技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种针对沙门氏菌和痢疾杆菌检测用多重荧 光PCR检测引物、探针、试剂盒及其应用。
背景技术
肠道杆菌属于肠杆菌科，常聚集在人和动物的肠道内，随粪便排出，广泛分布于水、 土壤和腐物之中。肠道杆菌种类繁多，目前有44个菌属，其中大多数是肠道的正常菌群， 仅少数为病原菌，例如沙门菌、志贺菌属、及少数大肠杆菌等。
沙门氏菌是一群寄生于人和动物肠道中，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性菌， 含8个种，目前至少有67种O抗原和2000个以上血清型。对人类致病的有伤寒沙门菌、 副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌和肠炎沙门菌等。感染沙门氏菌的人或带菌 者的粪便污染的食品，如蛋、家禽和肉类产品，可使人发生食物中毒。感染与否主要取决 于沙门氏菌的血清型和食用者的身体状况，其中小孩、老年人及免疫缺陷个体受威胁最大。 中毒的主要症状有呕吐、腹泻、腹疼，粪便以黄绿色水样便，有时带脓血和黏液，一般发 热温度在三十八摄氏度至四十摄氏度，严重者可出现打寒战、惊厥、抽搐和昏迷的症状。 多数沙门氏菌病患者不需服药即可自愈，但是老人、儿童和体弱者如不及时进行急救处理 也可导致死亡。据统计在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜 首。中国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
痢疾杆菌属于志贺氏菌属，革兰氏阴性菌，是人和灵长类的肠道致病菌，能引起致病 性痢疾。按菌体抗原不同可分为志贺氏菌、福氏菌、鲍氏菌、宋内氏菌4个群。痢疾一年 四季均可发生，但以夏、秋季发病率高。痢疾病人和带菌者皆为传染源，轻型、慢性痢疾 和健康带菌者易被忽视。传播途径以粪、口感染为主，卫生习惯不良的小儿易患本病。小 儿慢性菌痢多具潜隐性、非典型性和迁延性，不易被发现，故易在小儿群体中流行。人被 感染后仍可再发。中毒者表现为腹痛、腹泻、里急后重、排脓血便，伴全身中毒等症状。 婴儿对感染反应不强，起病较缓，大便最初多呈消化不良样稀便，病程易迁延。3岁以上患 儿起病急，以发热、腹泻、腹痛为主要症状，可发生惊厥、呕吐。志贺氏或福氏菌感染者 病情较重，易出现中毒型痢疾，多见于3～7岁儿童。
综上所述，沙门氏菌和痢疾杆菌皆为肠道传染病致病菌，感染后都会出现发热、腹泻、 腹痛等症状，从而为临床诊断和治疗带来难题。到目前为止，人们对肠道杆菌的了解是通 过对粪便标本选择性培养计数菌落数而获得的。随着分子生物学的发展以及分子生物学技 术在微生态领域的应用，对肠道杆菌的分类和鉴别产生了巨大的推动作用。荧光PCR技术 与传统培养方法相比，具有省时省力、敏感性高、特异性强、操作简单快速等特点，且不 受试验时间限制，而被广泛应用于临床诊断、疾病研究和病原体检测等方面。而多重荧光 定量PCR技术的产生，进一步解决了每次检测只能鉴别一种疾病的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种沙门氏菌和痢疾杆菌多重荧光PCR检测试剂盒及其制备方 法、检测方法，可用于单管同步检测沙门氏菌和痢疾杆菌感染，用于临床对可疑感染患者 进行病原学鉴别诊断。
本发明首先公开了一种针对沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测用引物及探针， 其中，沙门氏菌的引物序列如SEQ ID NO：1-2所示，沙门氏菌探针的序列如SEQ ID NO： 3所示，痢疾杆菌的引物序列如SEQ ID NO：4-5所示，沙门氏菌探针的序列如SEQ ID NO： 6所示。
优选的，所述针对沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测用引物及探针，所述引物 和探针的组成如下：
沙门氏菌：
沙门氏菌上游引物：5’-GGTACTAATGGTGATGATC-3’
沙门氏菌下游引物：5’-GAGGATTCTGTCAATGTAG-3’
沙门氏菌探针：5’-荧光报告基团-TGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATC-荧光淬灭基团-3’
痢疾杆菌：
痢疾杆菌上游引物:5’-CTTCGACAGCAGTCTTTC-3’
痢疾杆菌下游引物:5’-GGAGATTGTTCCATGTGAG-3’
痢疾杆菌探针:5’-荧光报告基团-TCTCAGTGGCATCAGCAGCA-荧光淬灭基团-3’
本发明探针的设计为现有技术，探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧 光淬灭基团。优选的，所述沙门氏菌探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，痢疾杆菌 探针标记的荧光报告基团为VIC荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明第二方面公开了一种沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测试剂盒，包括沙 门痢疾荧光PCR检测混合液，所述沙门痢疾荧光PCR检测混合液中含有前述的引物和探针。
优选的，所述沙门痢疾荧光PCR检测混合液还含有PCR MIX和H2O
进一步的，所述沙门痢疾荧光PCR检测混合液的组成为：沙门氏菌上游引物1.2μl/test； 沙门氏菌下游引物1.2μl/test；沙门氏菌探针0.2μl/test；痢疾杆菌上游引物1.2μl/test；痢疾杆 菌下游引物1.2μl/test；痢疾杆菌探针0.2μl/test；PCR MIX20μl/test；工艺用水10.8μl/test。
所述沙门痢疾荧光PCR检测混合液的组成中，沙门氏菌上游引物、沙门氏菌下游引物、 痢疾杆菌上游引物，和痢疾杆菌下游引物的浓度分别为600nM/L，沙门氏菌探针和痢疾杆 菌探针的浓度分别为100nM/L。
较优的，所述多重荧光PCR检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品（DEPC-H2O） 及阳性对照品中的至少一种。所述PCR酶为Taq酶及尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）。
本发明所述阳性对照品为沙门氏菌对照质粒，和/或痢疾杆菌对照质粒；所述沙门氏菌 对照质粒为含有SEQ ID NO:7序列所示目标片段的质粒，所述痢疾杆菌对照质粒为含有SEQ ID NO:8序列所示目标片段的质粒。
较优的，本发明沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测试剂盒的PCR检测体系的制 备方法如下：取沙门痢疾荧光PCR检测混合液36μl，与0.4μl的PCR酶混合获得混合液， 取36μl混合液加入4μl待测品，获得反应总体系为40μl的PCR反应液。
更优的，所述0.4μl的PCR酶由0.27μl Taq酶5U/μl，以及0.13μl尿嘧啶-N-糖基化 酶5U/μl混合制成。
本发明试剂盒的PCR检测体系中，所述待测品为样本的DNA模板溶液、阳性对照品或 阴性对照品（DEPC-H2O）。
所述阳性对照品中，沙门氏菌对照质粒和痢疾杆菌对照质粒可以单独包装，也可以混 合包装。
本发明针对沙门氏菌和痢疾杆菌多重荧光PCR检测的试剂盒所用的方法，采用的是 Taqman荧光定量PCR原理，分别针对沙门氏菌基因和痢疾杆菌基因设计特异性引物，扩 增特异性核酸序列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游 引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候， 报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告 基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本发明采用的荧光定量 PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等 优点。
本发明针对沙门氏菌和痢疾杆菌多重荧光PCR检测的方法，其目的检测序列在于：
沙门氏菌：
5’-GGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCT GGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCG TTCTACATTGACAGAATCCTC-3’（SEQ ID NO：7）
痢疾杆菌：
5’-CTTCGACAGCAGTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGAGAGCTGTGAGGA CCGTGTCGCGCTCACATGGAACAATCTCC-3’（SEQ ID NO：8）
使用本发明针对沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测试剂盒检测时，其使用方法 如下：
1）提取待测样本的DNA，得到DNA模板溶液；
2）加样，制备反应体系；
3）PCR检测。
本发明PCR检测的待测样本来自粪便或者肛拭子。样本的核酸提取为现有细菌DNA提 取技术，具体可根据取样方式不同，按各核酸提取说明书操作进行。
加样的方法为：取36μl沙门痢疾荧光PCR检测混合液与0.4μl PCR酶（0.27μl Taq 酶5U/μl，以及0.13μl尿嘧啶-N-糖基化酶5U/μl），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒， 获得混合液。取前述混合液36μl置于PCR管中，然后将4μl的DNA模板溶液、阳性对照品、 或者阴性对照品加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。
本发明推荐循环参数设置为：37℃2min；94℃2min；93℃×15sec和60℃×60sec交替 循环40次。单点荧光检测在60℃，反应体系为40μl。
PCR反应阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高 点。
本发明多重荧光PCR质量控制：阴性对照品检测结果应为：FAM通道和VIC通道Ct 栏显示Undetermined（ABI7500）或N/A（CFX96）或No Ct（SLAN）；阳性对照品检测结果 应为：FAM通道和VIC通道Ct值均≤35。否则实验视为无效。试验结果的判断标准如下：
若待检样本Ct值在38～40之间，需重复测定，如重复测定得到的Ct值仍在38～40 之间，则判为低于检测限，报告为阴性。
本发明最后公开了前述针对沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测用引物及探针、 前述沙门氏菌和痢疾杆菌的多重荧光PCR检测试剂盒在制备沙门氏菌和/或痢疾杆菌检测试 剂中的应用。
本发明涉及了两对PCR引物分别特异性扩增沙门氏菌和痢疾杆菌基因序列，两对PCR 引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，大大缩短检测时间，操作简便。 特异性引物和和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探 针之间无互补配对或交叉扩增的情况。本发明选用的两个荧光基团的荧光波长相差较大且 信号强度相近，避免了信号之间的相互干扰。
附图说明
图1：FAM通道沙门氏菌灵敏度扩增曲线图
图2：VIC通道痢疾杆菌灵敏度扩增曲线图
图3：样本1扩增曲线图
图4：样本2扩增曲线图
图5：样本3扩增曲线图
图6：样本4扩增曲线图
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的保护范围。
实施例1沙门氏菌及痢疾杆菌核酸联合测定试剂盒引物探针的设计和合成
在沙门氏菌探针的5’标记FAM荧光基团，痢疾杆菌探针的5’标记VIC荧光基团。合 成针对沙门氏菌和痢疾杆菌PCR检测的引物、探针。
沙门氏菌：
沙门氏菌上游引物：5’-GGTACTAATGGTGATGATC-3’（SEQ ID NO：1）
沙门氏菌下游引物：5’-GAGGATTCTGTCAATGTAG-3’（SEQ ID NO：2）
沙门氏菌探针：5’FAM-TGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATC-BHQ13’（SEQ ID NO：3）
痢疾杆菌：
痢疾杆菌上游引物:5’-CTTCGACAGCAGTCTTTC-3’（SEQ ID NO：4）
痢疾杆菌下游引物:5’-GGAGATTGTTCCATGTGAG-3’（SEQ ID NO：5）
痢疾杆菌探针:5’VIC-TCTCAGTGGCATCAGCAGCA-BHQ13’（SEQ ID NO：6）
实施例2沙门氏菌及痢疾杆菌核酸联合测定试剂盒的灵敏度分析
1、实验方法
1.1沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液的制备：
将沙门氏菌上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；痢疾杆菌上游引物 1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCR MIX（购自Qiangen公司）20μl/test； 工艺用水10.8μl/test混匀即为沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液。该沙门痢疾荧光PCR检 测混合液的组成中，沙门氏菌上游引物、沙门氏菌下游引物、痢疾杆菌上游引物、和痢疾 杆菌下游引物的终浓度分别为600nM/L，沙门氏菌探针和痢疾杆菌探针的终浓度分别为 100nM/L。
1.2样品的准备：
沙门氏菌阳性对照质粒的构建方法：采用PCR法对沙门氏菌的核酸样本进行扩增，获 得含SEQ ID NO：7所示序列的核酸片段，PCR引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。将扩增的 片段纯化后，通过TA克隆至pMD8-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化 入DH5α，扩增，获得沙门氏菌阳性对照质粒。
痢疾杆菌阳性对照质粒的构建方法：采用PCR法对痢疾杆菌的核酸样本进行扩增，获 得含SEQ ID NO：8所示序列的核酸片段，PCR引物序列如SEQ ID NO：4-5所示。将扩增的 片段纯化后，通过TA克隆至pMD8-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化 入DH5α，扩增，获得痢疾杆菌阳性对照质粒。
取2×107copies/ml的沙门氏菌阳对照性质粒及2×107copies/ml的痢疾杆菌阳性对照质粒 等体积混合，获得1×107copies/ml的沙门痢疾阳性对照品S1。按1：10、1：100、1：1000、 1：10000稀释，获得S2（1×106copies/ml）、S3（1×105copies/ml）、S4（1×104copies/ml）、 S5（1×103copies/ml）。将S1-S5共5份作为检测样品。
1.3加样
取n×36μl沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液与n×0.4μl酶（Taq+UNG，为5U/μl Taq 酶0.27μl，以及5U/μl尿嘧啶-N-糖基化酶0.13μl），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒（n 为反应管数），得混合液。
每支PCR管中取上述混合液36μl，然后向每支PCR管中再分别加入不同浓度的阳性对 照品（S1-S5）各4μl，盖好PCR管盖，立即进行PCR扩增反应。
1.4PCR扩增：
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min；94℃×2min；再按93 ℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μl。
1.5荧光通道的选择如下表1。
表1荧光通道的选择
注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，则需要将passive reference和quencher 处均选择“none”。
2.检测结果
检测结果见下表2，扩增曲线见附图1-2。
表2试剂盒灵敏度检测结果
表2结果表明：S1-S5在FAM和VIC通道检测均为阳性，表明试剂盒检测沙门氏菌和 痢疾杆菌的检测灵敏度能达到1×103copies/ml。
实施例3沙门氏菌及痢疾杆菌核酸联合测定试剂盒的应用
1、实验方法
1.1实验对象
对4例临床获得的肛拭子标本进行沙门氏菌和痢疾杆菌检测。该4例肛拭子经其它金标 准法（如测序、病毒培养等）鉴定为沙门氏菌病人样本2份，痢疾杆菌病人样本1份，健康 人体样本1份，依次编号为标本1-4。
1.2沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液的制备：
将沙门氏菌上游引物1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；痢疾杆菌上游引物 1.2μl/test；下游引物1.2μl/test；探针0.2μl/test；PCR MIX（购自Qiangen公司）20μl/test；工 艺用水10.8μl/test混匀即为沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液。
1.3实验对象处理
将含肛拭子的试管充分震荡混匀，挤干棉拭子，吸取全部液体转移至1.5ml离心管中， 13,000rpm离心2分钟，弃去上清。沉淀中加入100μl核酸抽提液（购自上海之江生物科技 股份有限公司公司，货号为BQR2005）充分混匀，99℃干浴或水浴10分钟，然后13,000rpm 离心10分钟，取上清4μl作为DNA模板溶液。
1.4加样
取n×36μl沙门痢疾核酸荧光PCR检测混合液与n×0.4μl酶（Taq+UNG，为5U/μl Taq 酶0.27μl，以及5U/μl尿嘧啶-N-糖基化酶0.13μl），振荡混匀数秒，3000rpm离心数秒(n 为反应管数)。
取上述各混合液36μl置于PCR管中，然后将待测标本1-4制备的DNA模板溶液、阳性 对照品、阴性对照品各4μl分别加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩 增反应。
1.5PCR扩增
反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：37℃×2min；94℃×2min；再按 93℃×15sec→60℃×60sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μl。
荧光通道检测选择见表1。
2.检测结果：
表3试剂盒灵敏度检测结果
扩增曲线见附图3-6，实验数据见表3。由表3数据可知，标本1的检测结果为沙门氏 菌阳性；样本2的检测结果为沙门氏菌阳性；样本3的检测结果为痢疾杆菌阳性，样本4 的检测结果为阴性；试剂盒检测结果与临床检测结果一致，可见本发明试剂盒具有较好的 特异性。