技术领域
本发明属于DNA提取方法领域，具体涉及一种提取水培植物基因组DNA的试剂盒及提取方法。
背景技术
DNA是动植物遗传物质，其在研究物种进化，生理功能方面具有重要作用。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法是传统且较为常见的植物DNA提取方法。CTAB法提取DNA的原理如下：利用CTAB在高离子强度的缓冲液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，用离心获得含DNA的上清液，用氯仿和异戊醇混合液使蛋白质变性、分层，同时除去脂类的方法，达到提取和纯化DNA的目的。传统的CTAB方法虽然适用于大部分动植物以及微生物DNA的提取，但因其耗时长，所以现有技术针对不同的样品做了不同的改进。
以“改进的CTAB提取植物DNA方法，李荣华，实验室研究与探索，2009年”记载的方法为例，该文献记载的方案针对的是植物叶片样本DNA的提取，经过改进后，CTAB法提取DNA主要包括(1)液氮研磨样品步骤，耗时15min左右，(2)DNA提取液提取步骤，耗时45min左右，DNA提取液是CTAB、NaCl、EDTA、Tris-HCl、β-巯基乙醇、水的混合物，(3)除蛋白步骤，耗时20min左右，(4)异丙醇沉淀步骤，耗时1h以上，(5)乙醇溶液清洗、干燥步骤，耗时30min左右。该方法总计耗时2小时50分钟以上。上述改进的CTAB方法缩短了提取时间，可以使学生在较短的时间内直接观察到DNA的丝状沉淀，也可以在琼脂糖电泳中确定出提取的DNA分子的大小。
但是，由于上述方法采用的液氮研磨，液氮温度非常低，液氮的存储和使用均不太方便，且易冻伤操作者手部，因此，有必要进一步对CTAB方法进行改进，以期在缩短DNA提取时间的同时，避免使用液氮。
发明内容
本发明提供的一种提取水培植物基因组DNA的试剂盒及提取方法，缩短了DNA提取时间，为提高科研和教学效率奠定了基础。
本发明的第一个目的是提供一种提取水培植物基因组DNA的试剂盒，包括样品缓冲液、DNA提取液、体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液、异丙醇、体积分数70％～75％的乙醇溶液、ddH2O、纤维素酶；
所述样品缓冲液为100～150g/L的葡萄糖溶液；
所述DNA提取液的配方如下：CTAB 2g、NaCl 1.4mol、0.5mol/L pH8.0的EDTA溶液4mL、1mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液10mL、β-巯基乙醇2.5mL，双蒸水定容至100mL。
优选的，所述的提取水培植物基因组DNA的试剂盒，所述样品缓冲液为100g/L的葡萄糖溶液或者150g/L的葡萄糖溶液。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述的试剂盒提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：将采集的水培植物组织与样品缓冲液混合，研磨5～10min，加入样品75mg/mL的纤维素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；
S2，提取：向破壁溶液中加入1～2倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热20～40min，离心，收集上清液；
S3，除蛋白：向上清液中加入等体积的体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀3min，静置几秒，吸取上层溶液；
S4，沉淀：向上层溶液中加入0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30～60min，离心，弃上清，收集DNA沉淀；
S5，清洗：在DNA沉淀中加入体积分数70％～75％的乙醇溶液，混合，离心，弃上清，最后置于通风处风干；
S6，溶解：风干的DNA沉淀用ddH2O溶解，-20℃保存备用。
优选的，上述的提取水培植物基因组DNA的方法，S1中，水培植物组织与样品缓冲液的比例为1g:1mL。
优选的，上述的提取水培植物基因组DNA的方法，S2中，离心的条件为4℃、6000r/min离心5min。
优选的，上述的提取水培植物基因组DNA的方法，S2、S4中离心的条件均为4℃、10000rpm离心10min。
优选的，上述的提取水培植物基因组DNA的方法，S3中，静置时间为3～10秒。
与现有技术相比，本发明提供的一种提取水培植物基因组DNA的试剂盒及提取方法具有以下有益效果：
由于现有文献中记载的改进的CTAB方法针对的是植物叶片样本，样本较干净，所以无需复杂的清洗等前处理步骤。但是土培植物由于采用的土壤基质，基质中可能含有黏土或者可能含有其他未知离子，这些未知离子在DNA提取时是否导致DNA的降解或者流失不清楚，加之土培植物种类繁多，体积大小不定。尤其是植物根系样品在CTAB法的样品粉碎步骤之前可能涉及清洗等不同的样品前处理方式，操作更为复杂，耗时更长。
相比之下，水培植物包括叶片、茎、根系等干净且培养液成分明确，可供水培的植物种类有限，比如常见的叶类蔬菜等，在CTAB法的样品粉碎步骤之前可以省略掉复杂的样品前处理步骤。
基于此，本发明提供的试剂盒和方法均适用于水培植物基因组DNA，利用“样品缓冲液”替代“液氮”，在DNA的提取过程中避免使用液氮，提高试剂的使用方便度，减少液氮冻伤操作者手部的风险。
针对水培植物细胞内水分充盈丰富的特点，样品缓冲液采用高渗的葡萄糖溶液，先使细胞内水分渗出，细胞皱缩，然后添加纤维素酶进行破壁，当加入低渗的DNA提取液后，细胞吸水充胀破裂，促使胞内物质溶出。利用本发明的试剂盒和方法取水培植物组织DNA耗时98～153min左右，缩短了DNA提取时间，为提高科研和教学效率奠定了基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种提取水培植物基因组DNA的试剂盒，包括样品缓冲液、DNA提取液、体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液、异丙醇、体积分数70％～75％的乙醇溶液、ddH2O、纤维素酶；
所述样品缓冲液为100～150g/L的葡萄糖溶液；
所述DNA提取液的配方如下：CTAB 2g、NaCl 1.4mol、0.5mol/L pH8.0的EDTA溶液4mL、1mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液10mL、β-巯基乙醇2.5mL，双蒸水定容至100mL。
样品缓冲液配制时采用的溶剂是ddH2O或者双蒸水。
基于同一种发明构思，我们还提供了一种利用上述试剂盒提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下实施例。
实施例1
一种提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：实施例1采用的水培植物组织为水培的紫花苜蓿根系，将采集的水培植物组织与样品缓冲液混合，样品缓冲液为100g/L的葡萄糖溶液，水培植物组织与样品缓冲液的比例为1g:1mL，研磨5min，加入样品75mg/mL的纤维素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；
S2，提取：向破壁溶液中加入相当于破壁溶液1倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热20min，4℃、6000r/min离心5min，收集上清液；所述DNA提取液的配方如下：CTAB 2g、NaCl 1.4mol、0.5mol/L pH8.0的EDTA溶液4mL、1mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液10mL、β-巯基乙醇2.5mL，双蒸水定容至100mL；
S3，除蛋白：向上清液中加入与上清液等体积的体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀3min，静置3秒，吸取上层溶液；
S4，沉淀：向上层溶液中加入相当于上层溶液0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30min，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，收集DNA沉淀；
S5，清洗：在DNA沉淀中加入体积分数70％的乙醇溶液，混合，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，最后置于通风处风干；
S6，溶解：风干的DNA沉淀用ddH2O溶解，-20℃保存备用。
实施例2
一种提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：实施例2采用的水培植物组织为水培的拟南芥叶片，将采集的水培植物组织与样品缓冲液混合，样品缓冲液为150g/L的葡萄糖溶液，水培植物组织与样品缓冲液的比例为1g:1mL，研磨6min，加入样品75mg/mL的纤维素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；
S2，提取：向破壁溶液中加入相当于破壁溶液2倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热30min，4℃、6000r/min离心5min，收集上清液；所述DNA提取液的配方同实施例1；
S3，除蛋白：向上清液中加入与上清液等体积的体积比24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀3min，静置10秒，吸取上层溶液；
S4，沉淀：向上层溶液中加入相当于上层溶液0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置45min，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，收集DNA沉淀；
S5，清洗：在DNA沉淀中加入体积分数70％的乙醇溶液，混合，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，最后置于通风处风干；
S6，溶解：风干的DNA沉淀用ddH2O溶解，-20℃保存备用。
实施例3
一种提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：实施例3采用的水培植物组织为水培的百脉根茎，将采集的水培植物组织与样品缓冲液混合，样品缓冲液为120g/L的葡萄糖溶液，水培植物组织与样品缓冲液的比例为1g:1.5mL，研磨10min，加入样品75mg/mL的纤维素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；
S2，提取：向破壁溶液中加入相当于破壁溶液1倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热40min，4℃、6000r/min离心5min，收集上清液；所述DNA提取液的配方同实施例1；
S3，除蛋白：向上清液中加入与上清液等体积的体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀3min，静置12秒，吸取上层溶液；
S4，沉淀：向上层溶液中加入相当于上层溶液0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置60min，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，收集DNA沉淀；
S5，清洗：在DNA沉淀中加入体积分数75％的乙醇溶液，混合，4℃、10000rpm离心10min，弃上清，最后置于通风处风干；
S6，溶解：风干的DNA沉淀用ddH2O溶解，-20℃保存备用。
实施例4
一种提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：实施例4采用的水培植物组织为水培的紫花苜蓿叶片，将采集的水培植物组织与样品缓冲液混合，样品缓冲液为100g/L的葡萄糖溶液，水培植物组织与样品缓冲液的比例为1g:1mL，研磨5min，加入样品75mg/mL的纤维素酶溶液，置于37℃15min，得到破壁溶液；
S2，提取：向破壁溶液中加入相当于破壁溶液1倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热20min，4℃、10000r/min离心5min，收集上清液；所述DNA提取液的配方同实施例1；
S3，除蛋白：向上清液中加入与上清液等体积的体积比24:1的氯仿：异戊醇混合液，上下颠倒混匀3min，静置3秒，吸取上层溶液；
S4，沉淀：向上层溶液中加入相当于上层溶液0.6倍体积的经4℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置30min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集DNA沉淀；
S5，清洗：在DNA沉淀中加入体积分数70％的乙醇溶液，混合，4℃、12000rpm离心10min，弃上清，最后置于通风处风干；
S6，溶解：风干的DNA沉淀用ddH2O溶解，-20℃保存备用。
对比例1
一种提取水培植物基因组DNA的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：实施例1采用的水培植物组织为水培的紫花苜蓿根系，采用液氮研磨方式进行破壁，得到破壁物；
S2，提取：向破壁物中加入相当于破壁物1倍体积的DNA提取液，混匀，65℃水浴加热45min，4℃、6000r/min离心5min，收集上清液；
其余步骤同实施例1。
对比例2
参考“改进的CTAB提取植物DNA方法，李荣华，实验室研究与探索，2009年”的方法得到DNA提取液。
取2μl实施例1-4以及对比例1-2的DNA溶液，利用Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测测定OD 260/OD 280值来判断DNA的纯度，结果如表1所示。表1结果显示，各方法提取的DNA均具有较好的纯度，相比之下，实施例1-4的耗时较短，低于对比例2，实施例2与对比例1的液氮研磨方法耗时相差不大，说明本发明的方法“样品缓冲液”可以替代传统的“液氮”步骤。
表1不同方法提取的DNA检测信息和耗时统计
需要说明的是，本发明所述的实施例中，为了提高研磨效率，先将水培植物组织切碎成体积1立方毫米左右的小块或者面积1平方毫米左右的小片，然后在加入样品缓冲液进行研磨。
需要说明的是，当本发明给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。