技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤和免疫增强活性的阿魏酰低聚糖及其制备方法和用途，属于 天然药物领域。
背景技术
阿魏酰低聚糖(FOs)是一类广泛存在于禾本科植物中的不同糖链位置上的羟基与阿魏 酸(FA)羧基酯化形成的功能性低聚糖。FOs具有阿魏酰基与亲水性的低聚糖基团，兼具水 溶性和耐热性。目前的研究主要集中在其制备方法及抗氧化的生物活性上，由于FOs具有较 强的抗氧化性和生物活性，其抗氧化活性强于阿魏酸及膳食纤维，对Fe2+、H2O2和羟自由基 具有较强的清除能力，FOs还具有抑制金黄色葡萄球菌的生长、增殖双歧杆菌和对蛋白非酶 糖基化反应具有抑制作用等功能，因而，FOs在保健食品和医药工业中具有广阔的应用前景， 但其体内生物活性有待深入研究，低聚糖的生物活性与其结构有着密切的关系，FOs组分及 聚合度对抗肿瘤活性及免疫增强活性的影响未见报道。
发明内容
有鉴于此，提供一种具有抗肿瘤和免疫增强活性的阿魏酰低聚糖及其制备方法和用途实 为必要。
一种具有抗肿瘤和免疫增强活性的阿魏酰低聚糖，由以下方法制得：
(1)配置培养基：向60g/L麦麸液中添加10g/L木聚糖和1g/L蛋白胨；
(2)发酵培养基：利用该培养基进行液态发酵，控制起始发酵pH4.0、起始温度33℃，在 发酵至36h时，将pH和温度分别调控为6.0和29℃，发酵至84h，制得阿魏酰低聚糖。
上述阿魏酰低聚糖由聚合度分别为6、5、4，由分子量分别为1118、986、854的阿魏酰 阿拉伯糖基木六糖(FAX6)、阿魏酰阿拉伯糖基木五糖(FAX5)、阿魏酰阿拉伯糖基木四糖 (FAX4)构成。
上述具有抗肿瘤和免疫增强活性的阿魏酰低聚糖在制备抗肿瘤药物中增强免疫保健品中 的用途。
本发明提供一种制备阿魏酰低聚糖的方法，由其制得的阿魏酰低聚糖具有抗肿瘤活性及 免疫增强活性，将阿魏酰低聚糖在保健食品及医药中的应用变为现实，同时也提升了麦麸利 用的附加值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明
制备具有抗肿瘤和免疫增强活性的阿魏酰低聚糖，具体方法为：向60g/L麦麸液中添加 10g/L木聚糖和1g/L蛋白胨制得培养基；利用该培养基进行液态发酵，控制起始发酵pH4.0、 起始温度33℃，在发酵至36h时，将pH和温度分别调控为6.0和29℃，发酵至84h，制得 阿魏酰低聚糖。
经液相色谱及气相色谱分析表明，上述阿魏酰低聚糖由木糖、阿拉伯糖和阿魏酸三种成 分组成；紫外光谱分析表明，FOs在MOPS缓冲液中在325nm处具有最大值；红外光谱分析 表明，FOs中存在羟基、酯键及阿拉伯糖基等特征基团；电喷雾电离质谱分析表明，FOs聚 合度分别为6、5、4，由分子量分别为1118、986、854的阿魏酰阿拉伯糖基木六糖(FAX6)、 阿魏酰阿拉伯糖基木五糖(FAX5)、阿魏酰阿拉伯糖基木四糖(FAX4)构成。
阿魏酰低聚糖抗肿瘤及免疫增强活性药效学实验
一、FOs体外抗肿瘤活性实验
1.受试药物的配制
精密称取样品FOs，加入DMSO溶解，在37℃超声条件下充分稀释成均匀溶液，按比例 稀释，浓度范围为1000ug/ml～7.8ug/ml。
2.肿瘤细胞株的培养
细胞株BGC-823和HepG2采用添加10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，细胞株A549 采用添加10％胎牛血清的F-12NutrientMixture培养液，在37.0℃、空气浓度95％和CO2浓 度5％的条件下培养。
3.细胞生长抑制实验
将处于对数生长期的细胞BGC-823、HepG2和A549采用0.02％EDTA消化，制成细胞 悬液。以1×105的细胞浓度加入96孔培养板100μl/孔，设三重复孔，置于37℃5％CO2培养 箱内培养。培养24小时后，分别加入终浓度水平从1000ug/ml～7.8ug/ml的样品FOs，培养 48小时。然后加5mg/mlMTT溶液20μl/孔，于37℃继续培养4h，弃去全部上清，加入 DMSO100μl/孔，微型振荡器上振5min，使结晶完全溶解，用酶联仪570nn波长处测定吸 光度值(A)，计算细胞抑制率。生长抑制率用量效曲线计算的IC50(与对照品相比使细胞生长 下降50％的药物浓度)来表示，采用SPSS18.0统计软件进行统计评价。
4.FOs对细胞株生长抑制作用
FOs在体外对人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞BGC-823、人肺腺癌细胞A549的生长均 具有一定的抑制作用，且生长抑制率随药物浓度的增加呈上升趋势，如表1、2、3所示。当 药物浓度达到1000μg/mL时，FOs对各癌细胞株的抑制活性都最高，且对人肝癌细胞HepG2 的生长抑制效果最好。
表1FOs对人肝癌细胞HepG2生长抑制作用
表2FOs对人胃癌细胞BGC-823生长抑制作用
表3FOs对人肺腺癌细胞A549生长抑制作用
二、FOs体内抗肿瘤活性及免疫增强活性实验
1.S180肿瘤小鼠模型制备
取ICR小鼠，按移植性肿瘤研究法，接种实体型瘤。每只小鼠右前肢腋窝皮下接种0.2ml， 接种后24小时称鼠重，并随机分为五组，给药组每组8只。
2.实验动物分组及药试
取ICR小鼠和S180肿瘤小鼠，并分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、FOs1组、 FOs2组，每组8只。正常对照组：生理盐水，0.4ml/20g/d，灌胃给药；模型对照组：生理 盐水，0.4ml/20g/d，灌胃给药；阳性对照组：5-FU，静脉注射给药，隔天给药一次，共给药 5次，给药体积均为0.4ml/20g；FOs1组：50、100、250mg.kg-1·d-1，灌胃给药；FOs2组： 50、100、250mg.kg-1·d-1，灌胃给药。于接种S180肿瘤24小时后(d1)第一次给药，灌胃给 药，每天给药一次，共给药10次。
3.体内抗肿瘤活性指标的分析
于接种后第11天(d11)采用颈脱位法处死荷瘤小鼠，称重，并于无菌条件下分离瘤块、胸腺和脾脏，称重，按计算，其中C为模型对照组平均瘤重，T为实验组平均瘤重；其中I为小鼠初重，Z为小鼠终重；胸腺和脾脏指数为胸腺和脾脏的重量(mg)与小鼠的体重(g)之比。
4.肿瘤组织切片观察
采用10％中性福尔马林液固定小鼠瘤体，常规石蜡包埋后切片，经HE染色，于光镜下观 察组织切片病理学变化，并拍照。
5.细胞因子的检测
IFN-γ活性检测：采用微量病变抑制法；IL-3活性检测：采用骨髓干细胞增殖法，MTT比 色法测定。
6.数据统计与分析
实验设3次重复，结果取平均值。数据用SPSS12.0分析。
7.FOs对体内S180肉瘤生长的影响
表4FOs对小鼠移植瘤S180抑制作用
如表4所示，S180荷瘤小鼠经FOs喂养后，FOs各剂量组随着给药剂量的增加，荷瘤小 鼠的增重率逐步下降，但增重率均高于模型对照组；阳性对照5-FU组的增重率显著低于其它 各组。
FOs对S180肉瘤的生长具有一定的抑制作用，且随着剂量的增加，抑瘤率逐渐上升，但 抑瘤率均低于阳性对照5-FU组。FOs的250mg/kg剂量组小鼠瘤重与阳性对照组无显著差 异，表明250mg/kg的FOs抑制肉瘤生长的作用与5-FU相当，抑瘤率达到44.55％。
8.FOs对荷瘤小鼠免疫器官的影响
表5FOs对S180小鼠内脏指数的影响
由表5可知，荷瘤小鼠脾脏指数除5-FU组外均高于正常对照组，与模型对照组相比， FOs组在剂量达到100mg/kg后，脾脏指数均低于模型对照，向正常对照组接近。与阳性对 照组相比，FOs各剂量组的脾脏指数均显著高于其。
研究结果表明，所有荷瘤组胸腺指数均低于正常对照组，随着给药剂量的增加，胸腺指 数也随之提高，100、250mg/kg剂量组的FOs与正常对照组差异不显著，FOs表现出了较好 的免疫调节作用；阳性对照组的胸腺指数则显著低于各组的，胸腺出现明显萎缩。
9.FOs对细胞因子的影响
表6FOs对1FN-γ和IL-3产生的影响
表6的研究结果表明，FOs各剂量组喂养后，使S180荷瘤小鼠体内IFN-γ含量均高于模 型对照组，当剂量达到100mg/kg后，均显著高于模型对照组，表明FOs可促进S180荷瘤小 鼠机体免疫功能提高；模型对照组、阳性对照5-FU组小鼠体内IFN-γ均显著低于正常水平， 而当FOs的剂量达到250mg/kg，荷瘤小鼠体内的IFN-γ含量与正常小鼠的差异不显著，接 近正常水平，且显著高于阳性对照组，表明FOs具有较好的免疫调节作用。
当FOs的喂养剂量达到250mg/kg，荷瘤小鼠体内IL-3含量均显著高于空白对照组，达到 100mg/kg，均显著高于模型对照组；当喂养剂量达到250mg/kg，而FOs组显著高于阳性对 照，表明FOs具有较佳的促进脾细胞生成IL-3的作用。
综上所述，由药效学实验结果表明本发明提供的阿魏酰低聚糖具有抗肿瘤及免疫增强活 性。