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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710740337.X (22)申请日 2017.08.25 (71)申请人 中国科学院武汉植物园 地址 430074 湖北省武汉市洪山区磨山 (72)发明人 黄宏文张琼钟彩虹刘小莉 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 龚莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子 标记Geo101引物及应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学及遗。
2、传育种技术领 域， 更具体涉及用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴 定的分子标记Geo101引物及应用。 本发明提供的 分 子 标 记 引 物 为 G e o 1 0 1 - F : AGCATCGACAGTTCAGTTGG 和Geo101-R: GCAGTTGAATCTTGCCATCA， 利用该引物， 可准确区 分鉴定猕猴桃磨山系列雄性品种， 还可区分除磨 山系列雄性品种之外的其他品种， 具备鉴定的普 适性， 适合大规模推广。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 107338318 A 2017.11.10 CN 107338318 A 1.一种猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定分子标记。
3、引物， 所述的引物： Geo101-F: AGCATCGACAGTTCAGTTGG和Geo101-R:GCAGTTGAATCTTGCCATCA。 2.权利要求1所述的引物在猕猴桃育种中的应用。 3.权利要求1所述的引物在猕猴桃品种鉴定中的应用。 4.权利要求1所述的引物在猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定中的应用。 5.根据权利要求3所述的应用， 所述的猕猴桃品种包括： 磨山雄1号、 磨山雄2号、 磨山雄 3号、 磨山4号、 磨山雄5号、 华光2号、 西选1号或华优猕猴桃。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107338318 A 2 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物及 应用 。
4、技术领域 0001 本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域， 更具体涉及用于猕猴桃磨山系列雄 性品种鉴定的分子标记Geo101引物及应用。 背景技术 0002 近年来， 我国猕猴桃产业稳步扩增， 截至2016年全国栽培面积达220万亩， 产量260 万吨， 产值超过200亿元。 猕猴桃属于雌雄异株类型， 即雌花中花粉败育， 而雄花中子房发育 不完全且胚珠败育。 因此， 在猕猴桃育种及商业果园栽培中， 通常需选择优良雄株的花粉， 进行异花授粉， 才能实现猕猴桃结实。 0003 近年来， 中国科学院武汉植物园选育的 磨山 雄性系列猕猴桃品种(即 磨山雄1 号 、磨山雄2号 、磨山雄3号 、磨山4号。
5、 和 磨山雄5号 )， 具有花期覆盖广、 花量大、 花 粉萌发率高等特点， 已成为多个优异猕猴桃品种的配套授粉雄株。 例如 磨山雄2号 猕猴桃 不仅能给早花期和中花期的中华猕猴桃授粉， 而且能促进红心系列猕猴桃果实品质改善， 增加内果皮红色积累。 目前， 对 磨山 系列品种的鉴定仅通过树势、 叶片形态、 花期和花形 态等传统手段， 难免受到环境和其他人为因素的影响。 对 磨山 系列品种鉴定的不确定性， 给猕猴桃育种工作造成较大的困难， 且混杂或者错误的雄性品种也必定会影响果实生产和 果品质量。 0004 分子标记技术的应用为品种鉴定提供了客观和准确的手段。 分子标记技术通过检 测生物个体在基因。
6、组上产生的变异， 从而对不同个体进行区分， 是继形态标记和生化标记 之后， 发展的一种较为理想的遗传标记。 在植物种质资源鉴定及育种中， 对分子标记的应用 已日趋成熟。 RAPD分子标记多态频率高、 特异性强， 广泛用于小麦、 水稻和玉米等禾本科植 物的种质鉴定。 SSR分子标记等位变异高且稳定性好， 已应用于大豆、 苹果和葡萄等资源鉴 定研究。 SNP分子标记多态性高且分布广， 适合进行品种鉴定和分类研究。 在猕猴桃中， 已开 发SNP分子标记对猕猴桃糖、 酸以及果实大小等重要农艺性状进行分子辅助育种。 然而， 对 猕猴桃雄性系列品种的分子标记鉴定研究尚未开展。 0005 开发适用于雄性猕猴。
7、桃品种的分子鉴定标记， 能有针对性的选配杂交父本， 有利 于提高对猕猴桃的育种效率， 提升猕猴桃产业经济效益。 发明内容 0006 本发明的目的在于利用分子标记技术， 提供一种用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴 定的分子标记Geo101引物， 所述的分子标记命名为Geo101， 针对其设计的引物为Geo101-F: AGCATCGACAGTTCAGTTGG和Geo101-R:GCAGTTGAATCTTGCCATCA。 0007 本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记 Geo101引物在猕猴桃育种中的应用。 0008 为了达到上述目的， 本发明采取以下技术措施： 说明书 。
8、1/5 页 3 CN 107338318 A 3 0009 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物的获得： 申请人从猕猴 桃基因组序列网站(http:/bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载 红阳 猕猴桃全基因序 列。 在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点， 比对基因结构注释结果， 选择在基因区 间的SSR位点设计扩增引物。 利用设计合成的引物， 对猕猴桃 磨山 系列品种进行PCR扩增， 筛选得到分子标记Geo101， 针对其设计的引物为Geo101-F:AGCATCGACAGTTCAGTTGG和 Geo101-R:GCAGTTGAATCTTGC。
9、CATCA。 0010 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物在猕猴桃育种中的应 用， 利用本发明的引物对猕猴桃的品种进行鉴定， 所述猕猴桃的品种包括但不限于：磨山 雄1号 、磨山雄2号 、磨山雄3号 、磨山4号 、磨山雄5号 、华光2号 、西选1号 或 华 优 猕猴桃。 0011 与现有技术相比， 本发明的优点： 0012 1.形态标记简单直观， 但是数量少、 多态性差、 易受环境条件影响。 分子标记操作 简便， 在植物体的各个组织和发育时期， 均可检测， 不受季节和环境限制。 数量多， 遍及整个 基因组。 多态性高， 品种间存在许多等位变异。 0013 2.本发明的引物可。
10、在猕猴桃 磨山 雄性系列品种中扩增得到不同大小的DNA片 段。 该分子标记扩增稳定性， 能用于进行猕猴桃 磨山 雄性系列品种的鉴定。 0014 3.本发明提供的引物可区分除 磨山 系列雄性品种之外的其他品种， 具备鉴定的 普适性， 适合大规模推广。 附图说明 0015 图1为利用分子标记Geo101引物在猕猴桃 磨山 雄性系列品种中毛细管电泳扩增 得到不同DNA片段的峰图。 具体实施方式 0016 本发明所述技术方案， 如未特别说明， 均为本领域的常规方案； 所述试剂或材料， 如未特别说明， 均来源于商业或公开的渠道。 0017 实施例1： 0018 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记G。
11、eo101引物的获得： 0019 申请人从猕猴桃基因组序列网站(http:/bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载 红阳 猕猴桃全基因序列。 在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点， 比对基因结构注 释结果， 选择在基因区间的SSR位点设计扩增引物。 利用设计合成的引物， 对猕猴桃 磨山 系列品种进行PCR扩增， 筛选得到分子标记Geo101， 针对其设计的引物为Geo101-F: AGCATCGACAGTTCAGTTGG和Geo101-R:GCAGTTGAATCTTGCCATCA。 0020 实施例2： 0021 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo10。
12、1引物在鉴别猕猴桃磨山品 种中的应用： 0022 (1)按照CTAB法分别提取 磨山雄1号 、磨山雄2号 、磨山雄3号 、磨山4号 和 磨山雄5号 猕猴桃的DNA样品。 0023 (2)使用加样器吸取990ul HIDI和10ul ROX500或LIZ500的混合物， 加入到96孔反 说明书 2/5 页 4 CN 107338318 A 4 应板中， 每孔10ul。 0024 (3)将96孔板置于平板离心机中， 离心500g即停。 0025 (4)在96孔板对应的孔中分别加入5个磨山雄系列样本DNA， 每个样品50pg。 0026 (5)参照以下PCR反应体系加入相应试剂到96孔板， 使用封板。
13、膜密封96孔板， 振荡， 将96孔板置于平板离心机中， 离心500g即停。 按照以下程序进行PCR反应。 0027 a.PCR反应体系 0028 25 l体系的配制 0029 模板( l)1 引物F( l)0.5 引物R( l)0.5 dNTP 10mM( l)0.5 Taq Buffer( l)2.5 25mM MgCl2( l)2.0 Taq酶( l)5U/ l0.2 水( l)17.8 0030 所述的引物F和引物R为： Geo101-F:AGCATCGACAGTTCAGTTGG和Geo101-R: GCAGTTGAATCTTGCCATCA。 0031 b.PCR反应条件 0032 00。
14、33 (6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却， 再将96孔板置于平板 离心机中， 离心2000g即停。 0034 (7)使用3730 xl测序分析仪(美国ABI公司)检测扩增片段。 0035 (8)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据， 利用STR毛细管电泳检测扩增片段峰， 横坐标为片段大小， 纵坐标为荧光强度值。 说明书 3/5 页 5 CN 107338318 A 5 0036 (9)利用标记Geo101扩增磨山系列品种， 能特异性区分磨山雄1号、 磨山雄2号、 磨 山雄3号、 磨山4号和磨山雄5号(图1)。 结果表明，磨山雄1号 不能扩增得条带；磨山雄2 号 扩。
15、增得到1条带， 为274bp；磨山雄3号 扩增得到3条带， 分别为264bp、 268bp和270bp； 磨山4号 扩增得到2条带， 分别为274bp和278bp；磨山雄5号 扩增得到2条带， 分别270bp 和272bp。 0037 0038 实施例3： 0039 用于猕猴桃雄性磨山品种鉴定的分子标记Geo101引物在鉴别猕猴桃品种中的应 用： 0040 提取 磨山雄1号 、磨山雄2号 、磨山雄3号 、磨山4号 、磨山雄5号 、华光2 号 、 西选1号 或 华优 猕猴桃的DNA样品， 利用实施例2的方法， 利用Geo101-F: AGCATCGACAGTTCAGTTGG和Geo101-R:G。
16、CAGTTGAATCTTGCCATCA。 对上述品种进行分子标记的 鉴定。 0041 利用标记Geo101扩增磨山系列品种， 能特异性区分 磨山雄1号 、磨山雄2号 、 磨山雄3号 、磨山4号 、磨山雄5号 、华光2号 、西选1号 或 华优 猕猴桃。 结果表明， 磨山雄1号 不能扩增得条带；磨山雄2号 扩增得到1条带， 为274bp；磨山雄3号 扩增得 到3条带， 分别为264bp、 268bp和270bp；磨山4号 扩增得到2条带， 分别为274bp和278bp； 磨山雄5号 扩增得到2条带， 分别270bp和272bp；华光2号 扩增得到2条带， 分别为264bp 和270bp；西选1号 。
17、扩增得到2条带， 分别为264bp和268bp；华优 扩增得到2条带， 分别为 268bp和282bp。 说明书 4/5 页 6 CN 107338318 A 6 0042 说明书 5/5 页 7 CN 107338318 A 7 序列表 中国科学院武汉植物园 用于猕猴桃磨山系列雄性品种鉴定的分子标记Geo101引物及应用 2 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 agcatcgaca gttcagttgg 20 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 gcagttgaat cttgccatca 20 序列表 1/1 页 8 CN 107338318 A 8 说明书附图 1/2 页 9 CN 107338318 A 9 图1 说明书附图 2/2 页 10 CN 107338318 A 10 。