发明的领域
本发明涉及见于丝状真菌特别是曲霉属真菌中的转录因子，编码所说 的因子的DNA序列，其向真菌宿主生物体中的转化和在其中的表达，以 及所说的因子在这类宿主中为增加由所说的宿主产生的有用多肽的表达 中的应用。
发明的背景
转录因子是已知参予转录起始的蛋白质。已在许多不同的生物中对其 进行了广泛研究，并也已描述了真菌中的转录因子。Dhawale和Lane (NAR(1993)21，5537-5546)最近整理了有包括丝状真菌在内的真菌中 的转录因子的资料。
转录因子中有许多都是调节蛋白质，它们与启动子DNA结合并且作 为刺激细胞的反应，激活或抑制转录过程。
在对可利用的碳源的反应中，α淀粉酶基因在米曲霉中的表达受到调 节。当生物体在淀粉或麦芽糖基质上生长时，基因得以最大水平地表达 (Lachmund等人(1993)当代微生物学26，47-51；Tada等人，(1991) Mol.Gen.Genet.229，301-306)。如Lachmund等人(引文同上)所显 示，α淀粉酶基因的表达在转录水平上受到调节，这一结果强有力地提示 转录因子参予调节作用，但迄今尚未鉴定出这种因子的基因。
已通过缺失分析研究了α淀粉酶基因的启动子(Tada等人，(1991) 农业生物化学，55，1939-1941；Tsuchiya等人(1992)生物科学·生 物技术·生物化学，56，1849-1853；Nagata等人(1993)Mol.Gen. Genet.237，251-260)。这些文章的作者提出，启动子的特异性序列是麦 芽糖诱导作用的主要原因。Nagata等人(引文同上)使用该序列作为凝胶 移位实验中的探针，观察构巢曲霉(A.nidulans)核提取物中的任何蛋白质 是否能够与启动子序列结合。发现了三种这样的蛋白质，但未能证明这些 蛋白质参予表达。没有用其他手段纯化或鉴定出这些蛋白质。对它们的基 因同样也是不清楚的。
发明的概要
本发明涉及调节α淀粉酶启动子在丝状真菌中表达的转录因子。
因此，本发明的第一个方面涉及含有编码本发明转录因子的DNA序 列的DNA构建物，其DNA序列包括
a)克隆到存在于大肠杆菌ToC1058，DMS10666中的质粒pToC320内的 DNA序列的转录因子编码部分；或
b)a)中限定的DNA序列的类似物，该类似物
i)与a)中限定的DNA序列至少有60％同源性，或者
ii)与a)中限定的DNA序列的同样核苷酸探针杂交，或者
iii)编码与由含有a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的转录因子 至少有50％同源性的转录因子，或者
iv)编码与抗a)中限定的DNA序列编码的纯化的转录因子的抗体有 免疫学反应性的转录因子，或者
v)弥补ToC879中的突变，即能够使ToC879在环糊精基质上生长， 并且当用所说的DNA序列转化时产生脂酶。
已从丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的菌株中得到了编码转录 因子的全长度基因组DNA序列，并已克隆到存在于大肠杆菌ToC1058， DSM10666中的质粒pToC320中。
据信包含于pToC320，DSM10666中的所说的转录因子编码DNA序 列具有如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中给出的同样序列。因此，每当 提到克隆到DSM10666中的质粒pToC320内的DNA序列的转录因子编 码部分时，也都是指SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中给出的DNA序列 的转录因子编码部分。
因此，术语“克隆到存在于DSM10666中的质粒pToC320内的DNA 序列的转录因子编码部分”和“SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中给出的 DNA序列的转录因子编码部分”是可以互换的。
本发明的再一个方面提供包含本发明DNA构建物的表达载体，含有 所说的DNA构建物或所说的表达载体的细胞，以及生产表现有转录因子 活性的肽的方法，该方法包括在得以产生转录因子的条件下培养所说的细 胞。
本发明的这样一种转录因子典型地是来源于丝状真菌。
术语“丝状真菌”可包括藻状菌纲(Phycomycetes)、接合菌纲 (Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomyectes)、担子菌纲(Basidiomyeetes)和包 括丝孢菌纲在内的不完全真菌，如曲霉属、青霉属、木霉属、镰孢属 (Fusarium)和腐质霉属(Humicola)。
本发明还涉及生产丝状真菌宿主细胞的方法，其包括将编码任何一个 这样的因子的DNA片段导入丝状真菌中，其中α淀粉酶启动子或共调节 的启动子以一种使所说的因子将在所说的真菌中表达的方式调节有用多 肽的表达。
本发明的再一个方面涉及生产其表达受α淀粉酶启动子或共调节启 动子调节的有用多肽的方法，该方法包括在适于产生所说的因子和所说有 用多肽的条件下培养如上描述的丝状真菌宿主细胞，并回收所说的有用多 肽。
最后本发明涉及所说的因子用于调节有用的多肽在丝状真菌中表达 的用途。
本文中，调节作用是指改变使本发明的因子具有活性的条件。例如改 变不同的pH、底物等环境因素，从而所产生的效果是改善对有用蛋白质 的表达的调节。
此外，调节作用还包括出现于转录因子有活性的真菌生长期的过程。 依据环境的不同，提前和/或延迟使因子保持活性的这个阶段，可提高表 达水平并进而提高产率。
再者，可使用本领域已知的标准方法，鉴定参予转录因子结合的特异 性DNA序列，因而有可能将这样的序列插入到正常情况下不受因子调节 的其他启动子中，并使那些启动子处于所说的因子的调节之下。
附图简要说明
图1显示质粒pMT1657的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；
图2显示质粒pToC316的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；
图3显示质粒pToC320的结构，实施例1中描述了该质粒的构建；
图4显示质粒pToC342和pToC359的结构，实施例3中描述了这些 质粒的构建；
图5显示质粒pToC298的结构，实施例4中描述了该质粒的构建；
图6显示与培养在含有2％葡萄糖(-□-)或10％葡萄糖(-◇-)的 YP培养基中的并在实施例4中描述的ToC1075相比较，由培养在含有 2％葡萄糖(-■-)或10％葡萄糖(-◆-)的YP培养基中的米曲霉 IFO4177的p960转化体产生脂酶的实验结果；
图7显示与培养在含有2％葡萄糖(-□-)或10％葡萄糖(-◇-)的 YP培养基的并在实施例4中描述的ToC1075相比较，培养在含有2％葡 萄糖(-■-)或10％葡萄糖(-◆-)的YP培养基中的ToC1139的脂酶生 产量。
图8显示用下列限制性酶消化的黑曲霉DNA的放射自显影谱，泳道 2，XbaI；泳道3，XmaI；泳道4，SalI；泳道5，HindIII，泳道6，EcoRI； 泳道7，BglII；泳道8，BamHI；泳道1和9含有32P标记的BstEII消化 的IDNA。实施例5中描述了该实验。
发明的详细描述
本发明的第一个方面涉及含有DNA序列的DNA构建物，所说DNA 序列编码调节α淀粉酶启动子的转录因子，该DNA序列包括
a)克隆到存在于大肠杆菌Toc1058，DMS10666中的质粒pToC320内的 DNA序列的转录因子编码部分；或
b)a)中限定的DNA序列的类似物，该类似物
i)与a)中限定的DNA序列至少有60％同源性，或者
ii)与a)中限定的DNA序列的同样核苷酸探针杂交，或者
iii)编码与由含有a)中限定的DNA序列的DNA序列编码的转录因子 至少有50％同源性的转录因子，或者
iv)编码与抗a)中限定的DNA序列编码的纯化的转录因子的抗体有 免疫学反应性的转录因子，或者
v)弥补ToC879中的突变，即能够使ToC879在环糊精基质上生长， 并且当用所说的DNA序列转化时产生脂酶。
如本文限定的，克隆到存在于大肠杆菌ToC1058中的质粒pToC320 内的DNA序列的转录因子编码部分的类似DNA序列，是指编码调节α 淀粉酶启动子的转录因子的任何DNA序列，所说的转录因子具有上文(i) -(v)所列出的一种或多种性质。
可以从产生转录因子的丝状真菌米曲霉，或另一种或相关生物体的菌 株中分离类似的DNA序列，因此其可以是克隆到存在于DSM10666中的 pToC320内的DNA序列的转录因子编码部分的等位变异体或种变异体。
或者，也可以基于作为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的转录因子编 码部分给出的DNA序列，例如其亚序列，和/或通过导入并不产生由DNA 序列编码的转录因子的另一个氨基酸序列，但相当于产生转录因子的宿主 生物体的密码子选择的核苷酸取代，或者通过导入可产生不同的氨基酸序 列的核苷酸取代来构建类似序列。
当进行核苷酸取代时，氨基酸残基的改变最好是次要性质的改变，即 不会显著地影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代，并且有一般为一 个至大约30个氨基酸残基的小的缺失，或小的氨基或羧基末端延伸。
保守取代的例子是在碱性氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸 性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(例如谷氨酸胺和天冬酰 胺)、疏水氨基酸(例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、芳族氨基酸(例如苯 丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)和小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏 氨酸、蛋氨酸)内的取代。有关核苷酸取代的一般性描述可参见Ford，等 人，(1991)，蛋白质的表达和纯化2，95-107。
本领域技术人员很清楚的是，可以在对于分子的功能很关键的并且仍 可产生活性转录因子的区域之外进行这些取代。可以按照本领域已知的方 法，例如位点特异性诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和 Wells，(1989)，科学244，1081-1085)鉴定那些对于由本发明的DNA构建 物编码的转录因子的活性必不可少的，并且因而最好不被取代的氨基酸残 基。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入突变，并试验所得突变分 子的生物学活性(即调节α淀粉酶启动子的转录因子)，以鉴定那些对分子 的活性至关重要的氨基酸残基。
上文(1)中所提到的同源性被确定为表明一个序列从另一序列衍生的 两个序列间的同一性程度。可以借助本领域已知的计算机程序例如GCG 程序包中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生 物学杂志48，443-453)来适当地确定同源性。使用有下列用于DNA序 列比较的设定的GAP：5.0的GAP创制补偿和0.3的GAP延伸补偿， DNA序列的编码区与SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中所示DNA序列的 转录因子编码部分一般表现有至少60％，较好至少70％，更好至少 80％，最好至少90％的同一性程度。
上文(ii)中提到的杂交是指在下文材料和方法部分中详细描述的在某 些特定条件下与编码转录因子的DNA序列的同样探针杂交的类似DNA 序列。待使用的寡核苷酸探针是相当于SEQ ID No：1或SEQ ID No：2中 所示DNA序列的转录因子编码部分的DNA序列或其片段。
上文(iii)中所提到的同源性被确定为两个序列间的同一性程度，借以 表明第一个序列衍生于第二个序列。可借助本领域已知的计算机程序，例 如GCG程序包中提供的GAP(Weedleman，S.B.和Wunsch，C.D.，文献出 处同上)适当地确定同源性。使用有下列用来进行转录因子序列比较的设 定的GAP：3.0的GAP创制补偿和0.1的GAP延伸补偿，由类似DNA 序列编码的转录因子与由含有SEQ ID No：2中所示DNA序列的转录因子 编码部分的DNA构建物编码的转录因子，例如与氨基酸序列SEQ ID No：3表现有至少50％，较好有至少60％，更好有至少70％，特别是有 至少80％，最好有90％的同一性程度。
可按照下文材料和方法部分中所述的方法确定性质(iv)中所提到的免 疫学反应性。
下文实施例1中描述了有关性质(v)的弥补方法。
可使用例如Sambrook等人，(1989)分子克隆，实验室手册，冷泉港实 验室，冷泉港，纽约所述的标准方法，从米曲霉菌株IFO4177中分离编码 本发明的转录因子的DNA序列。
WO 93/11249和WO 94/14953中公开了分离RNA和DNA的一般方 法(这些文献列为本文参考文献)。下文实施例1中给出了补偿方法的详细 描述。
另外，也可以按照已知的方法，使用基于本文公开的DNA序列制备 的合成寡核苷酸探针，从适当的来源，例如下文提到的任何一种生物中方 便地分离编码本发明的转录因子的DNA。例如，可以基于如SEQ ID No：1 所给出的核苷酸序列的转录因子编码部分或其适当的亚序列，或基于氨基 酸序列SEQ ID No：3制备适当的寡核苷酸探针。
本发明特别涉及调节丝状真菌中α淀粉酶启动子的表达的转录因 子，实施例2中所指出的因子甚至可调节其他基因的表达。
本文中所使用的术语“丝状真菌”倾向于包括藻状菌纲、接合菌纲、 子囊菌纲、担子菌纲、和包括丝孢菌纲在内的不完全真菌如曲霉属、青霉 属、木霉属、镰孢属和腐质霉属。
本文中所使用的术语“α淀粉酶启动子”是指直接接在α淀粉酶基因 上游的碱基序列，RNA聚合酶识别α-淀粉酶基因并与之结合，以促进 编码α淀粉酶基因的转录。
如所指出的，已知转录因子来自许多生物体，因此可望从曲霉属、木 霉属、青霉属、镰孢属和腐质霉属等其他真菌中发现对于上述这些属的任 何真菌中的淀粉酶启动子调节下的多肽的表达具有提高效果的相似或相 应因子。
比较编码用来调节α淀粉酶启动子的转录因子的DNA序列后显示， 其与调节念珠菌中葡糖苷酶表达的转录因子(CASUCI)及Kelly和Kwon -Chung(1992)细菌学杂志174，222-232中所公开的酿酒酵母的 MAL63有某种程度的同源性。
目前可预期从其他微生物中，可以得到编码与本发明的转录因子同源 的转录因子的DNA序列，即类似DNA序列。例如，可按类似方法筛选 另一种微生物，例如曲霉属、酵母属、欧氏杆菌属、镰孢属或木霉属菌株 的cDNA文库，以得到DNA序列。
发明人已按照国际公认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的 规定，将已失活的含有编码本发明转录因子的基因的米曲霉菌株的分离物 保藏在DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig， DEUTSCHLAND)。
保藏日期：1996年5月6日(06.05.96)
保藏人的参考号：ToC879＝NN049238
DSM命名：米曲霉DSM No.10671
可以使用已保藏的米曲霉菌株DSM NO.10671从米曲霉的任何菌株 中以及按下述方法弥补后带有这样的基因的任何其他真菌菌株中分离根 据本发明的转录因子。
已将含有编码本发明的转录因子的全长度基因组DNA序列的表达质 粒pToC320转化到大肠杆菌菌株中，并且发明人已按照国际公认用于专 利程序的微生物保藏布达佩斯条件的规定，将所得到的菌株ToC1058保 藏在DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.，Mascheroder Web 1b，D-38124 Braunschweig， DEUTSCHLAND)。
保藏日期：1996年6日(06.05.96)
保藏人的参数号：ToC1058＝NN049237
DSM命名：大肠杆菌DSM NO.10666
根据本发明，优选来源于米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori) 等，特别是米曲霉IFO4177的这种类型的因子。
已发现本发明的转录因子不仅参予调节α淀粉酶启动子，而且还参 予调节米曲霉的葡糖淀粉酶启动子。
特别是，本发明包括具有如SEQ ID No：3中所示氨基酸序列的，包 括其一个或多个片段或片段组合的任何因子。
截短形式的转录因子也可能是有活性的。术语“截短形式”是指对转 录因子的修饰，其中N末端，C末端或一个或多个内部片段已被删除。
本发明的再一个方面涉及编码其中任何一种因子的DNA序列
在这个方面，本发明特别包括编码SEQ ID No：3中所示氨基酸序列 的一个或多个片段的任何DNA序列。
更具体地说，本发明涉及包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中所 示DNA序列的一个或多个片段或片段组合的DNA序列。
根据另一个方面，本发明涉及生产丝状真菌宿主细胞的方法，其包括 将上文提到的任何一个DNA片段导入丝状真菌内，其中α淀粉酶启动子 或另一个被共调节的启动子以某种方式调节有用多肽的表达，从而所说的 因子将在所说的真菌中被表达。
可借助任何已知的将DNA导入丝状真菌中的标准方法，例如使用如 下文所述的表达载体和宿主细胞导入所说的DNA片段。
因此，本发明还提供包括本发明的DNA构建物的重组表达载体。
本发明的表达载体可以是能方便地经受重组DNA处理的表达载体， 并且载体的选择常常依赖于将向其中导入该载体的宿主细胞。
因此，载体可以是自动复制载体，即作为染色体外整体存在的载体， 其复制不依赖于染色体的复制，例如可以是质粒。另外，载体可以在被导 入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与已被导入的染色体一起复 制。
在表达载体中，编码转录因子的DNA序列还应含有正常情况下与转 录因子相联系的表达信号，或者应被可操作地连接到适当的启动子和终止 子序列上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示有转录活性的任何 DNA序列，并且其可衍生于与宿主细胞同源或异源的基因。用于将编码 转录因子的DNA序列分别与启动子和终止子连接，并将它们插入适当的 载体中的方法是本领域技术人员已知的(参见Sambrook，等人，文献同 上)。
用于丝状真菌宿主细胞中的适当的启动子例如可以是构巢曲霉 ADH3启动子(McKnight，等人(1985)The EMBO J.4，2093-2099)或 tpiA启动子。其他有用的启动子的例子是那些衍生于编码米曲霉α淀粉 酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α淀粉酶、黑曲霉、泡盛曲霉 或米曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、米曲霉碱性蛋白酶(alp)、米曲霉硝酸盐还原 酶(niaD)、黑曲霉丙糖磷酸异构酶(tpi)、构巢曲霉乙酰胺酶等基因的启动 子，或者编码氨基酸生物合成基因如argB的曲霉启动子。
在另一个方面，本发明提供含有本发明的DNA构建物和/或本发明的 重组表达载体的宿主细胞。
本发明的宿主细胞较好是真核细胞，特别是例如酵母或丝状真菌细胞 等真菌细胞。具体地说，细胞可以属于木霉属，较好是Trichoderma harzianum或Trichoderma reesei，或曲霉属，最好是米曲霉或黑曲霉。 可以使用包括原生质体形成和原生质体转化，然后按已知方式再生细胞壁 的方法转化真菌细胞。EP238023(Novo Nordisk A/S)中描述了曲霉作为 宿主微生物的使用方法(其内容列为本文参考资料)。宿主细胞还可以是酵 母细胞，例如酵母属的菌株，特别是酿酒酵母、克鲁弗酵母(S.Kluyveri) 或葡萄糖酵母(S.uvarum)，裂殖酵母属的菌株，例如粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)，汉逊氏酵母属、毕赤酵母属、Yarrowia sp.例如Yarrowia Lipolytica或克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)，例如乳 酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
可用其他方法删除或失活宿主细胞的内源性amyR基因。然后用异源 性启动子导入amyR控制将导致α淀粉酶启动子的全新调节流程。例如， 如果将amyR融合到米曲霉niaD启动子上，α淀粉酶启动子将成为可由 硝酸盐诱导的。如果使用palC调节的启动子代替niaD启动子，则α淀 粉酶启动子的活性将受pH的调节。
本发明还包括生产感兴趣的多肽的方法，因而在适于产生所说的因子 和感兴趣的多肽的条件下培养上述宿主细胞，并回收所说的感兴趣的多 肽。
用于培养被转化的宿主细胞的培养基可以是适于所研究的宿主细胞 生长的任何常规培养基。被表达的感兴趣的多肽可被分泌到培养基中，并 可用已知方法从中回收之，这些已知方法包括经离心或过滤从培养基中分 离细胞，借助盐析法(例如使用硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分，然后 进行层析，例如离子交换层析、亲合层析等。
根据本发明，可使用上述方法生产有用的多肽，即药用多肽，特别是 例如生长激素、胰岛素、凝血因子等药用多肽。
也可使用本发明的方法生产工业酶，例如蛋白酶、脂酶、淀粉酶、葡 糖淀粉酶、氯化还原酶、糖酶、碳酰水解酶、纤维素酶、酯酶等。
根据本发明的另一个方面，可使用所说的转录因子提高感兴趣的多肽 在丝状真菌，例如曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属、腐质霉属等的菌株， 特别是米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉，并且最好是米曲霉中的表达。
因此可使用本发明的转录因子提高药用多肽例如生长激素、胰岛素、 凝血因子等的表达。
另外，可使用本发明的转录因子提高蛋白酶、脂酶、淀粉酶、葡糖淀 粉酶、氧化还原酶、糖酶、碳酰水解酶、纤维素酶、酯酶等工业酶的表达。
还可使用转录因子鉴定其与之结合的α淀粉酶启动子中的序列。例 如，可为此而制造适于在大肠杆菌中生产的，与AmyR的DNA结合区例 如锌指形成的GST融合蛋白质。可使用市售的药盒，例如“GST基因融 合药盒”(“The GST Gene Fusion Kit”)(Pharmacia)方便地制得这样的 融合蛋白质。然后可在常规体外技术如凝胶移位检测法或DNA足迹分析 法(Kulmburg，Lutfiyya，L.L.，和Johnston，M.，(1996)分子和细胞生物 学16，4790-4797)中使用纯化的GST融合蛋白质。鉴定AmyR结合位 点将有可能将这些序列插入到正常情况下不受AmyR调节的其他启动子 中。
材料和方法
杂交：
可按下述方法限定确定核苷酸探针与本发明的“类似”DNA序列间 杂交的适当杂交条件。待使用的寡核苷酸探针是相当于SEQ ID No：1中 所示DNA序列的转录因子编码部分的DNA序列，即SEQ ID No：1中的 核苷酸1691…2676+2743…3193+3278…3653，或其片段，如SEQ ID No：1中的核苷酸1770-1800。
杂交条件
决定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列间杂交的适当条件包括将 含有DNA片段或待杂交的RNA的滤膜在5xSSC(标准柠檬酸盐缓冲液) 中预浸渍10分钟，并使滤膜在5xSSC(Sambrook，等人，文献同上)、5X Denhardt氏溶液(Sambrook等人，文献同上)、0.5％SDS和100μ g/ml变性的并超声处理的鲑精DNA(Sambook，等人，文献同上)的溶液中 预杂交，然后于大约65℃在含有随机引导的(Feinberg，A.P.和 Vogelstein，B.(1993)分析生物化学，132，6-13)、32p-dATP标记的(比 活性＞1×109cpm/μg)探针的同样溶液中杂交12小时。然后，在不高于 50℃，较好不高于60℃，更好不高于65℃，最好不高于70℃，特别是 不高于75℃的温度下，在2XSSC、0.5％SDS中将滤膜洗两次(30分钟)。
使用Phospho Image检测器检测在这些条件下与核苷酸探针杂交的 分子。
免疫学交叉反应性
可以使用纯化的转录因子制备用于确定免疫学交叉反应性的抗体。更 具体地说，可以按照N.Axelsen等人在“定量免疫电泳手册”(Blackwell Scientific Publications，1973，第23章)或A.Johnstone和R.Thorpe在“免 疫化学实践”(Blockwell Scientific Publications，1982，特别是第27-37 页)中所述的方法，经免疫兔(或啮齿动物)产生抗本发明转录因子的抗血 清。例如通过盐析((NH4)2SO4)、透析及离子交换层析(例如使用DEAE -Sephadex柱)从抗血清中制得纯化的免疫球蛋白。可以使用 Outcherlony双向扩散法(O.Ouchterlony，实验免疫学手册(D.M.Weir 编辑)，Blackwell Scientific Publications，1967，pp.655-706)、交叉免 疫电泳法(N.Axelsen等人，文献同上，第3和4章)，或火箭免疫电泳(N. Axelsen等人，上述文献第2章)鉴定蛋白质的免疫化学特征。
实施例
实施例1：从米曲霉克隆amyR转录因子
补偿不能表达两种均处于TAKA淀粉酶启动子控制下的不同蛋白质 的米曲霉突变菌株以克隆amyR。经诱变含有处于TAKA启动子控制下 的编码脂酶(HLL)的cDNA和一个从其自身启动子转录的TAKA淀粉酶 基因拷贝的菌株SRe440，制得突变的米曲霉菌株ToC879。
根据其淀粉酶阴性(淀粉酶-)表型以及进而显示为脂酶阴性(脂酶-)来 鉴定和分离突变株。
菌株ToC879含有两表达盒的完整拷贝。淀粉酶-表型使ToC879不能 在含有1％环糊精作为唯一碳源的平皿上生长，而亲本菌株SRe440将会 在这样的平皿上生长。
ToC879已被保藏在DSM，保藏号为DSM NO.10671。
用米曲霉粘粒文库和携带来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(其赋予抗glufosinate抗性)的自动复制pHel p1 基质粒(D.Gems，I.L.Johnstone，和A.J.Clutterbuck(1991)基因98，61 -67)共转化ToC879，以分离amyR。在含有作为唯一碳源的环糊精的 平皿上选择并根据同时逆转成脂酶+表型来筛选转化体。
从能够在环糊精上生长的菌落中拯救转化DNA。亚克隆后得以分离 出能够弥补ToC879的两种表型的4.3kb DNA片段。隐藏在该片段中的 基因被定名为amyR。
pHelp1衍生质粒pMT1657的构建
连接(并且其后转化到大肠杆菌DH5a中)下列四个片段以制备质粒 pMT1612：
i)用SphI/XbaI切割的大肠杆菌载体pToC65(参见EP531372)，
ii)用SphI/BamHI切割的PCR片段(含有构巢曲霉amdS启动子)，
iii)含有bar基因的pBP1T(B.Staubinger等人(1992)真菌遗传学通讯 39，82-83)中的0.5kb BamHI/XhoI片段，以及
iv)含有黑曲霉葡糖淀粉酶转录终止子的pIC AMG/Term(EP申请 NO.87103806.3)中的0.7kb XhoI/XbaI片段。
使用作为底物DNA的质粒pMSX-6B1(M.E.Katz等人，(1990) Mol.Gen.Genet.220，373-376)和作为引物的两个寡核苷酸4650(SEQ ID No：4)和4561(SEQ ID No：5)制得含有amdS启动子的PCR片段。
4650：CTTGCATGCCGCCAGGACCGAGCAAG， SEQ ID NO：4
4651：CTTGGATCCTCTGTGTTAGCTTATAG. SEQID NO：5
pMSX-6B1含有称为I666的amdS启动子上游突变。
用HindIII切割pMT1612，去磷酸化并连接到得自含有AMA1序列 的pHelp1的5.5kb HindIII片段上。所得到的质粒pMT1657是在曲霉菌 中自我复制并可根据glufosinate抗性的增加选择的。图1中图解显示了 pMT1657，其中PamdS代表上述片段ii)的amdS启动子，bar代表上 述片段iii)，Tamg代表上述片段iv)。
粘粒文库的构建
基本上按照“SuperCos1粘粒载体药盒”(Stratagene Cloning Systems，La Jalla CA，USA)的供应商提供的说明书构建米曲霉的粘粒文 库。
从按标准方法(Christensen，T.，等人(1988)，生物技术6，1419- 1422)制得的原生质体制备米曲霉IFO4177的基因组DNA。
分离后，在Labofuge T(Heto)中以2500rpm离心5分钟沉淀原生质 体；然后按Supercos 1粘粒载体药盒的使用手册所述，将沉淀物悬浮于 10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100μg/ml 蛋白酶K和0.5％SDS中；按药盒说明书完成DNA制备。
使用CHEF-凝胶装置(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA， USA)，以电泳法分析基因组DNA的大小。1％琼脂糖凝胶以200瓦电 流，10-50秒脉冲电泳20小时。用溴化乙锭染凝胶并进行照相。DNA 大小为50-100kb。使用Sau3A部分消化DNA。按上述方法用同一类 型的CHEF凝胶进行电泳分析，确定被消化的DNA大小为20-50kb。 按照手册中所述制备CsCl梯度分带的SuperCos1载体。同样按手册中所 述方法进行连接和包装。
滴定文库之后，将得自一次连接并包装的所有包装混合物转化到宿主 细胞XL1-Blue MR中，并铺敷在50μg/ml氨苄青霉素LB平皿上。 得到大约3800个菌落。得自10个菌落的粘粒制备物显示，它们均具有预 期大小的插入片段。挑取个别菌落，接种于含100μl LB(100μg/ml氨 苄青霉素)的微量滴定板的各孔内，并于37℃保温过夜。向各孔内加入100 μl50％甘油并将整个文库置于-80℃下冷冻保存。共贮存3822个菌落。
这个量代表米曲霉基因组的大约4.4倍。挑取菌落后刮去平皿中培养 物，合并刮除物并将总文库分4个集合体作为冷冻的甘油原液贮存。4个 集合体定名为ToC901-ToC904。
使用配合到微量滴定皿的一半中的8针6排多针装置将文库中的个别 冷冻的菌落接种到LB平板(100μg/ml氨苄青霉素)上。制作含有来自文 库中所有克隆的菌落的平板。
将平板于37℃保温过夜。将切成平皿大小的灭菌的Whatman 540 滤膜放在已经过37℃保温2小时以上的菌落上。将滤膜转移到含有200 μg/ml氯霉素的LB平板上并于37℃保温过夜。
第二天用0.5M NaOH将滤膜洗两次(每次5分钟)，再在0.5MTris -HCl(pH7.4)中洗两次(每次5分钟)，然后在2XSSC中洗两次(每次5分 钟)。用乙醇浸湿滤膜并风干。
amyR克隆的选择
从ToC901-904制备粘粒DNA，并与pMT1657共转化导入ToC879 中。转化方法如EP申请NO.87103806.3中所述。根据在含有1M蔗糖(用 于渗透灭菌)和10mM(NH4)2SO4的基本培养基平板(Cove D.J.(1966)BBA 113，51-56)中对1mg/ml glufosinate的抗性选择出大约8700个转化体。
在同一类型平板上再一次分离随机选择的转化体。将得自这些10个 转化体的分生孢子接种于含有1mg/ml glufosinate的基本培养基中，并于 30℃培养到可收集到足够用来制备DNA的菌丝体。按T.Christensen等 人(文献同上)所述的方法制备DNA。
将未切割的DNA加于0.7％琼脂糖凝胶上并进行电泳分离，然后进 行Southern印迹分析。印迹与32P标记的SuperCos1特异性DAN片段 杂交。10个转化体中，每个都显示出一条比线性染色体DNA有更高迁 移率的带。每条带也都与pHelp1特异性探针杂交，表明粘粒文库的共转 化频率接近于100％，并且粘粒都已整合到了自动复制载体pHelp1中。
如所预期的pHelp1转化体那样，这些转化体是不稳定的。得自 glufosinate抗性菌落的10％以下的分生孢子产生了glufosinate抗性子 代。
以8份集合体收集所有转化体的分生孢子，并铺板在含有1mg/ml glufosinate、10mM(NH4)2SO4和1％β环糊精(Kleptose得自Roquette Freres′，62136 Lestem，France)的基本培养基平板(Cove D.J.，文献同上) 上。
从其中一个集合体中得到4个菌落，并从一个其他集合体中得到1个 菌落。在同种类型平板上再一次分离第一个集合体中的两个菌落。
将得自再次分离的菌落中的分生孢子铺板在以葡萄糖或环糊精作为 碳源的基本平板上和含glufosinate的平板上。glufosinate抗性和在环糊 精上生长的能力都是不稳定的表型，并有同样程度的不稳定性。这表明赋 予在环糊精上生长能力的基因在物理上是与转化体中的pMT1657连接 的。
从再分离平板中切出菌落并使用抗HLL脂酶抗体以火箭免疫电泳法 (RIE)分析之。转化体与抗体产生清楚的反应，而生长于麦芽糖基质上的 ToC879菌落则不发生反应。因此可以认为，这些转化体已恢复了淀粉酶 (即在环糊精基质上生长)和脂酶(即抗体结合)的表达。负责这一表型的基 因被称为amyR。
amyR基因的分离
为了从ToC879的淀粉酶+、脂酶+转化体中拯救amyR基因，成功地 使用了两种不同的方法。
从生长于以环糊精为碳源的基本培养基中的菌丝体制备DNA。
在第一种方法中，使用Stratagene公司的药盒将DNA 包装到λ-菌体头部中，以试图拯救出总DNA中的原粘粒。在药盒供应 商规定的条件下使包装反应混合物与XLI-Blue MR大肠杆菌一起保 温。将大肠杆菌细胞铺板在含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。平板 上出现两个菌落；它们所含有的粘粒是同样的并定名为ToC1012。
在第二种方法中，尝试使用总DNA转化感受态大肠杆菌DH5a细 胞。分离菌落并根据限制性酶消化表明含有6种不同的质粒。用EcoRI 消化各种质粒并对其进行Southern分析。使用pMT1657混合物的32P标 记的探针和SuperCos1鉴定不是这些载体的一部分的DNA片段。大小约 0.7和1.2kb的两个EcoRI片段不与其中的任何探针杂交。分离1.2kb片 段，用32P标记，并在与含有产生原转化体的粘粒部分的滤膜进行杂交实 验中使用它们作为探针。在含有大约1000个克隆的集合体(ToC904)中， 有6个粘粒没有发生杂交。
限制酶消化结果显示，这类克隆中有些是完全相同的，致使分离出四 种不同的粘粒。
所有粘粒都至少含有一部分的TAKA淀粉酶基因。经与pMT1623(携 带在米曲霉tpi启动子控制下的bar基因的基于pUC的质粒)一起共转 化，将四种粘粒和粘粒ToC1012转化到ToC879中。根据抗glufosinate 抗性，从每次共转化分离到14个转化体并试验其在环糊精上生长的能 力。
ToC1012的8个转化体和其他粘粒之一(41B12)的3个转化体能够生 长。其他粘粒的转化体都没有生长。并不是ToC1012和41B12的所有转 化体都能生长可能是反映了每次实验中共转化频率的不同。以RIE法分 析生长于环糊精上的转化体菌落，并显示它们都产生了脂酶。
为了再克隆粘粒中的amyR，将用BglII、HindIII或PstI消化的 41B12得到的DNA片段克隆到pUC19中。将亚克隆转化到ToC879中并 按上述方法根据在环糊精中生长和产生脂酶的能力分析转化体。如图2中 所示，一个称为pToC316的质粒含有约9kb的HindIII片段，该片段被 鉴定为含有amyR的片段。
进一步再克隆后，产生了一个含有4.3kb HindIII/SacI片段的称 pToC320的质粒(如图3中所示)，然后使用进一步再克隆和引物行走方法 在ABI DNA序列仪上进行序列测定。
SEQ ID No：1中显示了包含amyR基因的3980bpDNA序列。SEQ ID No：3中显示了推测的氨基酸序列，并揭示在氨基酸28-54之间有一 个Gal 4型锌指序列。已知这样的序列与DNA结合(Reece，R.J.，和Ptashne， M.(1993)科学261，909-910)。
因为amyR是从也含有淀粉酶特异性DNA片段的粘粒中分离的，所 以amyR酶切图谱接近于IFO4177中的三个淀粉酶基因之一。粘粒的基 因图谱显示α淀粉酶基因和amyR相隔5-6kb。基因组DNA的Southern 分析显示，IFO4177中只存在一个amyR拷贝，并进一步证实其酶切图 接近于淀粉酶基因之一。
amyR cDNA的分析
使用Wahleithner，J.A.，等人(1996)当代遗传学29，395-403)的方 法，从在有利于产生α淀粉酶的条件下生长于含麦芽糖培养基中的米曲霉 培养物制备mRNA。以标准方法制得双链cDNA，并用来以下列引物进 行PCR反应：
oligodT引物：TTTTGTAAGCT31 SEQ ID NO.9
23087：CCCCAAGCTTCGCCGTCTGCGCTGCTGCCG SEQ ID NO.6
20865：CGGAATTCATCAACCTCATCAACGTCTTC SEQ ID NO.7
20866：CGGAATTCATCGGCGAGATAGTATCCTAT SEQ ID NO.8
用引物20866和23087进行PCR反应产生一个约1.1kb的片段。用 EcoRI和HindIII消化该片段；将这些限制位点掺入引物中，并克隆到用 同样的酶切割的pUC19载体内。
测定所得质粒中插入片段的序列，可见基因的该部分中有一个内含 子。SEQ ID No：2中指示出了该内含子。
用OligodT引物和引物20866进行的另一个PCR反应并没有产生不 同的片段。使用该反应的一个等份作为用OligodT引物和引物20865进 行的新反应的开始点，结果产生了一个约1.1kb的片段。用EcoRI和 HindIII消化该片段并克隆到pUC19中。
测序结果显示该片段含有amyR的3′部分并定位了另一个内含子。 该内含子也在SEQ ID No：2中指明。测定三个独立质粒的3′末端序列并 定位两个polyA加入位点，其中一个在bp no.3827处，另一个在bp no.3927处。
实施例2：amyR-菌株中葡糖淀粉酶合成的定量
米曲霉产生由glaA基因编码的葡糖淀粉酶，所说的基因则受如α淀 粉酶同样的物质的调节(Y.Hata等人(1992)当代遗传学22，85-91)。为 了弄清楚是否amyR也参予调节glaA，检测菌株ToC879中和由之直接 衍生ToC879的amyR wt菌株SRe440中，在诱导条件下葡糖淀粉酶的 合成。
将得自各菌株的分生孢子接种于10ml YPM(含有2％麦芽糖的YP培 养基)中并于30℃培养4天。收集上清液并与当被葡糖淀粉酶酶解时变成 黄色的酶底物对位硝基苯-α-D-葡糖吡喃糖苷一起保温，以分析上 清液中的葡糖淀粉酶含量。在所使用的方法中，将0.5ml发酵液与1ml 含有1mg/ml底物的0.1M乙酸钠(pH＝4.3)混合。将样品于室温下保温3 小时并加入1.5ml 0.1M Na2B4O7。在分光光度计中检测所产生的黄颜色 的400nm吸光率。将上清液首先与硼酸盐混合，然后再与底物溶液混合 以制成对照样品。检测结果是：
反应-对照(OD单位)
SRe440 0.655
ToC879 0.000
取自ToC879的样品中的OD读数为零这一结果清楚地表明，米曲霉 的葡糖淀粉酶的合成需要有amyR转录因子的表达。
实施例3：amyR的过表达
构建含有融合到米曲霉tpi基因启动子上的amyR的编码区和3′非编 码序列的质粒pToC342。tpi基因编码丙糖磷酸异构酶--一种参予初 级代谢的组成性表达的酶。按照Mcknight，G.L.等人(1986细胞46，143 -147)的方法，经与构巢曲霉cDNA克隆交叉杂交分离米曲霉tpi基因。 经序列测定来鉴定结构基因。所使用的启动子是直接接在编码区上游的约 700bp片段。pToC342能够弥补ToC879中的突变。进一步向pToC342 中加入米曲霉pyrG基因，并将所得到的质粒pToC359转化到JaL250 --1996年9月19日提交的专利申请DK1024/96中描述的JaL228的 pyrG突变体中。发现含有多拷贝pToC359的菌株可增加葡糖淀粉酶的合 成水平。
pToC342和pToC359的构建
以pToC320作为模板并使用下列引物进行PCR反应：
8753 GTTTCGAGTATGTGGATTCC
8997 CGGAATTCGGATCCGAGCATGTCTCATTCTC
用EcoRI/ApaI切割所得到的片段以产生一个约180bp的片段，然后 将该片段克隆到已用EcoRI/ApaI消化的pToC320中。测定所得质粒 pToC336的碱基序列以证实PCR片段是完整的。将含amyR的编码区和 3′非翻译序列的pToC336的2.6kb BamHI/SalI片段，以及含有tpi启动 子的约700bp EcoRI/BamHI片段克隆到EcoRI/SacI消化的pUC19中。 在体外导入tpi启动子的下游BamHI位点，而EcoRI位点则是来自原有 tpi克隆的内源性位点。用HindIII切割所得到的称为pToC342的质粒， 去磷酸化并连接到含有米曲霉pyrG基因的1.8kb HindIII片段上，得到 称为pToC359的质粒。pToC342和pToC359的结构示于图4中。其中 Ptpi代表tpi启动子，TamyR代表amyR的3′非编码区。以前曾在 WO95/35385中描述了pyrG基因的克隆方法。
在米曲霉中的表达
JaL250是根据对5-氟乳清酸的抗性选择的JaL228的pyrG突变 体。1996年9月19日提交的专利申请DK1024/96中已描述了JaL228。 按照标准方法用pToC359转化JaL250并根据尿嘧啶核苷需求的下降选 择转化体。再通过分生孢子再次分离转化体并在YP+2％麦芽糖培养基 中30℃培养4天。根据裂解对位硝基苯-α-D-葡糖吡喃糖苷的能力 测定分泌的葡糖淀粉酶。转化体在发酵液中具有5-31单位/ml的葡糖 淀粉酶生成能力，而JaL228只有2-3单位/ml。最好的转化体称为 ToC1200。Southern分析显示，pToC359的多个拷贝已被整合到 ToC1200的基因组中。因为有α淀粉酶启动子，所以可优选使用ToC1200 作为表达质粒的宿主菌株。
实施例4：TAKA启动子的碳分解代谢物抑制作用
TAKA淀粉酶启动子受到碳分解代谢物的抑制。在曲霉中，碳分解 代谢物抑制作用至少部分地是通过相应于酿酒酵母MIG1的转录阻遏物 CreA介导的。已知在CreA控制下的启动子中的DNA结合位点是富含 GC的，并且看来相同于酿酒酵母中的MIG1位点。TAKA淀粉酶启动 子含有几个潜在的CreA结合位点。为了确定该启动子是否参予碳分解代 谢物抑制作用，突变三个这样的位点，但结果只对碳代谢物抑制作用提供 了部分缓解。相反，在含有偶联到报道基因上的经过修饰的启动子的菌株 中导入组成性表达的amyR的拷贝，则完全解除报道分子的抑制。
CreA位点缺失的TAKA淀粉酶启动子的构建
经与已知的CreA和MIG1位点进行序列比较，认定三个位点为 TAKA淀粉酶启动子中的潜在CreA结合位点。所得位点具有下示序列：
位点 I CCCCGGTATTG
位点 II CCCCGGAGTCA
位点 III ATATGGCGGGT
将划下线的碱基都改变成A′s，因为已知这种改变可破坏MIG1结合 位点。使用位点特异性诱变方法完成这种取代。构建含有经修饰的启动子 和来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非转录序列的表达载体pToC297。除 了启动子有所改变外，pToC297完全相同于WO 91/17243中所述的 pToC68。两质粒在启动子和终止子之间都具有单一BamHI位点。
CreA-TAKA淀粉酶启动子调节的脂酶的表达
将含有编码Humicola lanuginosa脂酶的cDNA的约950bp BamHI 片段克隆到pToC297中(以前在EP305216中已描述了H.lanuginosa脂酶 的克隆和表达)。经与构巢曲霉amdS基因共转化，将所得到的质粒 pToC298转化到米曲霉IFO4177中。图5中显示了该质粒的结构，其中 Ptaka-creA代表CreA结合位点有缺陷的TAKA淀酚酶启动子。通过 分生孢子重新两次分离转化体，选择一个产生脂酶的这样的转化体 ToC1075，用于进一步地估价。于30℃，在含有2％或10％葡萄糖的10ml YP培养基中培养含有融合到野生型TAKA启动子上的脂酶基因的 ToC1075和IFO4177的p960转化体(参见EP305216)。每天取样品分析 发酵液中的脂酶生成。使用抗纯化的脂酶的多克隆抗体，以火箭免疫电泳 法检测脂酶含量。米曲霉IFO4177的发酵废液不与抗体反应。还使用Lilly 公司的Tes-tape每天检测发酵液的葡萄糖含量。
第一天检测到所有培养物中的葡萄糖，但在第二天申只能在原来含有 10％培养物中检测到葡萄糖。图6显示酯酶的产生量，表明在葡萄糖耗尽 之前，野生型启动子一直受到抑制。因此，当葡萄糖逐渐耗尽时脂酶开始 聚积。图6还显示，经修饰的启动子并没有象在10％葡萄糖发酵中于葡 萄糖存在下产生低水平脂酶那样受到严格的调节。因此，在ToC1075可 见有部分地葡萄糖脱阻抑。
pToC342对ToC1075中脂酶的碳代谢物抑制作用的缓解
经与含bar质粒pMT1623共转化，用pToC342转化ToC1075。用 Southern印迹分析法鉴定含有pToC342的多个拷贝并保留有脂酶表达盒 的菌株；其中一个就是这样的菌株。将ToC1075和ToC1139于30℃培 养在10ml含有2％或10％葡萄糖的YP培养基中，每天测定样品中的脂 酶和葡萄糖。根据对位硝基丁酸苯酯的裂解检测脂酶。用Lilly公司的Tes -tape检测葡萄糖含量。图7中所示的结果表明，如前所述，ToC1075 提供了对葡萄糖抑制作用的部分缓解，而ToC1139的酯酶生产量则不取 决于葡萄糖的存在。
实施例5：黑曲霉中amyR基因的Southern分析
如在米曲霉中一样，黑曲霉中α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的合成也是受 碳源调节的。因此，黑曲霉也可能含有amyR基因。通过寻找米曲霉amyR 基因和黑曲霉染色体DNA之间的交叉杂交来试验这一推测。
用常规方法从黑曲霉中制备DNA。用BamHI、BglII、EcoRI、 HindIII、SalI、XmaI或XbaI切割DNA，并在琼脂糖凝胶上电泳分 离所得到的DNA片段。然后将DNA转印迹到硝酸纤维素膜上，并与含 有米曲霉amyR结构基因一部分的32P标记的探针杂交。基于pToC320 以PCR方法制备探针，探针起始于SEQ ID No：1中所示序列的bp no.1683并终止于bp.no.2615。在10x Denhardt′s溶液(5XSSC、 10mM EDTA、1％SDS、0.15mg/ml polyA、0.05mg/ml酵母tRNA) 中，于50℃杂交过夜。杂交后，于逐渐严格的条件下洗膜，并用 PhosphoImager分析膜上的放射活性。图8显示在2XSSC、0.1％SDS 中于58℃洗膜后得到的结果。用几种限制酶消化后可见到单一带。因此， 可以基于该交叉杂交的结果克隆黑曲霉amyR基因。
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DK 1024/96
WO 95/35385
WO 91/17243
EP 305 216
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)名称：Novo Nordisk A/S
(B)街道：Novo Alle
(C)城市：Bagsvaerd
(E)国家：丹麦
(F)邮编(ZIP)：DK-2880
(G)电话：+45 4442 2668
(H)传真：+45 4442 6080
(ii)发明名称：转录因子
(iii)序列数目：9
(iv)计算机可读形式：
(A)介体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC可兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PetentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)
(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：3980碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)最初来源：
(A)生物体：米曲霉
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(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：3980碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(vi)最初来源：
(A)生物体：米曲霉
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
(B)定位：1691..2676
(ix)特征：
(A)名称/关键词：内含子
(B)定位：2677..2742
(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
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(A)名称/关键词：内含子
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(ix)特征：
(A)名称/关键词：外显子
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(A)名称/关键词：CDS
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(i)序列特征：
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(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：引物4651
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(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
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(i)序列特征：
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(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：引物
(iii)假设：有
(iii)反义：无
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
TTTTGTAAGC TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT T 41