技术领域
本发明涉及一种从正构烷烃发酵液中精制长链二元酸的方法，特别是从 C10～C18正构烷烃发酵液中精制长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸是由微生物发酵长链正构烷烃而得到的代谢产物。其发酵液是 一复杂的多相体系，其中含有水、未反应的烷烃和各种培养基组分，微生物细 胞，自溶的细胞碎片及蛋白、色素、各种代谢产物，长链二元酸，还有油、水、 细胞的乳化体。这种复杂的多相体系增加了提取二元酸的难度，影响到产品的 纯度和收率。
目前提取长链二元酸的方法一般分为溶剂法和水相法。虽然溶剂法可以解 决上述问题，但由于溶剂法存在投资大，产品中残留有溶剂和烷烃以及生产安 全性和环境污染等问题，该方法的使用受到了很大限制。传统的水相法虽然克 服了溶剂法的缺陷，但是其产品纯度和收率不能到达较高指标，而且操作步骤 繁琐，成本也较高。
CN1255483A提出了水相法分离二元酸的方法：将终止发酵液加热除去未反 应的烷烃，再加硅藻过滤除菌；滤液经调PH值得到酸饼和滤液；滤液又加活性 炭脱色，然后过滤；又用脱色后的滤液溶解之前得到的酸饼，酸化，最后得到 结晶，经烘干得到二元酸产品。此方法操作步骤繁琐，操作成本高，而且二元 酸产品收率太低，纯度亦不高，烷烃回收率低。
CN1147016A公开了一种精制二元酸的方法：将终止发酵液加热除去未反应 的烷烃，再加珍珠岩，用微滤膜除菌，再将滤液酸化结晶，经烘干得到二元酸 产品。此方法所用设备昂贵，而且由于没有进行脱色处理，因此所得产品的纯 度较低，最高不超过96％，烷烃回收率较低。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种采用水相法从多相 发酵体系中精制长链二元酸的改进方法，既可以提高产品收率和纯度，又可提 高未反应烷烃的回收率。
本发明从正构烷烃发酵液中精制长链二元酸的方法为：
(1)往终止发酵液中添加1～20g/L的尿素，并加热到60～100℃，再自然冷 却至10～40℃，静置0.5～2小时，分离回收未反应的烷烃；
(2)除烷烃后的发酵液加水稀释至二元酸浓度为70～100g/L，加碱调节PH 值为7.5～12.0，往发酵液中加入20～80g/L的吸附剂，在温度10～60℃下搅拌 脱色15～30分钟；
(3)脱色结束后，将发酵液过滤，并用2～10倍于发酵液体积，温度为40～ 80℃的水洗涤滤饼，并将洗涤液回收到滤液中；
(4)将第(3)步所得滤液加热到80～100℃，用无机酸调PH至4或4以下， 自然冷却至室温进行结晶；所得晶液过滤，并用水洗涤至滤液PH为5～7，较 好为中性，即得到长链二元酸酸饼；所得酸饼在40～80℃下干燥0.5～8h，即得 到外观呈白色的长链二元酸产品。
从发酵液中精制长链二元酸之前，首先要分离回收未反应的烷烃。由于一 部分烷烃、水和细胞形成乳化相，使得烷烃不易直接分离，所以必须进行破乳。 本发明通过往发酵液中添加尿素，以此来改变发酵液的性质，从而改善破乳效 果。添加尿素的量视乳化程度而定，一般为1～20g/L。乳化较轻，尿素加入量 可以相对较少；乳化严重，尿素加入量可以相对多些。再将发酵液加热到60～ 100℃，温度最好控制在85～100℃。再自然冷却至10～40℃，静置0.5～2小时， 待油相与水相分离完全后，回收未反应的烷烃。尿素的加入改变了发酵液的性 质，使得破乳更易进行，破乳效果比单纯加热破乳效果更好，可明显提高烷烃 的回收率。
将上述除烷烃后的发酵液用水稀释至二元酸浓度为70～100g/L，用碱调节 PH值为7.5～12.0，以7.7～9.0为宜；加入20～80g/L吸附剂，以40～50g/L为 宜；在温度10～60℃，最佳为10～40℃下搅拌脱色15～30分钟，在20～100 转/分钟的低转速下搅拌即可。
上述所用的碱可以是碱金属的氢氧化物如NaOH、KOH等，所用的吸附剂 选自活性炭、活性白土等适于二元酸脱色的吸附剂中的一种或几种。
脱色结束后，将含吸附剂的发酵液进行过滤，并用水洗涤滤饼，以洗脱吸 附在吸附剂上的二元酸。洗涤水的体积2～10倍于发酵液体积，以4～8倍于发 酵液体积为佳；水温为40～80℃，以50～70℃为宜。将洗涤液回收到滤液中。 经过滤可以同时除去吸附剂、菌体，和蛋白等不溶杂质，得到清澈透明的液体， 其中二元酸以二元酸盐的形式存在于液体中。
再将上述溶液加热到80～100℃，温度最好控制在85～98℃；用无机酸调 PH至4.0或4.0以下，较适宜PH为3.0～4.0，所用的无机酸可以是H2SO4、 HCl或H3PO4；然后自然冷却至室温，二元酸即缓慢析出，晶体缓慢长大。所得 晶体晶型规则完整，颗粒较大，纯度高，利于产品过滤水洗。
将上述所得晶液进行过滤，并且用水洗涤酸饼，水温为室温，洗至滤液PH 为5～7即可，所得酸饼在40～80℃下干燥0.5～8h即得到外观呈白色的二元酸 产品。
本发明和现有技术相比有以下优点：
1、对发酵液进行分油时添加尿素，再进行加热破乳，这样比单纯的采用热 处理破乳分离未反应烷烃的效果更好，提高了未反应烷烃的回收率。
2、脱色在除菌前进行，通过过滤除去吸附剂，菌体和蛋白等杂质，可以免 除单纯的过滤除菌操作步骤，简化了操作步骤，提高了产品的收率，降低操作 成本；而且吸附剂在过滤过程中可以起到助滤剂的作用，因此减少了额外添加 助滤剂的成本。
3、洗涤液回收到滤液中，使得二元酸盐浓度降低，在低浓度下进行酸析结 晶，所得二元酸晶体晶型规则完整，颗粒较大，不含杂质，易于过滤。
具体实施方式
下面通过实施例进一步理解本发明的技术方案。
实施例1
以正十二烷烃作为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二元酸。发酵 结束后，菌体浓度为12.3g/L，二元酸浓度为124.5g/L，PH为8.0。取发酵液1000 毫升，加10g尿素，加热到98℃，再缓慢冷却至20℃，静置1小时，然后分离 回收未反应的烷烃。然后加550毫升水稀释，添加70g活性炭，在温度为20℃ 下搅拌脱色20分钟，再进行过滤。过滤结束后用4000毫升70℃的水洗涤炭饼， 洗涤液回收到滤液中。将上述液体加热到95℃，用6N的硫酸调PH至3.5，缓 慢冷却至室温进行结晶。再进行过滤，之后用水将酸饼洗至中性。最后在80℃ 下烘干，即得白色的二元酸晶体。结果见表1。
实施例2
以正十三烷烃作为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二元酸。发酵 结束后，菌体浓度为14.1g/L，二元酸浓度为144.5g/L，PH为9.3。取发酵液1000 毫升，加12g尿素，加热到100℃，再缓慢冷却至30℃，静置1小时，然后分 离回收未反应的烷烃。然后加800毫升水稀释，添加72g活性炭，在温度为30 ℃下搅拌脱色30分钟，再进行过滤。过滤结束后用6000毫升，60℃水洗涤炭 饼，回收洗涤液到滤液中。将上述液体加热到90℃，用6N的硫酸调PH至3.0， 缓慢冷却至室温。再进行过滤，之后用水将酸饼洗至中性。最后在75℃下烘干， 即得白色的二元酸晶体。结果见表1。
实施例3
取十二碳和十三碳混合二元酸发酵液1000ml。菌体浓度为11.5g/L，二元酸 浓度为124.7g/L，PH为8.5。在发酵液中添加5g尿素，加热到100℃，在缓慢 冷却至30℃，静置1小时，然后分离回收未反应的烷烃。再加650毫升水稀释， 添加55g活性白土，在温度为30℃下搅拌脱色20分钟，再进行过滤。过滤结束 后用5000毫升，50℃水洗涤炭饼，回收洗涤液到滤液中。将上述液体加热到95 ℃，用6N的盐酸调PH至3.0，缓慢冷却至室温。再进行过滤，之后用水将酸 饼洗至中性。最后在80℃下烘干，即得白色晶体的二元酸。结果见表1。
比较例1
按照CN1255483A实施例2公开的方法，以正十二烷烃作为底物，利用热 带假丝酵母发酵生产十二碳二元酸。发酵结束后，菌体浓度为14.1g/L，二元酸 浓度为144.5g/L，PH为9.3。取发酵液1000毫升，加热到98℃，再缓慢冷却至 30℃，静置1小时，然后分离回收未反应的烷烃。然后添加50g硅藻土，过滤 除菌。并用加800毫升，60℃水洗涤菌饼，洗涤水回收至滤液中。将上述液体 加热到95℃，用3N的硫酸调PH至6.5，降温至80℃，保温20分钟，缓慢冷 却至室温。再进行过滤，得到酸饼和滤液。所得滤液添加50g活性炭，在温度 为40℃下搅拌脱色30分钟。脱色后进行过滤，并给滤液中加入800毫升自来水， 用此滤液溶解酸饼，用3N的硫酸调PH至3.2，加热至80℃，冷却至室温。再 进行过滤，之后用水将酸饼洗至中性。最后在75℃下烘干，即得白色的二元酸 晶体。结果见表1。
比较例2
按照CN1147016A公开的方法，以正十二烷烃作为底物，利用热带假丝酵 母发酵生产十二碳二元酸。发酵结束后，菌体浓度为14.1g/L，二元酸浓度为 144.5g/L，PH为9.3。取发酵液1000毫升，加热到100℃，再缓慢冷却至38℃， 静置1小时，然后分离回收未反应的烷烃。然后添加20g珍珠岩，用微孔膜除 菌。并用加300毫升自来水洗涤菌饼，洗涤水回收至滤液中。将滤液加热到90 ℃，用6N的硫酸调PH至3.0，缓慢冷却至室温。再进行过滤，之后用水将酸 饼洗至中性。结果见表1。
表1 项目 烷烃回收率v％ DCA纯度wt％ 产品收率wt％ 产品外观 实施例1 97.0 99.25 94.6 白色 实施例2 97.6 99.34 95.2 白色 实施例3 96.1 99.22 94.9 白色 比较例1 94.2 97.39 87.4 白色 比较例2 94.0 94.25. 92.9 稍微发黄