad2/3捕获抗体和钌化(ruthenylated)-抗Smad3检测 抗体并通过电化学发光测定来测量，在细胞裂解物中测量磷酸化 Smad2/3水平。
测试可溶性dAb通过该途径阻断TGF-β1信号转导的能力。简而 言之，将2x104A549细胞/孔的生长培养基(含10％热灭活胎牛血清 的DMEM F12(Invitrogen，UK)，添加有25mM HEPES(Invitrogen，UK) 和1％GlutaMAXTM(Invitrogen，UK))加入到黑色透明底的组织培养 384孔板(Greiner Bio-one，UK)中，并在37℃、5％CO2温育过夜。对 dAb进行缓冲液交换，换为Tris-缓冲盐水pH8.0(TBS)(Sigma，UK)， 然后进行测定。然后将dAb在生长培养基中稀释，加入到细胞中并在 37℃(5％CO2)温育1小时。此后加入TGF-β1(稀释在添加有25mM HEPES和1％GlutaMAXTM的DMEM培养基(Invitrogen，UK)中)，并 在37℃温育30分钟。所用的TGF-β1浓度等于TGF-β1刺激A549细 胞生长的EC80值(导致80％的最大反应的浓度)。通常使用的TGF-β1 的浓度为2.2ng/ml。将细胞在添加有磷酸酶抑制剂(Sigma，Poole，UK) 和蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液(Cell Signaling Technology，MA， U.S.A)中于4℃裂解20分钟。将细胞裂解物转移至384孔高结合MSD 板(Meso Scale Discovery，MD，U.S.A)，并在室温下温育3小时。MSD 板先前已点(spot)有60μg/ml生物素化Smad2/3(BD Biosciences， Oxford，UK)，用含有5％Marvel干奶粉和0.1％吐温20的TBS(Sigma， UK)(MTTBS)在4℃封闭过夜，并用含0.1％吐温20的TBS(TTBS) 洗涤1次。除去细胞裂解物，用TTBS洗涤板3次，之后加入钌化抗 phospho Smad3抗体(Cell Signaling Technology MA，USA)。按照制造 商使用指南，将抗phospho Smad3抗体用MSD TAG-NHS-Ester(三联 吡啶钌(II))(Meso Scale Discovery，MD，USA))标记。将板在室温下温 育18小时。将板用TTBS洗涤1次，加入补充有表面活性剂(Meso Scale Discovery，MD，USA)的Read缓冲液T(Meso Scale Discovery，MD， USA)。使用MSD Sector imager 6000(Meso Scale Discovery，MD，USA) 来读板。可用其它相关细胞系例如原代肺成纤维细胞进行该测定。
DOM23h dAb所得的测定数据结果概述于表2。
RAW 264.7 phospho-Smad测定：该测定在RAW264.7细胞(一种 小鼠巨噬细胞细胞系)中测量dAb对TGF-β1刺激的Smad3磷酸化的 抑制能力。TGF-β1与TGF-βRII直接结合并诱导TGF-βRI/II复合物的 装配。TGF-βRI被磷酸化，继而Smad2和Smad3被磷酸化。可使用 抗Smad2/3捕获抗体和钌化抗Smad3检测抗体并通过电化学发光测定 来测量，在细胞裂解物中测量磷酸化Smad2/3水平。
测试可溶性dAb通过该途径阻断TGF-β1信号转导的能力。简而 言之，将3.45x105RAW 264.7细胞/孔的生长培养基(高葡萄糖DMEM (Invitrogen，UK)，添加有10％热灭活胎牛血清(Invitrogen，UK)和0.01％ pluronic酸(Sigma，UK))加入到组织培养96孔板(Corning Costar)，并在 37℃、5％CO2温育2天。对dAb进行缓冲液交换，换为TBS，然后 进行测定。随后将dAb在生长培养基中稀释，加入到细胞中并在37℃ (5％CO2)温育1小时，接着加入TGF-β1(稀释在添加有25mM Hepes (Invitrogen，UK)的DMEM培养基(Invitrogen，UK)中)并在37℃温育30 分钟。所用的TGF-β1浓度等于TGF-β1刺激RAW 264.7细胞生长的 EC80值(导致80％的最大反应的浓度)。通常使用的TGF-β1的浓度为 1.1ng/ml。将细胞在添加有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲 液中于4℃裂解20分钟。将细胞裂解物转移至384孔高结合MSD板 (Meso Scale Discovery，MD，U.S.A)，并在室温下温育3小时。MSD板 先前已点有60μg/ml生物素化Smad2/3，用MTTBS在4℃封闭过夜 并用TTBS洗涤1次。除去细胞裂解物，用TTBS洗涤板3次，再将 钌化抗phospho Smad3抗体加入板，并在室温下温育18小时。按照制 造商使用指南，将抗phospho Smad3抗体用MSD TAG-NHS-Ester(三 联吡啶钌(II))(Scale Discovery，MD，USA))标记。将板用TTBS洗涤2 次，并加入补充有表面活性剂的Read缓冲液T。使用MSD Sector imager 6000来读板。
DOM23h dAb所得的测定数据结果概述于表2。
一式一份、一式两份或一式三份地进行各A549 phospho-Smad MSD测定，每次测定分别测定1、2或3条剂量反应曲线和IC50值(n＝ 1、2或3)。在7次测定(4次一式两份，3次一式三份)(n＝17)中测试 DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)。在3次测定(1次一式两份，2次一 式三份)(n＝8)中测试DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)。在3次测定(2 次一式三份，1次一式一份)(n＝7)中测试DOM23h-439-8(SEQ ID NO： 23)。求出IC50值平均值±标准误差(S.E)并概述于表2。
一式一份、一式两份或一式三份地进行各RAW 264.7 phospho-Smad测定，每次测定分别测定1、2或3条剂量反应曲线和 IC50值(n＝1、2或3)。在7次测定(1次一式一份，6次一式两份和2 次一式三份)(n＝19)中测试DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)。所得 IC50值范围概述于表2。5次一式两份(n＝10)地测试DOM23h-437-9 (SEQ ID NO：21)和DOM23h-439-8(SEQ ID NO：23)。
MC3T3-E1萤光素酶测定：MC3T3-E1萤光素酶测定在 MC3T3-E1细胞中测量dAb对TGFβ诱导的CAGA-萤光素酶表达的抑 制能力。3份拷贝的TGFβ反应性序列基序(称为CAGA盒)存在于人 PAI-1启动子中，并与Smad3和4蛋白特异性结合。将多拷贝的CAGA 盒克隆到萤光素酶报道基因构建体中，将TGFβ反应性赋予转染了该 报道基因系统的细胞。该测定使用稳定转染了[CAGA]12-萤光素酶报 道基因构建体的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞)(Dennler等(1998) EMBO J.17，3091-3100)。
测试可溶性dAb通过Smad3/4途径阻断TGF-β1信号转导的能力。 简而言之，将2.5x104MC3T3-E1细胞/孔的测定培养基(RPMI培养基 (Gibco，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)、10％热灭活胎牛血清和1％青霉 素/链霉素)加入到组织培养96孔板(Nunc)，再加入dAb和TGF-β1(终 浓度1ng/ml)，并在37℃、5％CO2温育6小时。将dAb透析到PBS 中，然后在测定中进行测试。将Brightglow萤光素酶试剂(Promega，UK) 加入各孔，在室温下孵育2分钟以使细胞能够裂解，并在光度计上测 量所得荧光。
在MC3T3-E1萤光素酶测定中测试DOM23h-271-12(SEQ ID NO： 16)、DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)和DOM23h-439-8(SEQ ID NO： 23)。结果示于表3。
表3。
一式两份地进行MC3T3-E1萤光素酶测定，并测定IC50值(n＝1)。 测定进行2-4次(n＝2-4)，IC50值范围概述于表3。DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)所得结果按测试的dAb批次号而异。因此，对各批次号求 出IC50值范围和平均IC50值±标准差(S.D)，并概述于表3。
实施例5.DSC(差示扫描量热法)
使用差示扫描量热计(DSC)测定dAb的热稳定性。以1mg/ml在 PBS缓冲液中测试dAb。将蛋白透析过夜到PBS缓冲液中。对于所有 样品，PBS缓冲液用作参考。使用毛细管室微量热计(capillary cell microcalorimeter)VP-DSC(Microcal，MA，USA)以180℃/小时的加热 速率进行DSC。对于参考缓冲液和蛋白样品，扫描通常在25-90℃。 在每个参考缓冲液和样品配对后，用1％Decon(Fisher-Scientific)的水 溶液清洁毛细管室，接着用PBS清洁。所得数据图使用Origin 7 Microcal软件分析。由参考缓冲液获得的DSC图从样品图中减去。将 样品的精确摩尔浓度输入数据分析程序，以产生解链温度(Tm)、焓(Δ H)和范托夫焓(ΔHv)值。用1和2个跃迁事件(或峰)将数据拟合为非-2- 态模型。
对于这两种模型得到表观解链温度(app Tm)，来自最佳拟合模型 的app Tm概述于表4。dAb的解链温度(Tm)范围为48.3℃至62.9℃。 分别相对于DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)和DOM23h-271-7而言， 存在于DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)和DOM23h-271-13(SEQ ID NO：17)中的额外D61N和K64R突变降低蛋白的热稳定性； DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)和DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16) 对的差异为4℃，DOM23h-271-7(SEQ ID NO：15)和DOM23h-271-13 (SEQ ID NO：17)对的差异为2℃。与不含这些突变的相同序列 (DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19))相比，存在于DOM437-9中的额外 D61N和K64R突变也降低了蛋白的热稳定性至少4℃。将D61N和 K64R突变加入到DOM23h-439中得到DOM23h-439-7，导致热稳定 性下降约2℃。同样，将D61N突变加入到DOM23h-439-6(SEQ ID NO： 22)(含K64R突变的dAb)导致热稳定性下降约2℃。这些数据见表4， 表明D61N K64R突变对DOM23h dAb的热稳定性具有负面影响。
表4。
实施例6：dAb表达：
如上所述地表达属于DOM23h-271、437和439谱系的dAb。 DOM23h-271(SEQ ID NO：4)表达良好，表达水平为72mg/l(表5)。 从易错突变选择输出中分离的DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)和 DOM23h-271-7(SEQ ID NO：15)也表达良好，表达水平类似于亲本 DOM23h-271 dAb(对于DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)为63mg/l， 对于DOM23h-271(SEQ ID NO：4)为71mg/l(表5))。将D61N和K64R 突变引入DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)产生DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)，导致表达水平降低7倍(表5)。将同样的突变引入 DOM23h-271-7产生DOM23h-271-13(SEQ ID NO：17)，将dAb表达 水平降低2.5倍(表5)。
将D61N和K64R突变引入来自DOM23h-437谱系的dAb，具有 如上所述的类似作用。DOM23h-437(SEQ ID NO：8)、DOM23h-437-4 (SEQ ID NO：18)和DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)都表达良好，表达 水平分别为89、66和98mg/l(表5)。然而，将D61N和K64R突变引 入这些dAb则导致表达水平降低1.7-2.5倍(表5)。将D61N和K64R 突变引入DOM23h-439(SEQ ID NO：10)和DOM23h-439-8(SEQ ID NO：23)具有类似作用，这些dAb的表达水平分别降低1.8和4.6倍(表 5)。
表5。
将转化到HB2151细胞中的pDOM10或pDOM13表达载体中的 dAb在过夜表达自我诱导培养基中在30℃表达48-72小时。将 Streamline蛋白A珠加入培养物上清液中，以与可溶性VH dAb结合。 这些珠用2x PBS洗涤，结合的dAb用0.1M甘氨酸pH 2.0洗脱并用 1M Tris pH 8.0中和。测量dAb在280nm处的OD，并使用由dAb氨 基酸组成求出的消光系数测定蛋白浓度。
实施例7：竞争BIAcore：
使用表面等离子共振(SPR)进行实验，以研究来自DOM23h-271、 437和439谱系的dAb是否彼此竞争hTGFβ-RII上的相同或不同结合 位点。在BIAcoreTM3000仪器(BIAcore，GE healthcare，Sweden)上进行 SPR实验。按照制造商使用指南，将10mM乙酸钠缓冲液pH 4中的 50ug/ml的hTGFb-RII/Fc抗原(BIAcore，GE Healthcare，Sweden)偶联 到CM5传感器芯片(BIAcore，GE Healthcare，Sweden)。偶联大约5500 RU的抗原。空白流动室用作参考。将纯化dAb在HBS-EP缓冲液 (BIAcore，GE Healthcare，Sweden)中稀释，并使用共注射命令流过包被 抗原的和空白流动室，流速30μl/分钟。共注射命令使能够在注射第 一样品后立即注射第二样品。第一注射由单一dAb组成，而第二注射 由第一dAb和第二dAb的混合物组成。使用的所有dAb的浓度足够 高，以最大能力结合抗原表面。如果通过注射两种dAb的混合物可超 过抗原表面被第一dAb结合的最大结合能力，则第二dAb可能竞争抗 原上的不同结合位点或表位。如果在第二注射后未见进一步结合，则 两种dAb可能竞争相同的抗原结合位点。如果先注射最强效能或最高 亲和力的dAb，那么就更容易解释结果。共注射循环之后，用10mM 甘氨酸pH 2.25(2次10μl注射)和接着的5分钟等待期，再生CM5传 感器芯片表面。
通过单独和彼此组合地共注射DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)、 DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)和DOM23h-439-6(SEQ ID NO：22)， 进行竞争BIAcore实验。用易错成熟文库选择之后分离这些克隆。它 们不含D61N K64R双重突变，但是DOM23h-439-6(SEQ ID NO：22) 的确含有K64R单突变。DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)是3种dAb 中最强效能的，并因此首先以浓度100nM注射，然后注射 DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)(100nM)和DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)(500nM)(图8A)或DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)(100nM) 和DOM23h-439-6(SEQ ID NO：22)(500nM)(图8B)的混合物。在第 二注射期间结合更多RU的dAb，表明与DOM23h-271-3(SEQ ID NO： 14)和DOM23h-439-6(SEQ ID NO：22)相比，DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)竞争不同抗原结合位点。
通过共注射DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)组合 DOM23h-262-10(SEQ ID NO：13)、DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16) 和DOM23h-439-8(SEQ ID NO：23)，进行竞争BIAcore实验。这些克 隆都含D61N K64R突变。直接从易错文库选择输出中分离 DOM23h-262-10(SEQ ID NO：13)，同时通过定点诱变将D61N K64R 突变分别引入DOM23h-437-6(SEQ ID NO：19)、DOM23h-271-3(SEQ ID NO：14)和DOM23h-439-6(SEQ ID NO：22)，产生DOM23h-437-9 (SEQ ID NO：)、DOM23h-271-12(SEQ ID NO：)和DOM23h-439-8 (SEQ ID NO：)。DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)是4种dAb中最强效 能的并因此首先注射，然后与其他3种dAb之一组合。所有dAb都以 100nM进行测试。在第二注射期间未结合更多RU的dAb，表明所有 4种dAb竞争相同抗原结合位点，然而，如果D61N K64R双重突变 不存在于dAb核苷酸序列中时，3种谱系不竞争相同抗原结合位点。 数据概述于图9和图10。
NR突变的概述：总之，如在A549IL-11释放测定和SBE-bla Hek293T细胞传感器测定中所测量地，将D61N和K64R突变加入到 DOM23h-271、DOM23h-437和DOM23h-439谱系中，改善了dAb中 和hTGFβ-RII介导的信号转导的效能(表1)。另外，含有D61N和K64R 突变的DOM23h-271-12(SEQ ID NO：16)与mTGFβRII交叉反应，因 为在MC3T3-E1萤光素酶测定和RAW 264.7phospho-Smad测定中， 它展示了中和mTGFβ-RII-介导的信号转导的能力。在MC3T3-E1萤 光素酶测定中，DOM23h-437-9(SEQ ID NO：21)能够抑制mTGFβ-RII 介导的信号转导，但在RAW 264.7phospho-Smad测定中却不能。然 而，如经DSC测定，D61N K64R突变的存在导致热稳定性降低(表4)。 也观察到了表达水平的降低(表5)。
实施例8-博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型
博来霉素(BLM)诱导的炎症和纤维化代表特发性肺纤维化的实 验模型。该方法先前已有描述(Anon等，Am J Respir.Crit.Care Med. 2005.第171卷，第1279-1285页.Piguet等，Int.J.Exp.Path.1997，第 78卷，第43-48页.Gasse等，J.Clin.Invest.，(2007).第117卷，第 3786-3799页)。
BLM诱导肺泡巨噬细胞和上皮细胞的氧化应激、DNA损伤和细 胞凋亡，导致趋化因子和促炎细胞因子分泌、炎性细胞募集、重塑和 肺纤维化。
对经博来霉素治疗的小鼠经鼻内给予结合TGFβ-RII的dAb，并 测定其对预防肺部炎症和纤维化的作用。
尽管参考其实施方案具体地显示和描述了本发明，但本领域技术 人员将会知道，在形式和细节方面可作出各种改动，只要不偏离所附 权利要求书所涵盖的本发明的范围即可。