技术领域
本发明涉及一种聚核苷酸，还涉及这种聚核苷酸作为λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点的应用；本发明还涉及一种含启动子及λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵序列的聚核苷酸、转化子，本发明还涉及该聚核苷酸、转化子的应用，特别是在发酵生产多肽，尤其是利用发酵生产的多肽产物生产1,5-戊二胺方面的应用。
背景技术
在以表达重组蛋白为目的的发酵中，通常使用组成型启动子或诱导型启动子(又称可诱导启动子)来启动重组基因的表达。组成型启动子的表达为持续性表达，无需调控。诱导型启动子又分为阻遏型启动子和激活型启动子，分别受不同的转录因子(又称转录调控蛋白)控制。阻遏型启动子与阻遏蛋白(或称转录抑制蛋白)结合，受到抑制；在诱导条件下，阻遏蛋白与启动子序列解离，解除抑制。对于阻遏型启动子而言，当阻遏蛋白缺失时，可视为处于持续诱导状态，也可当成组成型启动子。例如Plac启动子受阻遏蛋白LacI抑制，是诱导型启动子。但lac启动子在不能表达LacI蛋白的宿主菌中可以组成型表达。激活型启动子在非诱导条件下不能表达或表达效率低；诱导条件下，激活蛋白被激活，并与激活型启动子结合，促使其表达。例如PBAD启动子受激活蛋白AraC的激活。
原核生物的启动子中有两个关键性元件，-10元件和-35元件，分别位于转录起始点上游约-35和-10碱基位置，是σ因子识别位点。σ因子是原核生物RNA聚合酶全酶(包括RNA聚合酶核心酶和σ因子)中的辅助因子。σ因子促使RNA聚合酶与启动子序列结合，启动转录。
在诱导型启动子的序列中，序列上游，和/或序列下游有转录因子(阻遏蛋白或激活蛋白)的操纵位点。转录因子通过与操纵位点的结合控制启动子。例如λ噬菌体基因组中含有6个λ噬菌体阻遏蛋白CI(简称λCI)的操纵位点：OL1(TATCACCGCCAGTGGTA)，OL2(CAACACCGCCAGAGATA)，OL3(TATCACCGCAGATGGTT)，OR1(TACCTCTGGCGGTGATA)，OR2(TAACACCGTGCGTGTTG)，OR3(TATCACCGCAAGGGATA)。λ噬菌体中受λCI调控的L启动子(简称λPL)和R启动子(简称λPR)的-10元件和-35元件都分别与两个λCI操纵位点部分重合，因此λCI与操纵位点的结合会阻碍RNA聚合酶与启动子的结合，抑制转录。λCI与各操纵位点的结合对启动子的活性都有一定的影响。对于λPR来说，当OR1与OR2协同作用时，所起的抑制作用最大；OR1与OR3协同作用所起的抑制作用次之；而OR2与OR3协同作用或各操纵位点单独作用所起的抑制作用更弱(见Lewis等，“New insights into the phage genentic switch:Effects of bacteriophage lambda operator mutations on DNA looping and regulation of PR,PL,and PRM”，Journal of Molecular Biology(2016)，doi:10.1016/j.jmb.2016.08.027)。
野生型λCI可以被RecA蛋白诱导自切，解除对所控启动子的抑制。RecA蛋白的表达和活性受宿主菌DNA断裂所引起的SOS反应激活。因此能够造成宿主菌DNA断裂的条件，如化学诱导剂丝裂霉素C或萘啶酮酸，或UV辐射，都可以诱导λCI所控制的启动子的表达。与野生型λCI相比，在重组表达上得到广泛应用的是λCI的热不稳定突变型CI857(见Valdez-Crus等，“Production of recombinant proteins in E.coli by the heat inducible expression system based on the phage lambda pL and/or pR promoters”，Microbial Cell Factories(2010)9:18)。λCI的热不稳定突变型还包括：I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E(见Jana等，“Amino acid changes in the repressor of bacteriophage lambda due to temperature-sensitive mutations in its cI gene and the structure of a highly temperature-sensitive mutant repressor”，Protein Engineering(1999)Volume 12，Issue 3，pp225-233)。热不稳定的阻遏蛋白在较低温度下(如30℃或更低)具有抑制转录的活性，而在较高温度下(如42℃)失去抑制活性，因而其所控制的启动子具有热诱导的特性。
组成诱导型启动子和操纵序列的元件可以用来构建人工启动子。例如，De Boer等人将Plac启动子及其下游含-10元件和LacI操纵子的序列与Ptrp启动子含-35元件的序列结合，构建了表达功能比Plac启动子和Ptrp启动子更为强大的Ptac启动子(见“The tac promoter:a functional hybrid derived from the trp and lac promoters”，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(1983)，Volume 80，Issue 1，pp21-25)。因此研究诱导型启动子及其操纵序列，和它们的突变体，获得新的可应用元件对于分子生物技术十分重要。Jechlinger等人公开了噬菌体λPR启动子的突变型λPR T-41C(见“Modulation of gene expression by promoter mutants of theλcI857/pRM/pR system”，Journal of Biotechnology(2005)Volume116，Issue 1，pp11-20)。突变碱基T-41C位于λPR启动子的操纵位点OR2序列内。这种λPR启动子的突变型在诱导条件下的重组表达量低于野生型λPR启动子。
本案发明人发现在λPR T-41C启动子中引入另一个位于OR2序列内的点突变G-38A，提高了该突变型λPR启动子在诱导条件下的表达量。本案提供了一个新的λCI操纵位点序列。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提出一种第一聚核苷酸，所述第一聚核苷酸可以作为λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点。
本发明中提出的第一聚核苷酸，序列为如SEQ ID NO 1所示的序列，或如SEQ ID NO 1所示序列的碱基互补序列。
所述聚核苷酸可以和1个、2个、3个、4个、或5个λCI操纵位点组合成为启动子的操纵序列。所述1个、2个、3个、4个、或5个λCI操纵位点选自λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3，第一聚核苷酸，λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3的突变型，和第一聚核苷酸的突变型组成的集合。
所述聚核苷酸可以位于启动子序列上游，下游，或嵌入启动子序列中。在某些实施例中，所述聚核苷酸与启动子的-10元件或-35元件序列部分重合。
所述启动子可以是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工启动子。
所述启动子能被λ噬菌体阻遏蛋白CI(简称λCI)或λCI的突变体抑制转录。λCI突变体优选热不稳定的λCI蛋白。热不稳定的λCI蛋白在较低温度能够抑制启动子的转录，而当温度升高时则失去抑制活性。本发明所述的热不稳定突变型λCI蛋白包括但不限于CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。CI857与野生型λCI相比第66位氨基酸残基由丙氨酸变为苏氨酸。在本发明的某些实施例中，CI857还可进一步包含其他氨基酸残基位点的突变，所述其他氨基酸残基位点的突变不影响其第66位氨基酸残基突变所导致的热不稳定性。
本发明的第二方面在于提出一种第二聚核苷酸，所述第二聚核苷酸含有启动子和启动子的操纵序列，该启动子的操纵序列包含λ噬菌体阻遏蛋白CI的第一操纵位点(简称λCI第一操纵位点)，所述λCI的第一操纵位点是如上文所述的第一聚核苷酸。
所述启动子可以是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工启动子。在一个实施例中，所述第二聚核苷酸包含λ噬菌体R启动子的突变型G-38A/T-41C。或者，所述第二聚核苷酸包含如SEQ ID NO 17所示的序列，或如SEQ ID NO 17所示序列的碱基互补序列。
本发明所述的启动子的操纵序列包含序列如SEQ ID NO 1所示的λCI第一操纵位点。进一步，所述启动子的操纵序列还可以包含1个、2个、3个、4个、或5个第二λCI的操纵位点。所述启动子操纵序列中还含有的1个、2个、3个、4个、或5个λCI第二操纵位点选自λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3，和上述操纵位点的突变型。
所述启动子能被λ噬菌体阻遏蛋白CI及λCI的突变体抑制转录。
所述启动子是热诱导启动子、化学诱导启动子或辐射诱导启动子。
所述第二聚核苷酸是表达盒、质粒载体、质粒、噬菌体基因组、转座子或者是在宿主基因组中的聚核苷酸。
进一步，所述第二聚核苷酸包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。
更进一步，所述多肽包括酶和多肽类药物。所述的酶包括氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶和连接酶中的至少一种。又更进一步，所述酶是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。多肽类药物包括激素，抗体，生长因子等。在一个实施例中，表达的多肽是胰岛素原。
更进一步，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列至少一种：cadA基因，ldcC基因，haldc基因，cadA基因的片段，ldcC基因的片段，haldc基因的片段；或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：序列如SEQ ID NO 2所示的DNA，SEQ ID NO 3所示的DNA，序列如SEQ ID NO 4所示的DNA，序列如SEQ ID NO 2所示的DNA的片段，序列如SEQ ID NO 3所示的DNA的片段，序列如SEQ ID NO 4所示的DNA的片段。
本发明的第三方面在于提出一种转化子，所述转化子含有如上所述的第二聚核苷酸。
一种转化子，所述转化子包含如上文任一项技术方案所述的第二聚核苷酸。
优选地，所述转化子包含上文技术方案所述的第二聚核苷酸，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子中含有编码λCI或其突变型的聚核苷酸。又进一步，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在质粒上；更进一步，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸与所述编码多肽的聚核苷酸在同一个质粒上。或者，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在宿主基因组中。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子的宿主为原核生物细胞。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子的宿主包括但不限于大肠杆菌(Escherichia.coli)，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
本发明的第四方面目的在于提出一种发酵生产多肽的方法。
一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)培养如上任一项技术方案所述的转化子；
B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。
优选地，所述的一种发酵生产多肽的方法，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；
2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子在诱导条件下启动重组表达，诱导条件为热诱导、化学诱导或辐射诱导。
在上述任一技术方案的基础上进一步，诱导条件为热诱导，所述诱导条件指温度为32℃-48℃。
本发明的第五方面目的在于提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法及一种生物基1,5-戊二胺。
一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
I)按照上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；
II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。
本发明提出一种新的λPR启动子的突变型，其同时包含已公开的T-41C碱基突变和一个新的碱基突变G-38A(λPR G-38A/T-41C)。与已公开的λPR T-41C突变型不同的是，λPRG-38A/T-41C在诱导温度下的表达效果与野生型λPR启动子基本相同。本发明为诱导重组表达提供了新的选择。
附图说明
图1是实施例1中所述的pPR2-cadA重组表达质粒的结构示意图；
图2是λPR及其操纵序列图，其中λCI操纵位点OR1、OR2、OR3用方框标记，转录起始点用+1标记，其上游序列的碱基位置用-10、-20、-30标记，突变型λPR G-38A/T-41C的两处碱基突变在启动子下方标示；
图3是实施例1-2中所述的重组表达菌株JM109/pPRT41C-cadA(泳道1-3)、JM109/pPRG38AT41C-cadA(泳道4-6)菌体蛋白电泳图。
具体实施方式
下面结合附图，详细说明本发明。
本发明公开了一种新的λPR启动子的突变型，其同时包含T-41C和G-38A碱基突变(λPR G-38A/T-41C)。本发明所公开的新的λPR启动子的突变型中的两个碱基突变都位于λCI操纵位点OR2内。因此本发明也提供了一个新的λCI操纵位点，此突变型λCI操纵位点的序列如SEQ ID NO 1所示。
在本发明中，发明人发现已公开的噬菌体λPR启动子的突变型λPR T-41C在诱导条件下的表达量远低于野生型λPR启动子。而在此单碱基突变型的基础上引入一个新的点突变，所得的λPR G-38A/T-41C表达效果与野生型λPR启动子基本相同。
本发明涉及来源于λ噬菌体的启动子和操纵序列。
本发明涉及的一种第一聚核苷酸，碱基序列如SEQ ID NO 1所示。所述第一聚核苷酸的用途是用作λ噬菌体阻遏蛋白CI的操纵位点。
本发明涉及的启动子的操纵序列，包含如上所述的第一聚核苷酸。所述第一聚核苷酸位于所述启动子的上游，下游，或嵌入启动子序列中。在一个实施例中，所述第一聚核苷酸位于启动子的-49至-33碱基位置(数字表示碱基位于启动子转录起始点上游的位置)。
进一步，所述启动子的操纵序列还包含1个，2个，3个，4个，5个λCI操纵位点，所述λCI操纵位点选自OL1，OL2，OL3，OR1，OR2，OR3，序列如SEQ ID NO 1所示的聚核苷酸，λ噬菌体基因组中的操纵位点OL1、OL2、OL3、OR1、OR2、OR3的突变型，和第一聚核苷酸的突变型组成的集合。
本发明还涉及一种第二聚核苷酸，所述第二聚核苷酸包含启动子和如上所述的启动子操纵序列。或者，所述第二聚核苷酸包含如SEQ ID NO 17所示的序列，或如SEQ ID NO 17所示序列的碱基互补序列。
所述启动子能被λ噬菌体阻遏蛋白CI及λ噬菌体阻遏蛋白CI的突变体抑制转录。
本发明所述的启动子可以是天然启动子，天然启动子的突变型，或人工构建的启动子。在某些实施例中，所述的启动子为天然启动子，所述天然启动子包含但不限于λPL，λPR。在某些实施例中，所述的启动子为天然启动子的突变型，如在天然启动子核苷酸序列中出现一个或多个碱基置换、插入或删除。在某些实施例中，所述的启动子为人工构建的合成启动子。
本发明所述的启动子是热诱导启动子、化学诱导启动子或辐射诱导启动子。
所述第二聚核苷酸是质粒。当然，所述第二聚核苷酸也可以是噬菌体基因组，转座子，或者是在宿主基因组中的核苷酸序列。所述质粒是在能够在宿主中复制的任何一种质粒载体的基础上构建的。质粒载体包括但不限于pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pSC101质粒，和它们的衍生质粒。进一步，所述质粒包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽的表达受所述启动子控制。优选地，所述多肽包括酶和多肽类药物。所指的酶包括氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂合酶，异构酶和连接酶中的至少一种。又更进一步，所述酶是氨基酸脱羧酶，如是赖氨酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶，精氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。多肽类药物包括激素，抗体，生长因子等。在一个实施例中，表达的多肽是胰岛素原。在另一个实施例中，所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。又更进一步优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸选自下列的至少一种：cadA基因，ldcC基因，haldc基因及cadA基因、ldcC基因、haldc基因的片段。或者，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是序列如SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的DNA，或序列如SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4所示的DNA的片段。
本发明还涉及一种转化子，所述转化子包含如上文任一技术方案所述的聚核苷酸。优选地，所述转化子包含如上任一技术方案所述的聚核苷酸，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述转化子还表达λ噬菌体阻遏蛋白CI(简称λCI)或其突变型，优选热不稳定型λCI蛋白。热不稳定型λCI蛋白在较低温度能够抑制L或R启动子的转录，而当温度升高时则失去抑制活性。所述的热不稳定型λCI蛋白包括但不限于CI857，I21S，G53S，A62T，V73A，F141I/P153L，N207T，K224E。CI857与野生型相比在第66位氨基酸残基位点上由丙氨酸变为苏氨酸。在某些实施例中，CI857进一步包含其他氨基酸残基位点的突变，所述其他氨基酸残基位点的突变不影响其第66位氨基酸残基位点突变所导致的对温度敏感的特性。
在一个实施例中，所述转化子中含有编码λ噬菌体阻遏蛋白CI或其突变型的聚核苷酸。进一步地，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在质粒上。更进一步地，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸与所述编码多肽的聚核苷酸在同一个质粒上。或者，所述编码λCI或其突变型的聚核苷酸在宿主基因组中。所述转化子的宿主为原核生物细胞。进一步，所述转化子的宿主包括大肠杆菌，蜂房哈夫尼菌，谷氨酸棒杆菌，丙酮丁醇梭菌，枯草芽孢杆菌。
本发明的优选的一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：
A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；
B)从步骤A中得到的菌液或菌体中得到多肽。
优选地，所述一种发酵生产多肽的方法是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：
1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(当然，所述技术方案中所述多肽包括赖氨酸脱羧酶)；
2)从步骤1中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。
在优选的实施例中，发酵过程中使用了诱导条件。所述的诱导条件为热诱导，化学诱导，或辐射诱导。优选地，诱导条件为热诱导，所述诱导条件指温度为32℃-48℃。
一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：
I)按照上文所述的发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1生产赖氨酸脱羧酶；
II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。
实施例1.
本实施例中提到的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。
1.1含有受CI857调控的野生型λPR启动子的表达质粒的构建
以λ-HindIII digest DNA(购自宝生物工程(大连)有限公司)为模板，用引物1和2(引物1的序列见SEQ ID NO：5，引物2的序列见SEQ ID NO：6)扩增含部分cI857基因的序列；用引物3和4(引物3的序列见SEQ ID NO：7，引物4的序列见SEQ ID NO：8)扩增含部分cI857基因和R启动子的序列。再用overlap PCR方法，以上述两PCR产物为模板，用引物1和4扩增含有cI857基因和R启动子的序列，用内切酶BamHI和BglII(均购自宝生物工程(大连)有限公司)酶切该overlap PCR产物。以pPlac-cadA质粒(制备方法见中国发明专利申请CN201210177392.X的实施例1，公开号CN102851307A，公开日2013-01-02)为模板，用引物5和6(引物5的序列见SEQ ID NO：9，引物6的序列见SEQ ID NO：10)扩增含载体骨架和cadA基因的序列，同样用BamHI和BglII酶切。将两酶切产物连接，转化大肠杆菌JM109(购自北京博迈德基因技术有限公司)，得到质粒pPR-cadA。
为了去除cadA基因上游的BglII酶切位点，以pPR-cadA为模板，用引物7和8(引物7的序列见SEQ ID NO：11，引物8的序列见SEQ ID NO：12)进行PCR复制。用内切酶DpnI(购自宝生物工程(大连)有限公司)和BglII处理PCR产物。将PCR产物转化JM109。提取转化子质粒，用引物9(引物9的序列见SEQ ID NO：13)对cadA基因上游序列测序。测序检验正确(去除BglII位点)的质粒命名为pPR2-cadA(图1)。
1.2含有突变型λPR T-41C和G-38A/T-41C启动子的表达质粒的构建
以pPR2-cadA为模板，用引物1和10(引物10的序列见SEQ ID NO：14)扩增含cI857基因和部分λPR的序列，用引物11和12(引物11的序列见SEQ ID NO：15，引物12的序列见SEQ ID NO 16)扩增含部分λPR序列和部分cadA基因的序列。再用overlap PCR方法，以上述两PCR产物为模板，用引物1和12扩增得到含修改后λPR序列(即λPR T-41C)的PCR产物，用BamHI和XhoI酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)切该PCR产物。将pPR2-cadA质粒用BamHI和XhoI酶切，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化～4.5kb的DNA片段(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，购自康宁生命科学(吴江)有限公司)，与上述酶切后的PCR产物连接，转化JM109。用引物12对几个转化子质粒测序，发现除了得到预期的λPR T-41C突变型，还得到一个λPR G-38A/T-41C双突变型。将含有λPR T-41C突变型的质粒命名为pPRT41C-cadA，含有λPR G-38A/T-41C双突变型的质粒命名为pPRG38AT41C-cadA。
1.3含有野生型和突变型λPR启动子的表达质粒的表达
将JM109/pPRT41C-cadA和JM109/pPRG38AT41C-cadA单菌落接种于LB/Amp液体中(氨苄青霉素浓度为100mg/L)，30℃摇床培养过夜。将菌液以1％v/v接种于新鲜LB/Amp中，30℃摇床培养3hr。将每份菌液分为3份，分别在30℃、37℃和42℃摇床中培养过夜，取1ml菌液，离心收集菌体。
制备SDS-PAGE分离胶，组份包含：10％w/v丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺(29/1)，0.375M Tris-HCl(pH8.8)，0.1％w/v SDS，0.1％w/v过硫酸铵，0.04％v/v TEMED。将收集的菌体样品分别用600μl无菌水悬浮。各取15μl悬浮液，加5μl 4×SDS-PAGE上样液(购自宝生物工程(大连)有限公司)混匀，沸水浴中加热5min。将上述20μl样品全部上样电泳。蛋白分子量用宝生物工程(大连)有限公司的蛋白分子量标准(宽)指示。电泳胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色，其组份包含：0.1％w/v考马斯亮蓝R-250，25％v/v异丙醇，10％v/v冰醋酸。
电泳图见图3，重组表达蛋白CadA在电泳图中的位置用黑色箭头指示。其中泳道1和4是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，并继续在30℃培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道2和5是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到37℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白；泳道3和6是各重组菌接种以后在30℃培养3hr，将温度提高到42℃，继续培养过夜后所收集菌体的蛋白。
由图3中可见，两种质粒的CadA表达量都随温度升高而升高(对比泳道1-3，4-6)，但含有λPR启动子单碱基突变T-41C的质粒pPRT41C-cadA表达量在诱导温度(42℃)的表达量不足pPRG38AT41C-cadA的一半(对比泳道3和6)。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 凯赛生物产业有限公司
<120> 一种聚核苷酸、转化子及其应用
<130> 123456789
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> operator
<400> 1
taacaccgcg catgttg 17
<210> 2
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
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