技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种蛋白的固定化方法。
背景技术
蛋白的固定化过程在生物传感器、蛋白分离纯化、诊断检测与分析、固定 化酶催化等诸多生物技术中扮演着重要的角色。在很多应用中，需要载体具有 高的蛋白结合量以提高载体在分离、检测、分析、催化等过程中的应用性能。 聚电解质刷是一种新型的载体，它是由载体和接枝在载体表面聚电解质链段所 组成，由于接枝在载体表面的聚电解质链段密度极高，在良溶剂中，聚电解质 链段在载体表面向外伸展呈现类似毛刷状的结构。根据载体的形状可分为聚电 解质板刷和聚电解质球刷。聚电解质板刷最早由Rühe等人在1999年通过表面 引发聚合手段合成，聚电解质球刷也由Ballauff等在同一年合成。在这一载体 中，单体在微球表面生长形成向外舒展，具有“3D”结构的聚电解质刷结构， 为蛋白的结合提供了大量位点，具有实现多层蛋白结合，大幅提高蛋白结合量 的潜在能力。另外，聚电解质刷也可以通过先合成聚电解质链段，然后嫁接到 载体表面的方式形成。
对现有技术的文献检索发现，Ballauff等在《Physical Chemistry Chemical Physics》2003年第5卷1671～1677页发表的《聚电解质球刷在水溶液中对蛋白 的吸附》（Adsorption of proteins on spherical polyelectrolyte brushes in aqueous solution,Phys.Chem.Chem.Phys.,2003,5,1671–1677）首次证明了聚电解质球刷 能以静电吸附方式结合大量的蛋白。Bruening等在2006年发表于《Langmuir》 的论文《聚丙烯酸刷及其衍生物对蛋白的高结合量固定化》（High-Capacity Binding of Proteins by Poly(Acrylic Acid)Brushes and Their Derivatives, Langmuir,2006,22,42744281）中报道带负电的聚丙烯酸板刷能够以静电吸附 方式结合一种带正电的蛋白——溶菌酶，其结合量高达80层。上述研究证明 物理吸附作为一种简单有效的方法，能够发挥聚电解质刷大量结合蛋白的潜 能。但是，物理吸附的特性决定了这种结合具有不稳定性。上述文献也表明， 在较高的盐浓度（例如生理环境）和环境pH改变的情况下，大量的蛋白会从 聚电解质刷载体上释放出来。而在生物传感器、诊断检测与分析、固定化酶催 化等实际应用过程中，通常要求蛋白与载体的复合物在生理条件以及各种复杂 环境和操作过程中具有高度的稳定性，这使得单纯通过物理吸附结合蛋白的载 体无法胜任某些应用。而化学结合恰恰能够弥补这一不足。
针对蛋白在聚电解质球刷上的化学共价固定化，现有的技术方案中对于不 同的蛋白和聚电解质刷，得到的蛋白固定量差异巨大。例如，同样采用基于水 溶性碳二亚胺EDC的偶联方法，Bruening等在其发表于《Langmuir》的论文中 （High-Capacity Binding of Proteins by Poly(Acrylic Acid)Brushes and Their Derivatives,Langmuir,2006,22,42744281）就提到聚丙烯酸板刷对BSA的固定 化效率较低，其结合量低于单层蛋白结合量的2倍。另一篇文献报道的采用聚 合度为1000以上的聚丙烯酸刷用同样的方法结合RNA酶（RNase A）结合量 为单层结合量的16倍（Polymeric Brushes as Functional Templates for Immobilizing Ribonuclease A:Study of Binding Kinetics and Activity,Langmuir, 2008,24,913-920），尽管结合量有所提升，但是对于如此高长度的聚丙烯酸刷 而言，其对刷子内部空间利用率仍处于较低水平。因此，在这一领域中，亟需 建立一种简便高效而具有普适性的化学共价固定化蛋白的方法，使得人们能够 以一种可控的方式，充分提升聚电解质刷内部空间大量位点的利用率，将大量 蛋白稳定结合到聚电解质刷载体上，以提高其应用性能。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，发明一种聚电解质刷对蛋白的高结 合量的化学共价固定化方法。
首先，在物理吸附有利的条件下，将蛋白吸附于聚电解质刷上。对于某种聚电 解质刷和蛋白，通过控制体系的pH、盐浓度和温度等条件，使得蛋白能够通过静 电、氢键、疏水作用或范德华力等作用力大量吸附到聚电解质刷上。其次，在物理 吸附有利的条件下进行洗涤，除去体系中过量的蛋白以及与聚电解质刷表面疏松结 合的蛋白。再次，在物理吸附有利的条件下通过偶联化学反应将蛋白以化学键牢固 结合在刷上。最后，洗涤除去过量反应物并将聚电解质刷-蛋白复合物分别转移至 适应其各自下游应用所需的环境中。与在聚电解质刷上采用物理吸附方式固定蛋白 相比，采用本发明提出的蛋白化学共价固定法可以保证蛋白与聚电解质刷稳定结 合，不会因pH、盐浓度等外界环境改变而使得蛋白从聚电解质刷上脱落或解离下 来。另外，与现有直接进行化学共价固定蛋白技术相比，采用本发明提出的化学共 价结合蛋白方法在聚电解质刷表面结合的蛋白量为在载体表面单层吸附量的数倍 至数十倍，可以有效克服在聚电解质刷上采用直接化学共价固定法固定的蛋白荷载 量低且实验重现性不佳的问题。
本发明是通过以下技术方案来解决上述技术问题的：
本发明提供了一种利用聚电解质刷固定蛋白的方法，可以在聚电解质刷上 实现超高蛋白荷载量的化学共价固定化，包括如下步骤，
步骤一、将聚电解质刷分散于缓冲液中，将溶有蛋白的缓冲液加入上述聚 电解质刷分散液中，混合吸附2小时，蛋白吸附到聚电解质刷上；
步骤二、离心洗涤聚电解质刷-蛋白复合物2～3次，除去体系中过量的蛋白 以及与聚电解质刷表面疏松结合的蛋白，将聚电解质刷-蛋白复合物重新悬浮于 缓冲液中制得聚电解质刷-蛋白复合物体系；
步骤三、向含有聚电解质刷-蛋白复合物的体系中加入化学交联试剂，混合 后室温反应2小时；
步骤四、离心后洗涤聚电解质刷-蛋白复合物2～3次，以除去过量的化学交 联剂。
本发明中，缓冲液优选为对所用的聚电解质刷及其拟吸附的蛋白是物理吸附 有利的缓冲液。所述的对所用的聚电解质刷及其拟吸附的蛋白是物理吸附有利的 缓冲液是指，但不限于，
以所吸附的蛋白的等电点小于6.0为例，缓冲液的选择规则如下：
针对含有羧酸功能基团的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=4.0～6.0的MES 缓冲液；
针对含有氨基的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=7.0～8.0的磷酸盐缓冲 液；
针对含有羟基的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=6.0～8.0磷酸盐缓冲液；
针对含有巯基的聚电解质刷时，缓冲液可以选择pH=6.0～8.0磷酸盐缓冲 液。
以所吸附的蛋白的等电点大于6.0为例，缓冲液的选择规则如下：
针对含有羧酸功能基团的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=5.0～7.0的MES 缓冲液或磷酸盐缓冲液；
针对含有氨基的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=7.0～9.0的硼酸盐缓冲 液；
针对含有羟基的聚电解质刷，缓冲液可以选择pH=6.0～8.0磷酸盐缓冲液；
针对含有巯基的聚电解质刷时，缓冲液可以选择pH=6.0～8.0磷酸盐缓冲 液。
优选的，缓冲液浓度为5mM-10mM，缓冲液中加入0.05%w/v的Tween-20。
步骤一中，聚电解质刷由固相载体和接枝在载体表面的聚电解质链段组 成。聚电解质链段的一端接枝在载体表面并向外伸展呈现刷子结构。其中，载 体可以是平板，或者是粒径5纳米至1000纳米的微球，聚电解质为带有电荷 且具有可反应基团的聚合物。
优选地，步骤一中，聚电解质刷为聚丙烯酸球刷或聚N-（2-氨基乙基）丙 烯酰胺球刷。
优选地，步骤一中，吸附温度为25-37℃。
优选地，步骤三中，化学交联剂的选择规则如下：针对聚丙烯酸等含有羧 酸功能基团的聚电解质刷，优选化学交联剂为1～20mM1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）的水溶液；针对含有氨基的聚电解质刷，优选 化学交联剂为戊二醛水溶液；针对含有羟基的聚电解质刷，优选化学交联剂为 高碘酸钠水溶液；针对含有巯基的聚电解质刷时，优选化学交联剂为马来酰亚 胺试剂。
步骤四中，洗涤聚电解质刷-蛋白复合物的洗涤液优选但不限于，与生理环 境相似的等渗溶液，如PBS、生理盐水、Tris-HCl等。
本发明的一个优选地实施路线为，将聚电解质刷置于对蛋白物理吸附有利 的合适的pH和盐浓度的水溶液中，将过量的蛋白溶解在相同的水溶液中加入 上述聚电解质刷的体系中，在合适的温度下恒温混合2小时，使蛋白吸附到聚 电解质刷上。用聚电解质球刷吸附蛋白所用的水溶液洗涤聚电解质刷-蛋白复合 物2～3次，除去体系中过量的蛋白以及与聚电解质刷表面疏松结合的蛋白。向 含有聚电解质刷-蛋白复合物的体系中加入可使聚电解质刷上的功能基团与蛋 白进行化学共价交联反应的含有化学交联试剂的水溶液混合后室温反应2小 时。所述的水溶液和聚电解质刷吸附蛋白所用的水溶液相同。用洗涤液洗涤聚 电解质刷-蛋白复合物2～3次，以除去过量的化学交联剂，最终根据其下游应用 所需，将聚电解质刷-蛋白复合物分散在适应其各自下游应用所需的环境中。
优选地但不限于，所述的聚电解质刷采用的是《胶体与界面科学杂志》2013 年第398卷82～87页发表的表面引发RAFT聚合法得到具有可控聚电解质毛刷 链段厚度、聚电解质链段分子量分布窄且球刷粒径分布小的聚电解质刷。
在本发明较佳的实施方式中，所述的物理吸附有利的条件是指具有合适 pH、盐浓度的溶液和合适的吸附温度。溶液优选浓度为10mM，pH=4.0～6.0的 MES缓冲液。吸附温度优选为25℃-37℃。
在本发明的具体的实施方式中，所述的化学交联试剂是指但不限于，针对 聚丙烯酸等含有羧酸功能基团的聚电解质刷，优选使用1～20mM1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）的水溶液；针对含有氨基的聚电解质 刷，可以选用戊二醛等水溶液；针对含有羟基的聚电解质刷，可以采用高碘酸 钠水溶液；针对含有巯基的聚电解质刷时，可以采用马来酰亚胺试剂等。
在本发明的具体的实施方式中，所需的应用环境是指结合了蛋白的聚电解 质刷在后续的应用中所需的环境。可以是模拟体液环境的磷酸盐缓冲液（PBS） 生理盐水或血清、血浆以及全血等生理环境。
在上述过程中，最终聚电解质刷上的蛋白化学结合量可以通过BCA蛋白 定量法分别测定加入的聚电解质悬浮体系中的蛋白量以及未被结合到聚电解 质球刷上的反应体系上清液和蛋白固定化洗涤过程中洗涤液中的蛋白含量，并 通过加入蛋白前后的差减量计算得到。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不 限于下述的实施例。在实施例中，所采用的试剂除另有说明外均为市售商品。
实施例1
采用聚丙烯酸球刷对小牛血清白蛋白（BSA蛋白）进行化学固定化。
首先，采用《胶体与界面科学杂志》2013年第398卷82～87页发表的表面 引发RAFT聚合法制备得到球核为100纳米的氧化硅，聚电解质毛刷状链段长 度为40纳米，接枝密度为0.24nm-2的聚丙烯酸电解质球刷。
采用离心-重悬的方式，将上述球刷用10mM MES缓冲液（pH=5.0，含有 0.05%w/v的Tween-20）洗涤2次，超声分散在上述缓冲液中。同时，用该缓 冲液溶解BSA蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均匀混合。 最终球刷浓度为0.8mg/ml，蛋白浓度为1mg/ml。
在25℃烘箱中恒温孵育2小时，使蛋白充分吸附于聚电解质毛刷链段表面。
离心，弃去上清，并用上述MES缓冲液洗涤产物2次。同时用该缓冲液 溶解EDC配制成浓度为5mM的EDC溶液，并加入到含有产物的离心管中， 混合均匀。继续在25℃培养2小时，使吸附在球刷上的蛋白通过化学键连接在 球刷上。
离心，弃去上清，用上述MES缓冲液洗涤产物2次除去过量的EDC，再 用10mM PBS缓冲液（pH=7.2）洗涤产物2次，并将产物分散在PBS中。
经BCA法测试，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA复合物的蛋白结合 量为790μg BSA/mg球刷，为单层饱和结合量的6倍，且复合物在PBS等条件 下能够稳定存在，不存在蛋白释放现象。
实施例2
采用聚丙烯酸球刷对溶菌酶蛋白进行化学固定化。
采用的聚电解质刷与实施例1中相同。
采用离心-重悬的方式，将上述球刷用10mM MES缓冲液（pH=6.0，含有 0.05%w/v的Tween-20）洗涤2次，超声分散在上述缓冲液中。同时，用该缓 冲液溶解溶菌酶蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均匀混 合。最终球刷浓度为0.5mg/ml，蛋白浓度为1.5mg/ml。
在37℃烘箱中恒温培养2小时，使蛋白充分吸附于聚电解质刷表面。
离心，弃去上清，并用上述MES缓冲液洗涤产物2次。同时用该缓冲液 溶解EDC配制成浓度为2mM的EDC溶液，并加入到含有产物的离心管中， 混合均匀。继续在37℃培养2小时，使吸附在球刷上的蛋白通过化学键连接在 球刷上。
离心，弃去上清，用上述MES缓冲液洗涤产物2次除去过量的EDC，再 用10mM PBS缓冲液（pH=7.2）洗涤产物2次，并将产物分散在PBS中。
经BCA法测试，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA复合物的蛋白 结合量为2400μg BSA/mg球刷，为单层饱和结合量的35倍，且复合物在PBS 等条件下能够稳定存在，不存在蛋白释放现象。
实施例3
采用聚N-（2-氨基乙基）丙烯酰胺球刷对BSA蛋白进行化学固定化。
聚电解质球刷的合成方法与实施例1和2相同，其中，将单体由丙烯酸替 换为N-（2-氨基乙基）丙烯酰胺，得到球核为100纳米氧化硅，聚电解质毛刷 链段长度为60纳米，接枝密度为0.15nm-2的聚丙烯酸电解质球刷。
球刷的化学固定化方法与实施例2相同，经BCA法测试，得到的聚N-（2- 氨基乙基）丙烯酰胺球刷-BSA复合物的蛋白结合量为1500μg BSA/mg球刷， 为单层饱和结合量的11倍，且复合物在PBS等条件下能够稳定存在，不存在 蛋白释放现象。
实施例4
采用硅平板接枝的聚丙烯酸板刷对BSA蛋白进行化学固定化。
聚电解质板刷的合成方法与实施例1～3基本相同。其中，将聚丙烯酸链段 固定的载体由100nm氧化硅微球改为硅平板，得到聚电解质链段长度为100纳 米，接枝密度为0.2nm-2的聚丙烯酸板刷。
聚丙烯酸板刷对蛋白的化学固定化方法与实施例2相同，经BCA法测试， 得到的聚丙烯酸板刷-BSA复合物的蛋白固定密度为6.0μg/cm2，为单层饱和结 合量的15倍，且复合物在PBS等条件下能够稳定存在，不存在蛋白释放现象。
实施例5
采用球核为1000纳米的聚丙烯酸球刷对BSA蛋白进行化学固定化。
聚电解质球刷的合成方法与实施例1～4基本相同。其中，将例1～3中的球 核由100nm氧化硅微球改为1000nm氧化硅微球，得到聚电解质链段长度为 120nm，接枝密度为0.55nm-2的聚丙烯酸球刷。
球刷对蛋白的化学固定化方法与实施例2相同，经BCA法测试，得到的 聚丙烯酸板刷-BSA复合物的蛋白固定密度为450μg BSA/mg，为单层饱和结合 量的36倍，且复合物在PBS等条件下能够稳定存在，不存在蛋白释放现象。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需 创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中 技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验 可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。