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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610970897.X (22)申请日 2016.10.27 (71)申请人 浙江卫信生物药业有限公司 地址 315600 浙江省宁波市宁海县科技工 业园区竹泉路29号浙江卫信生物药业 有限公司 (72)发明人 马伟王进波齐莉莉周伟伟 熊细双徐伟杨盼景 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) (54)发明名称 一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备 方法 (57)摘要 本发明公开了一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖 衍生物的制备方法， 包括材料和制备工艺。 。
2、本发 明采用C群脑膜炎球菌粗制多糖、 溴化氰、 碳化二 亚胺、 蒸馏水、 乙腈、 盐酸、 氯化钠和氢氧化钠材 料， 通过溶液预备、 溶糖、 活化、 衍生、 超滤的制备 工艺， 在确保氧乙酰基含量符合标准的前提下， 使C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率得以 提高的技术方案， 所提供的一种C群脑膜炎球菌 荚膜多糖衍生物的制备方法， 使C群脑膜炎球菌 荚膜多糖衍生物的制备， 达到了提高衍生率的目 的。 权利要求书1页 说明书5页 CN 106366208 A 2017.02.01 CN 106366208 A 1.一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法， 包括材料和制备工艺， 其特征在 于： 。
3、所述的材料为： C群脑膜炎球菌粗制多糖； 溴化氰， 分析纯； 碳化二亚胺， 分析纯； A溶剂， 蒸馏水， 分析纯； B溶剂， 乙腈， 分析纯； 盐酸， 分析纯； 氯化钠， 分析纯； 氢氧化钠， 分析纯； 所述的制备工艺， 包括溶液预备、 溶糖、 活化、 衍生和超滤， 其中： 步骤一、 溶液预备 氯化钠溶液， 0.2mol/l， 由氯化钠与A溶剂配制而成； C氢氧化钠溶液， 0.1mol/l， 由氢氧化钠与A溶剂配制而成； D氢氧化钠溶液， 0.5mol/l， 由氢氧化钠与A溶剂配制而成； 盐酸溶液， 0.1mol/l， 盐酸与A溶剂配制而成； 溴化氰溶液， 1g/ml， 由溴化氰与B溶剂配制而。
4、成； 碳化二亚胺溶液， 0.1mol/l， 由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成； 步骤二、 溶糖 取C群脑膜炎球菌粗制多糖0.101g， 置于烧杯中， 加入所述氯化钠溶液20ml， 用磁力搅 拌器搅拌， 搅拌转速400转/分钟， 搅拌时间30分钟， 获得多糖溶液； 之后， 将盛有多糖溶液的 烧杯放入水浴锅中水浴加热， 水浴控温为233， 用所述C氢氧化钠溶液调节所述多糖溶 液的pH值至pH11.400.20， 获得J多糖溶液； 步骤三、 活化 在水浴控温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述J多糖溶液加入所 述溴化氰溶液150 l， 进行活化反应， 活化时间20分钟， 此间。
5、， 用所述D氢氧化钠溶液控制烧 杯中反应物的pH值保持pH11.400.20， 获得H多糖溶液； 之后， 用所述盐酸溶液调节所述H 多糖溶液的pH值至pH在9.00.20， 获得JH多糖溶液； 步骤四、 衍生 在水浴控温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述JH多糖溶液加入所 述碳化二亚胺溶液20ml， 进行衍生反应， 衍生时间15分钟， 此间， 用所述D氢氧化钠溶液控制 烧杯中反应物的pH值保持pH9.000.20， 获得Y多糖溶液； 之后， 将所述Y多糖溶液移至无菌 冷库内， 在搅拌转速600转/分钟， 无菌冷库内温度28的状态下， 进行低温搅拌， 低温搅 拌用时16小时。
6、， 获得YP多糖溶液； 步骤五、 超滤 将YP多糖溶液， 用超滤机及50kD的超滤膜包进行6次换膜超滤， 超滤后的浓缩液， 即为C 群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106366208 A 2 一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种疫苗中间体的制备方法， 具体是指用于制作C群脑膜炎球菌结合 疫苗的中间体的一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法。 背景技术 0002 名词定义 0003 脑膜炎球菌： 脑膜炎球菌(meningococcus)的学名是脑膜炎奈瑟氏球菌 (n.meninyitidis)， 为流行性脑脊髓膜炎(流。
7、脑)的病原菌。 现引起人体病变的菌株分型主 要有A群、 B群、 C群、 Y群及W135群。 0004 脑膜炎球菌多糖疫苗： 提取特定菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖， 经制剂成疫 苗， 用于预防该菌株脑膜炎球菌的侵袭感染。 0005 脑膜炎球菌结合疫苗： 提取特定菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖， 将荚膜多糖 与特定的蛋白或多肽进行偶联， 制备成结合物， 再经制剂成疫苗， 用于预防该菌株脑膜炎球 菌的侵袭感染。 0006 荚膜多糖： 细菌细胞壁外荚膜中的主要成分， 可以是同多糖或异多糖。 0007 衍生物： 将荚膜多糖经过化学手段修饰， 形成易于蛋白或多肽进行偶联的一种中 间体。 0008 衍生率。
8、： 评价衍生物制备工艺的关键性参数指标， 是影响到结合物质量标准的重 要环节参数。 0009 氧乙酰基： 许多细菌荚膜多糖中都存在氧乙酰基， 氧乙酰化修饰发生在多糖合成 后， 其对细菌的免疫原性有重要的意义。 0010 C群脑膜炎球菌多糖疫苗， 以下简称C流脑多糖疫苗； 由于C流脑多糖疫苗在2周岁 以下的婴幼儿体内所诱生的抗体持续时间短， 不能诱导免疫记忆， 因此C流脑多糖疫苗只对 成人具有持久免疫作用， 而对婴幼儿则无持久免疫作用， 为此， 采取多次重复免疫接种， 使 婴幼儿安渡脑膜炎流行季。 研究表明， C流脑多糖疫苗中的荚膜多糖CPS为胸腺非依赖性抗 原TI-Ag， 采用将多糖与蛋白载体。
9、偶联， 可使胸腺非依赖性抗原TI-Ag转变为胸腺依赖性抗 原TD-Ag， 从而改变荚膜多糖CPS的抗原性质， 可增强免疫原性， 诱导出免疫记忆， 由多糖/蛋 白结合制备的C群脑膜炎球菌结合疫苗， 简称C流脑结合疫苗， 能够为2岁以下婴幼儿提供长 期抗C流脑的免疫作用。 0011 结合疫苗的制备方法主要分为直接结合和使用接头两类， 0012 直接结合法， 一般限于羧基和具有一级胺基的醛基之间的缩合反应(酰胺键的形 成或酰胺化)， 其产物需进一步还原才能稳定， 如还原胺化法(reductive amination)， 还原 胺化法已成功地用于制备Hib、 脑膜炎双球菌结合疫苗。 0013 使用接头。
10、法， 采用适宜的探头将蛋白同多糖进行桥接偶联， 进而形成稳定的结合 物。 如碳化二亚胺法， 可采用碳化二亚胺ADH作为探头， 在碱性条件下用CNBr活化多糖， 然后 将活化的多糖与ADH反应形成PS-ADH衍生物， 之后在EDC的介导下与蛋白载体形成稳定的结 说明书 1/5 页 3 CN 106366208 A 3 合物。 CNBr-ADH方法已成功地用于制备痢疾杆菌、 伤寒杆菌、 脑膜炎双球菌结合疫苗、 Hib结 合疫苗的。 0014 本文涉及使用接头法中用于制备C流脑结合疫苗的衍生物中间体的一种方法， 该 衍生物中间体的全称为： C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物； 0015 各生物制剂厂家制备。
11、C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的工艺及参数各异， 所获得 的衍生物质量不尽相同， 致使所制备的结合物， 即， C流脑结合疫苗的品质难以一致； 制备衍 生物的衍生工艺是决定结合物的免疫原性、 安全性和收获率的关键， 其难点在于， 衍生物的 衍生率与氧乙酰基含量呈非线性、 此消彼长、 难以控制的关系； 0016 现有技术在确保氧乙酰基含量符合中国药典2015版， C群脑膜炎球多糖氧乙酰基 含量要求不低于1.5mmol/g标准的前提下， 所制备的C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生 率为0.150.33， 偏低； 若将衍生率提高至0.40， 则氧乙酰基含量明显下降至低于标 准； 因此， 现有技术存在衍生。
12、率难以提高的问题与不足。 发明内容 0017 针对上述现有技术存在的问题与不足， 本发明采用C群脑膜炎球菌粗制多糖、 溴化 氰、 碳化二亚胺、 蒸馏水、 乙腈、 盐酸、 氯化钠和氢氧化钠材料， 通过溶液预备、 溶糖、 活化、 衍 生、 超滤的制备工艺， 在确保氧乙酰基含量符合标准的前提下， 使C群脑膜炎球菌荚膜多糖 衍生物的衍生率得以提高的技术方案， 提供一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方 法， 旨在使C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备， 达到提高衍生率的目的。 0018 本发明的目的是这样实现的： 一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法， 包 括材料和制备工艺， 其中： 0019 。
13、所述的材料为： 0020 C群脑膜炎球菌粗制多糖； 0021 溴化氰， 分析纯； 0022 碳化二亚胺， 分析纯； 0023 A溶剂， 蒸馏水， 分析纯； 0024 B溶剂， 乙腈， 分析纯； 0025 盐酸， 分析纯； 0026 氯化钠， 分析纯； 0027 氢氧化钠， 分析纯； 0028 所述的制备工艺， 包括溶液预备、 溶糖、 活化、 衍生和超滤， 其中： 0029 步骤一、 溶液预备 0030 氯化钠溶液， 0.2mol/l， 由氯化钠与A溶剂配制而成； 0031 C氢氧化钠溶液， 0.1mol/l， 由氢氧化钠与A溶剂配制而成； 0032 D氢氧化钠溶液， 0.5mol/l， 由氢氧。
14、化钠与A溶剂配制而成； 0033 盐酸溶液， 0.1mol/l， 盐酸与A溶剂配制而成； 0034 溴化氰溶液， 1g/ml， 由溴化氰与B溶剂配制而成； 0035 碳化二亚胺溶液， 0.1mol/l， 由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成； 0036 步骤二、 溶糖 说明书 2/5 页 4 CN 106366208 A 4 0037 取C群脑膜炎球菌粗制多糖0.101g， 置于烧杯中， 加入所述氯化钠溶液20ml， 用磁 力搅拌器搅拌， 搅拌转速400转/分钟， 搅拌时间30分钟， 获得多糖溶液； 之后， 将盛有多糖溶 液的烧杯放入水浴锅中水浴加热， 水浴控温为233， 用所述C氢氧化钠溶液。
15、调节所述多 糖溶液的pH值至pH11.400.20， 获得J多糖溶液； 0038 步骤三、 活化 0039 在水浴控温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述J多糖溶液加 入所述溴化氰溶液150 l， 进行活化反应， 活化时间20分钟， 此间， 用所述D氢氧化钠溶液控 制烧杯中反应物的pH值保持pH11.400.20， 获得H多糖溶液； 之后， 用所述盐酸溶液调节所 述H多糖溶液的pH值至pH在9.00.20， 获得JH多糖溶液； 0040 步骤四、 衍生 0041 在水浴控温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述JH多糖溶液加 入所述碳化二亚胺溶液20ml，。
16、 进行衍生反应， 衍生时间15分钟， 此间， 用所述D氢氧化钠溶液 控制烧杯中反应物的pH值保持pH9.000.20， 获得Y多糖溶液； 之后， 将所述Y多糖溶液移至 无菌冷库内， 在搅拌转速600转/分钟， 无菌冷库内温度28的状态下， 进行低温搅拌， 低 温搅拌用时16小时， 获得YP多糖溶液； 0042 步骤五、 超滤 0043 将YP多糖溶液， 用超滤机及50kD的超滤膜包进行6次换膜超滤， 超滤后的浓缩液， 即为C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物。 0044 有益效果 0045 检测结果， 用本发明制备的C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率为0.43 0.89， 氧乙酰基含量为1.562.。
17、02mmol/g； 即， 本发明的衍生率0.430.89高于现有 技术的0.150.33， 本发明的氧乙酰基含量1.562.02mmol/g符合中国药典2015版， 氧乙酰基含量不低于1.5mmol/g的要求。 0046 上述， 本发明采用C群脑膜炎球菌粗制多糖、 溴化氰、 碳化二亚胺、 蒸馏水、 乙腈、 盐 酸、 氯化钠和氢氧化钠材料， 通过溶液预备、 溶糖、 活化、 衍生、 超滤的制备工艺， 在确保氧乙 酰基含量符合标准的前提下， 使C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率得以提高的技术 方案， 克服了现有技术存在衍生率难以提高的问题与不足， 所提供的一种C群脑膜炎球菌荚 膜多糖衍生物的制备方。
18、法， 使C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备， 达到了提高衍生率的 目的。 实施例说明 0047 以下通过具体实施例对本发明的一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的制备方法 作进一步详细说明， 所属领域的技术人员可以参照实施例制得衍生率为0.430.89， 氧乙酰基含量为1.562.02mmol/g的C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物， 但不应理解为对本 发明的任何限制。 具体实施方式 0048 0049 制备条件、 设备 说明书 3/5 页 5 CN 106366208 A 5 0050 环境气压： 一个大气压； 环境温度： 15； 0051 制备设施、 设备： 无菌室(C+A级)、 无菌冷库、 pH计。
19、(FE 20)、 磁力搅拌器(RCT basic)、 超滤机(50cm2-50kD)、 烧杯、 水浴锅； 0052 实施例 0053 品名： C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物 0054 材料： 0055 C群脑膜炎球菌粗制多糖； 0056 溴化氰， 分析纯； 0057 碳化二亚胺， 分析纯； 0058 A溶剂， 蒸馏水， 分析纯； 0059 B溶剂， 乙腈， 分析纯； 0060 盐酸， 分析纯； 0061 氯化钠， 分析纯； 0062 氢氧化钠， 分析纯； 0063 制备工艺依次为： 溶液预备、 溶糖、 活化、 衍生和超滤： 0064 步骤一、 溶液预备 0065 氯化钠溶液， 0.2mol/l，。
20、 由氯化钠与A溶剂配制而成； 0066 C氢氧化钠溶液， 0.1mol/l， 由氢氧化钠与A溶剂配制而成； 0067 D氢氧化钠溶液， 0.5mol/l， 由氢氧化钠与A溶剂配制而成； 0068 盐酸溶液， 0.1mol/l， 盐酸与A溶剂配制而成； 0069 溴化氰溶液， 1g/ml， 由溴化氰与B溶剂配制而成； 0070 碳化二亚胺溶液， 0.1mol/l， 由碳化二亚胺与所述氯化钠溶液配制而成； 0071 步骤二、 溶糖 0072 取C群脑膜炎球菌粗制多糖0.101g， 置于烧杯中， 加入所述氯化钠溶液20ml， 用磁 力搅拌器搅拌， 搅拌转速400转/分钟， 搅拌时间30分钟， 获得多。
21、糖溶液； 之后， 将盛有多糖溶 液的烧杯放入水浴锅中水浴加热， 水浴控温为233， 用所述C氢氧化钠溶液调节所述多 糖溶液的pH值至pH11.400.20， 获得J多糖溶液； 0073 步骤三、 活化 0074 在水浴控温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述J多糖溶液加 入所述溴化氰溶液150 l， 进行活化反应， 活化时间20分钟， 此间， 用所述D氢氧化钠溶液控 制烧杯中反应物的pH值保持pH11.400.20， 获得H多糖溶液； 之后， 用所述盐酸溶液调节所 述H多糖溶液的pH值至pH在9.00.20， 获得JH多糖溶液； 0075 步骤四、 衍生 0076 在水浴控。
22、温233， 搅拌转速400转/分钟的状态下， 向烧杯中所述JH多糖溶液加 入所述碳化二亚胺溶液20ml， 进行衍生反应， 衍生时间15分钟， 此间， 用所述D氢氧化钠溶液 控制烧杯中反应物的pH值保持pH9.000.20， 获得Y多糖溶液； 之后， 将所述Y多糖溶液移至 无菌冷库内， 在搅拌转速600转/分钟， 无菌冷库内温度28的状态下， 进行低温搅拌， 低 温搅拌用时16小时， 获得YP多糖溶液； 0077 步骤五、 超滤 说明书 4/5 页 6 CN 106366208 A 6 0078 将YP多糖溶液， 用超滤机及50kD的超滤膜包进行6次换膜超滤， 超滤后获得的浓缩 液， 即为C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物。 0079 经三个批次的检测， 上述的C群脑膜炎球菌荚膜多糖衍生物的衍生率为0.43 0.89， 氧乙酰基含量为1.562.02mmol/g。 说明书 5/5 页 7 CN 106366208 A 7 。