发明背景
本发明提供雷帕霉素类似物及其治疗神经紊乱、增殖性和炎性 疾病的用途。
每年约700,000名美国人发生局部缺血性中风，占所有中风病例 83％(其余17％为出血型)，约等于每45秒发生1起中风病例。由于 向脑供血的血管内梗阻，导致发生局部缺血性中风。产生这种梗阻 的条件是沿着血管壁形成脂肪沉淀，称为动脉粥样硬化。这些脂肪 沉淀可造成两种梗阻：1)脑血栓，是指在血管的阻塞部分形成的血 栓(血凝块)，2)脑栓塞，通常是指在循环系统中的另一部位，通常 心脏和上胸及颈的大动脉中形成血凝块。一部分血凝块破碎脱落， 进入血流并通过脑血管游走，直至到达太小以致不允许其通过的血 管。目前治疗局部缺血性中风的疗法有限。迄今为止，治疗局部缺 血性中风的唯一批准的药物是重组组织纤溶酶原激活物(rt-PA)。起溶 栓剂作用的rt-PA的机会治疗窗有限(3小时)，因此，仅可使所有中 风患者中的1-2％接受治疗。尚无治疗局部缺血性中风的神经保护剂 上市。
帕金森氏病(PD)是神经变性疾病，其特征在于黑质的多巴胺能 (DAergic)神经元选择性变性。PD是进行性疾病，尽管15％患者的确 诊年龄在50岁以前，但平均发病年龄为55岁。据估计，1.5百万美 国人患有PD。PD的某些典型体征为在身体的一侧出现静止震颤、 全身活动迟钝(运动徐缓)、肢体强直(僵化)、步态或平衡问题(体位功 能障碍)。目前PD药物治疗症状，但尚无预防或延迟Daergic神经元 变性的药物。
由于它们的临床重要性，所以人们在积极寻找明确显示出神经 保护和/或神经再生的原型分子。神经营养蛋白是在临床前神经变性 模型中具有非凡治疗性质的蛋白质家族。尽管实验前景看好，但神 经营养蛋白的临床开发遇到严重障碍和挫折，例如无法将这些大蛋 白递送至神经元的靶群体上，这些蛋白不稳定和非特异性活性。
本领域需要可用于治疗神经紊乱、增殖性和炎性疾病的其它化 合物。
发明概述
在一个方面，本发明提供可用于治疗神经紊乱、增殖和炎性疾 病和用于制备可用于治疗此类疾病的药物的新化合物。
在另一个方面，本发明提供新的神经保护、抗增殖和抗炎药物。
在进一步的方面，本发明提供可用于治疗良性或恶性肿瘤疾病、 癌和腺癌以及用于制备可用于治疗此类疾病的药物的新化合物。
在另一个方面，本发明提供可用于治疗炎性疾病和用于制备可 用于治疗该疾病的药物的新化合物，所述炎性疾病包括但不限于自 身免疫性疾病(例如狼疮)、皮肤炎症、炎性肠道疾病性疾病、哮喘和 特应性疾病；及移植/移植物排斥。
在又一方面，本发明提供雷帕霉素类似物及其药学上可接受的 盐、前药和代谢物。
在另一个方面，本发明提供制备雷帕霉素类似物的方法。
在进一步的方面，本发明提供治疗神经紊乱、增殖疾病、心血 管和炎性疾病的方法。
在再一方面，本发明提供治疗中风或头部创伤引起的并发症的 方法。
在又一方面，本发明提供治疗良性或恶性肿瘤疾病、癌和腺癌 的方法。
在再一方面，本发明提供治疗炎性疾病的方法，所述炎性疾病 包括但不限于自身免疫性疾病(例如狼疮)、皮肤炎症、炎性肠道疾病 性疾病、哮喘和特应性疾病；及移植/移植物排斥。
在另一个方面，本发明提供涂布或浸透本发明化合物的斯滕特 氏血管支架(stent)或分流装置(shunt)。
在以下优选的实施方案的详细说明书中，进一步阐述本发明的 其它方面和优势。
附图简述
附图1提供实施例1化合物的核磁共振(NMR)谱。用400MHz 分光计，在d3-乙腈中得到NMR谱。
附图2提供实施例2化合物的NMR谱。用400MHz分光计， 在d3-乙腈中得到NMR谱。
附图3提供实施例3化合物的NMR谱。用400MHz分光计， 在d3-乙腈中得到NMR谱。
附图4提供实施例4化合物的NMR谱。用400MHz分光计， 在d3-乙腈中得到NMR谱。
附图5提供实施例5化合物的NMR谱。用400MHz分光计， 在d3-乙腈中得到NMR谱。
附图6提供实施例6化合物的NMR谱。用400MHz分光计， 在d3-乙腈中得到NMR谱。
发明详述
本发明提供可用作神经保护、抗增殖和/或抗炎药物的新的雷帕 霉素类似物。这些新的雷帕霉素类似物在雷帕霉素骨架上的1和4 位具有杂原子取代基。在另一个实施方案中，本发明提供在雷帕霉 素骨架的1、2、3和/或4位上具有环结构的雷帕霉素类似物。
本发明的这些新化合物可在用于治疗神经紊乱的组合物中用作 神经保护剂。包括例如神经变性或神经肌肉变性病症在内的神经紊 乱可以是出生时存在的遗传病结果；在个体终生期间发展的病症， 例如中风和/或物理创伤例如头、脊髓损伤或外周神经系统损伤的结 果。
因此，本发明化合物可用于缓解神经紊乱前已存在的症状，或 防止神经和/或神经肌肉进一步变性。在某些实施方案中，可用本发 明的神经保护剂延迟与神经紊乱有关的症状发作。
本发明的新化合物还可用作抗增殖和抗炎药物，因而可用于治 疗炎性疾病，它们包括自身免疫疾病、关节炎症、皮肤炎症、炎性 肠道疾病、哮喘和特应性疾病，以及移植/移植物排斥。
出乎意料地发现，至少两个本发明化合物，例如9，27-二羟基-3- {2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基- 6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧(epoxy)-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十 一碳因(hentriacontine)-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮(pentone)和37-(4-氯- 3-甲基苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙 基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基 -，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一碳因 (hentriacontine)-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮具有抗增殖和免疫抑制活 性。
I.本发明化合物
本发明提供式I的雷帕霉素类似物或其药学上可接受的盐、前 药或代谢物：
在上述式中，R1和R2是不同的独立基团，各自选自OR3和 N(R3’)(R3″)，或R1和R2不同，它们通过单键连接，各自选自O和NR3。 R3、R3’和R3”独立选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C3-C8环 烷基、取代的C3-C8环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂 芳基。R4和R4′：(a)独立选自H、OH、O(C1-C6烷基)、O(取代的C1- C6烷基)、O(酰基)、O(芳基)、O(取代的芳基)和卤素；或(b)结合在一 起形成连接O的双键。R5、R6和R7独立选自H、OH和OCH3。R8和R9：(i)通过单键连接且为CH2，或(ii)通过双键连接且为CH。R15选自C＝O、CHOH和CH2，n为1或2。
在进一步的实施方案中，R1和R2通过单键连接，且选自O和 NR3。在更进一步的实施方案中，R1为O，R2为NR3。
在一个实施方案中，R3’或R3”是芳基或取代的芳基，或取代的苯 环。在另一个实施方案中，在R3’或R3”上的取代的苯基包括以下环结 构：
R10、R11、R12、R13和R14独立选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、酰基、OH、 O(烷基)、O(取代的烷基)、O(芳基)、O(取代的芳基)、O(酰基)、NH2、 NH(烷基)、NH(取代的烷基)、NH(芳基)、NH(取代的芳基)和NH(酰 基)。
在进一步的实施方案中，R3、R3′或R3″是被1或2个取代基任选 取代的苯基，所述取代基选自C1-C6烷基和卤素。在更进一步的实施 方案中，R3、R3′或R3″是被1或2个甲基或氯取代基任选取代的苯基， 例如为苯基和3-甲基、4-氯苯基。
在一个实施方案中，R4或R4’为OH或O(酰基)，例如其中酰基 为-C(O)-任选取代的烷基，尤其其中烷基可为直链或支链，并被例如 杂环例如芳杂环例如吡啶基任选取代。实例是：
在其它的实施方案中，式I的雷帕霉素类似物包括其中R5、R6和R7为OCH3的那些；其中在雷帕霉素骨架的17-22位上的含氮环 是哌啶环，或其中R15是羰基的那些类似物。
在一个实施方案中，本发明提供下式Ia化合物：
其中R1、R2、R8和R9定义同上。
在另一个实施方案中，本发明提供下式Ib化合物：
在式Ib中，R独立选自H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、芳 基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤素、酰基、OH、O(烷 基)、O(取代的烷基)、O(芳基)、O(取代的芳基)、O(酰基)、NH2、NH(烷 基)、NH(取代的烷基)、NH(芳基)、NH(取代的芳基)和NH(酰基)，m 为1-5。
本发明特殊化合物在本文中说明，它们包括
1)9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二 甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一 碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮；
2)9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二 甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基- 4，9，10，12，13，14，15，16，17，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-二十 一氢(henicosahydro)-3H-23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1- c][1，4]氧氮杂环三十一碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮；
3)37-(4-氯-3-甲基苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]- 1-甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一 碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮；
4)37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲 基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一 碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮；
5)9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21-二 甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一 碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮与-2，2-二甲基-3-(吡啶-2-基)-丙酸 形成的酯；
6)37-(2，6-二氯苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1- 甲基乙基}-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一 碳因-1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮；
或其药学上可接受的盐、前药或代谢物。本发明不限于这些示例性 化合物。
在另一个实施方案中，特殊化合物包括以下：
本发明还提供其中R1和R2通过单键连接；R1为O；R2为NR3； R3为苯基；R4为OH；R5-R7为OCH3；R8和R9为HC＝CH的化合物； 其中R1为OR3；R2为N(R3’)(R3”)；R3为H；R3′为H；R3”为苯基；R4为OH；R5-R7为OCH3；R8和R9为H2C-CH2的化合物；其中R1和R2通过单键连接；R1为O；R2为NR3；R3为苯基；R4为OH；R5-R7为 OCH3；R8和R9为H2C-CH2的化合物；其中R1和R2通过单键连接； R1为O；R2为NR3；R4为OH；R5-R7为OCH3；R8和R9为HC＝CH； 和R3为下式的化合物：
其中R1和R2通过单键连接；R1为O；R2为NR3；R4为OH；R5-R7为OCH3；R8和R9为HC＝CH；和R3为下式的化合物：
其中R1和R2通过单键连接；R1为O；R2为NR3；R3为苯基；R5-R7为OCH3；R8和R9为HC＝CH；和R4为下式的化合物：
其中R1和R2通过单键连接；R1为O；R2为NR3；R4为OH；R5-R7为OCH3；R8和R9为H2C-CH2；和R3为下式的化合物
本发明化合物可含有一个和多个不对称碳原子，且某些化合物 可含有一个或多个不对称(手性)中心，因此可产生旋光异构体和非对 映体。虽然所示结构未涉及立体化学，但当化合物可含有一个和多 个手性中心时，优选至少一个此类手性中心具有S立体化学。因此， 本发明包括此类旋光异构体和非对映体；以及外消旋的和拆分的对 映体纯的立体异构体；以及R和S立体异构体的其它混合物；及其 药学上可接受的盐、水合物、代谢物和前药。
本文中使用的术语“烷基”是指具有1-10个碳原子，优选约1- 8个碳原子的直链和支链饱和脂烃基。本文中使用的术语“链烯基” 是指具有一个和多个碳-碳双键并含有约2-10个碳原子的直链和支链 烷基。在一个实施方案中，术语链烯基是指具有1或2个碳-碳双键 并具有2-约6个碳原子的烷基。本文中使用的术语“炔基”是指具 有一个或多个碳-碳三键并具有2-8个碳原子的直链或支链烷基。在 一个实施方案中，术语炔基是指具有1或2个碳-碳三键并具有2-6 个碳原子的烷基。
本文中使用的术语“环烷基”是指环状结构的前述烷基，并具 有约4-10个碳原子，或约5-8个碳原子。
术语“取代的烷基”、“取代的链烯基”和“取代的炔基”分 别是指具有一个或多个取代基的烷基、链烯基和炔基，所述取代基 包括但不限于卤素、CN、OH、NO2、氨基、芳基、杂环基、烷氧基、 芳氧基、烷基羰基、烷基羧基和芳硫基，这些基团可被例如1-4个取 代基任选取代，这些取代基包括卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、 环烷基、链烯基、炔基、烷氧基(alkoxy)、芳氧基、烷基氧基(alkyloxy)、 烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳硫基。这些基团可被任选取代。 这些取代基可与烷基、链烯基或炔基的任何碳连接，前提是所述连 接构成稳定的化学部分。
本文中使用的术语“芳基”是指例如6-20个碳原子的芳族系统， 它可包括单环或稠和或结合在一起的多环(例如2或3个)，其中稠和 或连接的环的至少一部分形成共轭芳族系统。芳基可包括但不限于 苯基、萘基、联苯基、蒽基、四氢化萘基、菲基、茚、苯并萘基 (benzonaphthyl)、芴基和咔唑基。
术语“取代的芳基”是指被一个和多个取代基取代的芳基，所 述取代基包括但不限于卤素、CN、OH、NO2、氨基、烷基、环烷基、 链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基羰基、烷基羧基、 氨基烷基和芳硫基，这些基团可被任选取代。在一个实施方案中， 取代的芳基被1-4个取代基取代，所述取代基包括卤素、CN、OH、 NO2、氨基、烷基、环烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基 氧基、烷基羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳硫基。
本文中使用的术语“杂环基”是指饱和、部分不饱和或完全不 饱和的稳定的4-7元单环或多环杂环，它们包括芳基例如吡啶基。所 述杂环具有碳原子和一个和多个包括氮、氧和硫原子在内的杂原子。 在一个实施方案中，杂环骨架上有1-4个杂原子。当杂环在该环骨架 含有氮或硫原子时，该氮或硫原子可被氧化。术语“杂环基”还指 例如9-20个环成员的多环，其中杂环与芳环稠和。杂环可通过杂原 子或碳原子与芳环连接，前提是生成的杂环结构是化学上稳定的。
本领域中已知多种杂环，它们包括但不限于含氧环、含氮环、 含硫环、含混合杂原子的环、含稠和杂原子的环及其组合。含氧环 包括但不限于呋喃基、四氢呋喃基、吡喃基、吡喃酮基和二噁英基 (dioxinyl)环。含氮环包括但不限于吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑 基、吡啶基、哌啶基、2-氧代哌啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌 嗪基、氮杂基、三嗪基、吡咯烷基和氮杂基环。含硫环包括但不 限于噻吩基和二硫杂环戊烯基(dithiolyl)环。含混合杂原子的环包括 但不限于氧硫杂环戊烯基(oxathiolyl)、噁唑基、噻唑基、噻二唑基、 噁三唑基、二噁唑基、噁噻唑基(oxathiazolyl)、氧硫杂环戊烯基、噁 嗪基、噁噻嗪基(oxathiazinyl)、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、 噁庚英基(oxepinyl)、噻庚英基(thiepinyl)和二氮杂基环。含稠和杂 原子的环包括但不限于苯并呋喃基、硫茚、吲哚基、benazazolyl、 purindinyl、吡喃并吡咯基、异吲唑基、吲哚噁嗪基(indoxazinyl)、苯 并噁唑基、氨茴基(anthranilyl)、苯并吡喃基、喹啉基、异喹啉基、 benzodiazonyl、萘啶基(naphthylridinyl)、苯并噻吩基、吡啶并吡啶基、 苯并噁嗪基、呫吨基、吖啶基和嘌呤基环。
本文中使用的术语“取代的杂环基”是指具有一个和多个取代 基的杂环基，所述取代基包括但不限于卤素、CN、OH、NO2、氨基、 烷基、环烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳氧基、烷基氧基、烷基 羰基、烷基羧基、氨基烷基和芳硫基，这些基团可被任选取代。在 一个实施方案中，取代的杂环基被1-4个取代基取代。
术语“酰基”是指在碳原子上被取代的-C(O)-基团。酰基可被取 代，或为末端酰基例如HC(O)-基团。取代基可包括任何上述烷基的 取代基，即包括但不限于以下一种或多种取代基：卤素、CN、OH、 NO2、氨基、芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、烷基羰基、烷基羧基 和芳硫基，这些基团可被任选取代。实例包括-C(O)-烷氧基(例如-OMe 或-OEt)或-C(O)-烷基，其中烷基可以为直链或支链，且被例如杂环 基(例如吡啶基)任选取代。
本文中使用的术语“烷氧基”是指O(烷基)基团，其中连接点通 过氧原子，且烷基被任选取代。
本文中使用的术语“芳氧基”是指O(芳基)基团，其中连接点通 过氧原子，且芳基被任选取代。
本文中使用的术语“烷基氧基”是指烷基OH基团，其中连接 点通过烷基。
本文中使用的术语“芳硫基”是指S(芳基)基团，其中连接点通 过硫原子，且芳基可被任选取代。
本文中使用的术语“烷基羰基”是指C(O)(烷基)基团，其中连 接点通过羰基部分的碳原子，且烷基被任选取代。
本文中使用的术语“烷基羧基”是指C(O)O(烷基)基团，其中连 接点通过羧基部分的碳原子，且烷基被任选取代。
本文中使用的术语“氨基烷基”是指仲和叔胺，其中连接点通 过氮原子，且烷基被任选取代。烷基可以相同和不同。
本文中使用的“卤素”是指Cl、Br、F或I基团。
II.本发明化合物的制备方法
由雷帕霉素原料制备本发明式I的雷帕霉素类似物。优选，雷 帕霉素原料包括但不限于雷帕霉素、降雷帕霉素(norrapamycin)、脱 氧雷帕霉素(deoxorapamycin)、去甲雷帕霉素(desmethylrapamycins)或 去甲氧雷帕霉素(desmethoxyrapamycin)，或其药学上可接受的盐、前 药或代谢物。但是，本领域技术人员可容易地选择合适的可用于制 备本发明新的雷帕霉素类似物的雷帕霉素原料。
术语“去甲雷帕霉素”是指缺少一个或多个甲基的一类雷帕霉 素化合物。可用于本发明的去甲雷帕霉素的实例包括3-去甲雷帕霉 素(美国专利号6,358,969)、7-O-去甲基-雷帕霉素(美国专利号 6,399,626)、17-去甲雷帕霉素(美国专利号6,670,168)和32-O-去甲雷 帕霉素等。
术语“去甲氧雷帕霉素”是指缺少一个或多个甲氧基的一类雷 帕霉素化合物，并包括但不限于32-去甲氧基雷帕霉素。
因此，通过使雷帕霉素原料和亲双烯体结合，制备本发明式I 雷帕霉素类似物。术语“亲双烯体”是指与1，3二烯反应，生成[4+2] 环加成产物的分子。优选用于本发明的亲双烯体是任选取代的亚硝 基苯。多种亚硝基苯可用于本发明，包括亚硝基苯、2，6-二氯亚硝基 苯和1-氯-2-甲基-4-亚硝基苯等。本领域技术人员可容易选择有效制 备本发明雷帕霉素类似物的亚硝基苯的量。优选，使用过量亚硝基 苯，更优选亚硝基苯与雷帕霉素原料的比为5∶1。但是，甚至可使用 1∶1或2∶1或3∶1的亚硝基苯与雷帕霉素原料比，这由本领域技术人 员决定。
使亚硝基苯和雷帕霉素原料在溶剂中结合。优选该溶剂在接触 时溶解亚硝基苯和/或雷帕霉素，或当反应进行时，溶解亚硝基苯和 雷帕霉素。可用于本发明的溶剂包括但不限于二甲酰胺；二噁烷例如 对二噁烷；氯仿；醇例如甲醇和乙醇；乙酸乙酯、水、乙腈、四氢呋 喃、二氯甲烷和甲苯或其组合。但是，本领域技术人员可根据雷帕 霉素原料和亚硝基苯的溶解性和它们与溶剂的反应性，容易选择合 适的溶剂。溶剂的用量取决于反应规模，尤其存在于反应混合物中 的雷帕霉素原料和亚硝基苯的量。本领域技术人员可容易确定需要 的溶剂量。
通常，将含亚硝基苯、雷帕霉素原料和溶剂的溶液保持在高温 下，优选不促使雷帕霉素和亚硝基苯分解的温度下。在一个实施方 案中，将该溶液保持在约30-约70℃，优选约50℃下。加热组分的 时间为足以允许雷帕霉素原料与亚硝基苯反应的时间。在加热期间， 本领域技术人员用已知技术容易监测反应进程，从而确定进行反应 所需时间。在一个优选的实施方案中，将雷帕霉素和亚硝基苯与对 二噁烷混合，并保持在约50℃下。
分离和纯化雷帕霉素类似物的方法是本领域技术人员熟知的， 它们包括但不限于层析法，重结晶；高效液相色谱(HPLC)例如反相 HPLC和正相HPLC；以及尺寸排阻色谱法。
一旦得到雷帕霉素类似物，可将它还原，形成更饱和的雷帕霉 素类似物。本领域技术人员可容易选择用于本发明的合适还原剂。 优选，可用氢化剂还原雷帕霉素类似物。本领域技术人员可容易选 择用于本发明的合适的氢化剂。通常，在氢气存在下，用过渡金属 催化剂或吸附在载体(优选碳载体)上的过渡金属，进行该还原反应。 在优选的实施方案中，在氢气存在下，用披钯金属碳进行还原反应。
通常在溶剂中还原雷帕霉素类似物。在还原反应中，可使用多 种溶剂，它们包括但不限于醇例如甲醇。但是，本领域技术人员可 容易选择用于本发明的合适溶剂，它取决于氢化催化剂和正被还原 的雷帕霉素类似物。溶剂量取决于反应规模，尤其是正被还原的雷 帕霉素类似物的量。
本领域技术人员可容易确定用于本发明的氢化剂的量。但是， 本领域技术人员可容易确定和调整进行还原反应并形成更饱和的本 发明的雷帕霉素类似物所需氢化剂的量。另外，可用多种仪器进行 本发明的氢化反应，它们包括Parr装置等。选择用于该氢化反应的 具体仪器是本领域技术人员所熟知的。
在一个实施方案中，按以下流程1中归纳的方法，制备本发明 的雷帕霉素类似物：
流程1
其中R1、R2、R4、R4’、R6、R7、R15和n定义同上。
可按由药学上或生理上可接受的酸或碱衍生的其药学上可接受 的盐、前药或代谢物的形式，使用本发明的雷帕霉素类似物。这些 盐包括但不限于用以下矿物或无机酸例如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸； 和有机酸例如乙酸、草酸、琥珀酸和马来酸形成的盐。其它盐包括 酯、氨基甲酸酯形式和其它常规“前药”形式的碱金属和碱土金属 例如钠、钾、钙和镁盐，当以这种形式给药时，它们在体内转化为 活性部分。
III.本发明化合物的用法
包括或多或少饱和的雷帕霉素类似物在内的本发明的式I、Ia和 Ib雷帕霉素类似物可用于与神经紊乱(包括神经肌肉障碍)和心血管病 等有关的方面。包括或多或少饱和的雷帕霉素类似物在内的本发明 的式I、Ia和Ib雷帕霉素类似物可用于涉及钙(Ca2+)离子通道功能障 碍例如利阿诺定(ryanodine)受体(RyR1、RyR2和Ryr3)通道病 (channelopathies)，其中包括恶性体温过高(hyperthermia)、中心核病、 cathecolaminergic多形性室性心动过速和导致心律不齐的右心室发育 不良2型(ARVD-2)。包括或多或少饱和的雷帕霉素类似物在内的本 发明的式I、Ia和Ib雷帕霉素类似物还可用于二氢吡啶受体通道病， 它们包括因二氢吡啶-敏感钙离子(Ca2+)通道活性所致利阿诺定受体活 性的那些。本文中使用的术语“通道病”是指涉及离子通道功能障 碍的疾病或病症。
本文中所指疾病和病症在本文中在常规标题下分类，例如神经 紊乱和炎性疾病。本领域技术人员会意识到，本文中所指疾病或病 症可在不同标题下或多标题下适当分类。本发明不受本文中所指疾 病和/或病症的分类限制。
本发明化合物可用于治疗神经紊乱，它们包括但不限于早老性 痴呆；癫痫；杭廷顿氏舞蹈病；帕金森氏病；中风；脊髓损伤；创 伤性脑损伤；雷维小体痴呆；皮克氏病；尼曼-皮克氏病；淀粉样血 管病；淀粉样脑血管病；全身性淀粉样变性；伴有荷兰型淀粉样变 性的遗传性脑出血；包涵体肌炎；轻度认知损害和唐氏综合征；和 神经肌肉病症，它们包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化和肌 肉营养不良，包括杜兴氏肌营养不良、贝克尔氏肌营养不良、面肩 臂(兰杜二氏)肌营养不良和肢带肌营养不良(LGMD)；和用于制备治 疗这些疾病的药物。还可用于治疗中风、头部创伤和脊髓损伤引起 的并发症；或脑、外周神经、中枢神经或神经肌肉系统的其它损伤； 和制备治疗这些疾病的药物。
新的雷帕霉素类似物可用作神经保护剂。本发明的雷帕霉素类 似物也可用作神经再生剂，即在一种以上病症和/或损伤、中风或其 它创伤发作后，恢复某些神经和/或神经肌肉功能或其它功能；和制 备治疗这些疾病的药物。
本发明化合物可用于治疗心血管病，它们包括但不限于：充血 性心力衰竭；导致心律不齐的综合征，包括阵发性心动过速、迟发 性后去极化、室性心动过速、突发性心动过速、运动引起的心律不 齐、QT间期延长综合征和双向心动过速(bidirectional tachycardia)； 血栓栓塞病，包括动脉心血管血栓栓塞病、静脉心血管血栓栓塞病 和心室血栓栓塞病；动脉粥样硬化；再狭窄；外周动脉病；冠脉分 流搭桥术(bypass grafting surgery)；颈动脉病；动脉炎；心肌炎；心 血管炎；血管炎；冠心病(CHD)；不稳定性心绞痛(UA)；不稳定性顽 固性心绞痛；稳定性心绞痛(SA)；慢性稳定性心绞痛；急性冠脉综合 征(ACS)；首次或复发性心肌梗塞；急性心肌梗塞(AMI)；心肌梗塞； 非Q波心肌梗塞；非-STE心肌梗塞；冠状动脉病；局部缺血性心脏 病；心肌缺血；局部缺血；局部缺血性猝死；一过性局部缺血发作； 中风；周围闭塞性动脉病；静脉血栓形成；深静脉血栓形成；血栓 静脉炎；动脉栓塞；冠状动脉血栓形成；脑动脉血栓形成；脑栓塞； 肾栓塞；肺栓塞；由以下导致的血栓形成：(a)修复瓣膜或其它移植 物，(b)流置导管，(c)斯滕特氏血管支架，(d)心肺分流术，(e)血透析， 或(f)其中血暴露于促使血栓形成的人工装置表面的其它手术；动脉 粥样硬化、手术或手术并发症、长时间固定术、动脉纤颤、先天性 血栓形成倾向、癌症、糖尿病、药物或激素作用和怀孕并发症引起 的血栓形成；心律不齐，包括室上性心律不齐、心房心律不齐、心 房扑动、心房纤维性颤动；在Heart Disease：A Textbook of Cardiovascular Medicine，2 Volume Set，6th Edition，2001，Eugene Braunwald，Douglas P.Zipes，Peter Libby，Douglas D.Zipes中列举的其 它疾病；和用于制备治疗这些疾病的药物。
在进一步的实施方案中，心血管病是：动脉粥样硬化；冠心病 (CHD)；再狭窄(restensosis)；外周动脉病；冠脉分流搭桥术；颈动脉 病；动脉炎；心肌炎；心血管炎；血管炎；不稳定性心绞痛(UA)； 不稳定性顽固性心绞痛；稳定性心绞痛(SA)；慢性稳定性心绞痛；急 性冠脉综合征(ACS)；心肌梗塞；或急性心肌梗塞(AMI)，包括首次 或复发性心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、非ST段抬高型心肌梗塞和ST 段抬高型心肌梗塞。
在更进一步的实施方案中，心血管病是：动脉粥样硬化；冠心 病(CHD)；不稳定性心绞痛(UA)；不稳定性顽固性心绞痛；稳定性心 绞痛(SA)；慢性稳定性心绞痛；急性冠脉综合征(ACS)；心肌梗塞； 或急性心肌梗塞(AMI)，包括首次或复发心肌梗塞、非Q波心肌梗塞、 非ST段抬高型心肌梗塞和ST段抬高型心肌梗塞。
还证实本发明的式I、Ia和Ib雷帕霉素类似物具有免疫抑制活 性，因而可用作治疗炎性疾病的抗炎药物，所述炎性疾病包括但不 限于自身免疫疾病(例如狼疮)、皮肤炎症、炎性肠道疾病、哮喘和特 应性疾病；和移植/移植物排斥。因此，雷帕霉素类似物可用于治疗 炎性疾病；并用于制备治疗这些疾病的药物；炎性疾病包括但不限 于自身免疫疾病例如全身性红斑狼疮(SLE)、关节炎症(例如风湿性关 节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎、强硬性椎关节炎)、糖尿病(1型)、 多发性硬化、重症肌无力、血管炎；皮肤炎症(例如牛皮癣、皮炎和 硬皮病)；炎性肠道疾病(例如炎性肠疾病(IBD)、节段性回肠炎和溃 疡性结肠炎)；哮喘和特应性疾病(例如过敏)；和移植/移植物排斥及 移植物对宿主疾病。
这些式I、Ia和Ib化合物也可用于治疗和预防良性或恶性肿瘤 疾病或癌和腺癌；和用于制备治疗这些疾病的药物。一个这样的化 合物是9，27-二羟基-3-{2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21- 二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-37-苯基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一碳因 -1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮。另一个这样的化合物是37-(4-氯-3-甲基 苯基)-9，27-二羟基-3-{-2-[4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-10，21- 二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基- 4，9，10，12，13，14，15，18，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十九氢-3H- 23，27-环氧-18，15-(环氧亚氨基)吡啶并[2，1-c][1，4]氧氮杂环三十一碳因 -1，5，11，28，29(6H，31H)-五酮。可按照本发明治疗的癌和腺癌包括但不 限于子宫内膜、卵巢、乳腺、结肠、肾、前列腺、垂体的癌或腺癌、 脑膜瘤和其它依赖激素的瘤。
本发明雷帕霉素类似物的剂量要求可根据所治疗的具体患者、 其病症、出现症状的严重程度而定。本领域技术人员可容易确定所 需雷帕霉素类似物的量。在一个实施方案中，给予约0.5-200mg。在 进一步的实施方案中，给予约0.5-100mg。在另一个实施方案中，给 予约0.5-约75mg。在更进一步的实施方案中，给予约1-约25mg。 在另一个实施方案中，给予约0.5-约10mg，尤其与另一种药物联用 时。在更进一步的实施方案中，给予约2-约5mg。在又另一个实施 方案中，给予约5-约15mg。治疗开始时，给予雷帕霉素类似物的剂 量小于产生需要的作用所需的那些剂量，通常小于雷帕霉素类似物 的最适宜剂量。之后，可增加剂量直至在患者环境中达到最佳效果。 确切的剂量由给药医师根据对所治疗的患者个体的经验决定。一般 而言，最适宜给予通常提供有效结果而不造成任何有害或不利副作 用的浓度的本发明组合物。
IV.制备含雷帕霉素类似物的可给药组合物的方法
在一个方面，本发明包括制备含一种和多种本发明雷帕霉素类 似物的药用组合物的方法。本文中使用的含本发明的“雷帕霉素类 似物”的组合物应包括含一种和多种本发明雷帕霉素类似物的组合 物。可通过几种不同途径给予哺乳动物患者固体或液体形式的该组 合物，通过口服给药为宜。
可通过使雷帕霉素类似物和一种或多种上述成分混合，形成含 有雷帕霉素类似物的固体形式，该形式包括片剂、胶囊剂和胶囊形 片剂。在一个实施方案中，用干法或湿法混合组合物中的组分。在 另一个实施方案中，用干法将组分制粒。在进一步的实施方案中， 将组分悬浮或溶于液体，并加入适宜给予哺乳动物患者的形式中。
可通过将雷帕霉素类似物溶于或悬浮于适宜给予哺乳动物患者 的液体中，形成含雷帕霉素类似物的液体形式。
可按照本发明，通过使雷帕霉素类似物和药学上可接受的载体 混合，制备含本发明的雷帕霉素类似物的组合物。
可按任何适合需要的递药途径形式，用药学上有效量的雷帕霉 素类似物配制本文中所述含雷帕霉素类似物的组合物。例如，可通 过诸如口服、皮、透皮、支气管内、鼻内、静脉内、肌内、皮下、 肠胃外、腹膜内、鼻内、阴道、直肠、舌下、颅内、硬膜外、气管 内的途径或通过缓释给予本发明组合物。在一个实施方案中，递药 为口服。
也可用本发明的口服剂量片剂组合物制备含雷帕霉素类似物类 似物的口服剂量片剂，此类类似物包括但不限于本领域技术人员已 知的酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、醚、肟、碳酸酯等。
雷帕霉素类似物的药学上的有效量可根据组合物中的具体化合 物、递药模式、所治疗病症的严重程度和使用的任何其它活性成分 而变化。也可调整给药方案，以便提供最佳治疗反应。可每日给予 几次分剂量，例如每日2-4次分剂量，或可给予单一剂量。但可根据 治疗情况的缓急程度，按比例减少和增加剂量。在一个实施方案中， 递药按每日一次、每周一次和每月一次实施。在另一个实施方案中， 递药为每日一次。但是，可根据给药的疗程，减少和增加日剂量。
本发明的雷帕霉素类似物可与一种或多种药学上可接受载体或 赋型剂混合，它们包括但不限于与本发明组合物配伍的固体和液体 载体。此类载体包括佐剂、糖浆、酏剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、 表面活性剂、制粒剂、崩解剂、软化剂、金属鳌合剂、pH调节剂、 表面活性剂、填充剂、崩解剂及其组合等。在一个实施方案中，使 雷帕霉素类似物与金属鳌合剂、pH调节剂、表面活性剂、填充剂、 崩解剂、润滑剂和粘合剂混合。
佐剂可包括但不限于矫味剂、着色剂、防腐剂和补充抗氧剂， 该抗氧基可包括维生素E、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)和丁羟茴醚 (BHA)。
粘合剂可包括但不限于纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、 羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、邻苯二甲酸羟 丙基甲基纤维素、微晶纤维素、非结晶性纤维素、聚丙基吡咯烷酮、 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、阿拉伯树胶和阿拉伯胶、聚乙二醇、 淀粉；糖例如蔗糖；高岭土；葡萄糖和乳糖；胆固醇、黄蓍胶、硬 脂酸、明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、十六醇十八醇混合物、鲸蜡醇、 十六烷基酯蜡、葡萄糖结合剂、糊精、单油酸甘油酯、单硬脂酸甘 油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍 生物、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚乙烯醇和明胶等。在一个实施方案中， 粘合剂是聚维酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素或明胶。在另 一个实施方案中，粘合剂是聚维酮。
润滑剂可包括硬脂酸镁、轻质无水硅酸、滑石粉、硬脂酸、十 二烷基硫酸钠和硬脂酰富马酸钠等。在一个实施方案中，润滑剂是 硬脂酸镁、硬脂酸或硬脂酰富马酸钠。在另一个实施方案中，润滑 剂是硬脂酸镁。
制粒剂可包括但不限于二氧化硅、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、 果胶、交联聚维酮(crospovidone)和聚乙烯吡啶咯烷酮(polyplasdone) 等。
崩解剂可包括交联羧甲基纤维素钠、淀粉、羧甲基纤维素、取 代的羟丙基纤维素、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙、淀粉羟乙酸钠、 预胶化淀粉或交联聚维酮等。在一个实施方案中，崩解剂是交联羧 甲基纤维素钠。
软化剂可包括但不限于硬脂醇、貂油、鲸蜡醇、油醇、月桂酸 异丙酯、聚乙二醇、橄榄油、凡士林、棕榈酸、油酸和肉豆蔻酸肉 豆蔻酯。
表面活性剂可包括吐温、山梨坦酯、泊洛沙姆或十二烷基硫酸 钠。在一个实施方案中，表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
金属鳌合剂可包括生理学上可接受的鳌合剂，它们包括依地酸、 苹果酸或富马酸。在一个实施方案中，金属鳌合剂是依地酸。
pH调节剂也可用于调节含雷帕霉素类似物的溶液的pH至约4- 约6。在一个实施方案中，将含雷帕霉素类似物的溶液的pH调至约 4.6pH。pH调节剂可包括生理学上可接受的物质，它们包括柠檬酸、 抗坏血酸、富马酸或苹果酸及其盐。在一个实施方案中，pH调节剂 是柠檬酸。
可按照本发明使用的填充剂包括无水乳糖、微晶纤维素、甘露 醇、磷酸钙、预胶化淀粉或蔗糖。在一个实施方案中，填充剂是无 水乳糖。在另一个实施方案中，填充剂是微晶纤维素。
在一个实施方案中，通过片剂、胶囊形片剂或胶囊剂、微囊剂、 可分散散剂、颗粒剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂和气雾剂，口服递送 含本发明的雷帕霉素类似物的组合物。优选，当通过口服递送含雷 帕霉素类似物的组合物时，通过片剂和硬胶囊或灌装液体的胶囊实 施递药。
在另一个实施方案中，可通过静脉内、肌内、皮下、肠胃外和 腹膜内途径，以无菌注射溶液、混悬液和具有易于注射器推出(exits) 的流动性粉末的形式，递送内含雷帕霉素类似物的组合物。此类注 射组合物是无菌的，在制备和储存条件下稳定、无微生物例如细菌 和真菌的污染作用。
在进一步的实施方案中，可按常规栓剂形式，通过直肠递送含 雷帕霉素类似物的组合物。
在另一个实施方案中，可按常规栓剂、软膏剂、凝胶剂、环或 涂层子宫内装置(coated intrauterine device)(IUD)，递送含雷帕霉素类 似物的组合物。
在另一个实施方案中，可通过涂层或浸透的支撑结构递送含有 雷帕霉素类似物的组合物，所述支撑结构即为可含有载荷药学上可 接受的载体或含本发明化合物的赋型剂的框架，该框架例如为斯滕 特氏血管支架或分流装置；冠脉斯滕特氏支架、外周血管斯滕特氏 支架、导管、动脉-静脉移植物、分流移植物和用于血管系统的递药 气囊。在一个实施方案中，适合使用的涂层包括但不限于由本发明 化合物基本上可溶解于其中的任何聚合物组成的聚合物涂层。支撑 结构和涂层和浸透方法例如在美国专利号6,890,546中所述那些方法 为本领域技术人员所知，且不受本发明的限制。
在又一个实施方案中，可以以气雾剂形式，通过鼻内或支气管 内途径递送含雷帕霉素类似物的组合物。
通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给予雷帕霉素类似物。固 体载体包括淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和高岭土， 而液体载体包括无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂；和食用 油例如玉米、花生和芝麻油，但它们必须与活性成分的性质和需要 给药的具体形式相适宜。最好，包含用于制备药用组合物的常用佐 剂，例如矫味剂、着色剂、防腐剂；和抗氧基例如维生素E、抗坏血 酸、BHT和BHA。
从便于制备和给药方面考虑，优选的药用组合物为固体组合物， 尤其是片剂和填充的硬胶囊剂或液体灌装的胶囊剂。优选口服给药 组合物。
也可肠胃外或腹膜内给予雷帕霉素类似物。用适宜与表面活性 剂例如羟丙基纤维素混合的水制备这些活性化合物的游离碱或生理 学上可接受的盐的溶液或混悬液。也可用甘油、液体、聚乙二醇及 其在油中的混合物制备分散液。在普通储存和使用条件下，这些制 剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适宜注射用的药剂形式包括无菌水溶液或分散液和用于临用时 制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式为无 菌的并具有便于注射器推出的流动性。它在制备和储存条件稳定， 并在抗微生物例如细菌和真菌的污染作用下保存。载体为或含例如 水、醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、其适宜的混合物和植物 油的溶剂或分散溶媒。
V.本发明的药剂盒
本发明还提供含雷帕霉素类似物的药剂盒或包装物。本发明的 药剂盒可包含本发明的雷帕霉素类似物和适宜给予哺乳动物患者的 上述载体。此类药剂盒还可含有制备本发明的雷帕霉素类似物的所 需试剂，它们包括雷帕霉素、任选取代的烯烃和溶剂。
药剂盒可任选包括形成其它雷帕霉素类似物的其它试剂，并包 含氢化剂。
药剂盒还可包括实施本发明反应的说明书。药剂盒还提供其它 适宜的化学品、一次性手套、去污染说明书、涂药棒和样品介体 (preparator)杯。
提供以下实施例说明本发明，但它们不限制其范围。本领域技 术人员会意识到，尽管在以下实施例中概括了具体试剂和条件，但 可在本发明精神和范围内进行改进。
实施例
实施例1
表1提供通过以下两种备选路线制备的化合物的质谱(MS)数 据，图1提供其核磁共振(NMR)谱。
表1
中性质量理论值：1020.59226
A.路线1
将雷帕霉素(2.5g，2.73mmol)溶于200mL对二氧六环。向该溶 液中滴加亚硝基苯(1.50g，5当量)的对二氧六环200mL溶液。将反 应物在50℃下搅拌64小时，然后产物通过反相高效液相色谱(HPLC) (柱：200×50mm YMC ODS-A，流动相：80％甲醇∶水，梯度流速从10 mL/min-35mL/min，持续10分钟，然后保持在35mL/min，再持续 65分钟)层析纯化，得到1.22g产物(44％得率，tR＝12.1min，分析型 HPLC条件：柱＝YMC ODS-A S-3 120，流动相/梯度：95％水(+ 0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)-5％水，持续6分钟，保持在5％， 持续9分钟，流速＝0.30mL/min)。
B.路线2-备选路线
和缓加热下，将雷帕霉素(0.3g，0.328mmol)溶于5mL甲苯。向 该溶液中滴加亚硝基苯(0.1g，3当量)的5mL甲苯溶液。将反应混合 物在70℃下搅拌16小时，然后产物通过反相高效液相色谱(HPLC)(柱： 250×20mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：80-85％甲醇∶水， 持续40分钟，流速＝20mL/min)层析纯化，得到0.139g产物(42％得 率，tR＝12.1min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-A S-3 120，流 动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)-5％水，持续6 分钟，保持在5％，持续9分钟，流速＝0.30mL/min)。
实施例2
表2提供通过以下两种不同路线制备的化合物的质谱(MS)数 据，图2提供其核磁共振(NMR)谱。
A.路线1
在18mm试管中，将按实施例1制备的化合物(0.29g，0.284mmol) 溶于7mL甲醇，加入一匙突尖的Pd/C催化剂(Aldrich)。在2.0H2气 压下，将混合物在Parr仪上氢化15分钟。产物通过反相HPLC(柱：250 ×20mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：80％甲醇∶水，持续15 分钟，然后至85％，持续5分钟，然后保持在85％，持续20分钟、 流速＝20mL/min)层析纯化，得到0.089g产物(31％得率，tR＝12.6 min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-A S-3 120，流动相/梯度： 95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)-5％水，持续6分钟，保持 在5％，持续9分钟，流速＝0.30mL/min)。
B.路线2-备选路线
将按实施例1制备的化合物(9.85g，9.65mmol)溶于50mL甲醇， 加入3匙突尖的Pd/C催化剂(Aldrich)。在2.5H2气压下，将混合物 在Parr仪上氢化2.5小时。产物通过反相HPLC(柱：250×50mm YMC ODS-A，流动相：80％甲醇∶水，持续40分钟，然后至85％，持续5 分钟，然后保持在85％，持续35分钟，流速＝35mL/min)层析纯化， 得到3.35g产物(15％得率，tR＝12.2min，分析型HPLC条件：柱＝ YMC ODS-A S-3 120，流动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈 (+0.025％甲酸)-5％水，持续6分钟，保持在5％，持续9分钟，流速 ＝0.30mL/min)。
表2
中性质量理论值：1022.60791
实施例3
和缓加热下，将雷帕霉素(0.25g，0.274mmol)溶于5mL甲苯。 向该溶液中滴加2，6-二氯亚硝基苯(0.144g，3当量)的7mL甲苯溶液。 将反应混合物在80℃下搅拌36小时，然后产物通过反相HPLC(柱： 250×20mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：80-85％甲醇∶水， 持续40分钟，流速＝20mL/min)层析纯化，得到0.046g产物(15％得 率，tR＝13.0分钟，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-A S-3 120，流 动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)-5％水，持续6 分钟，保持在5％，持续9分钟，流速＝0.30mL/min)。表3提供MS 数据，图3提供NMR谱。
表3
中性质量理论值：1088.51431
实施例4
按实施例3进行该实施例合成，用0.05g雷帕霉素和0.042g 1- 氯-2-甲基-4-亚硝基苯作原料，得到0.012g产物(20％得率，tR＝12.8 min)。表4提供MS数据，图4提供NMR谱。
表4
实测质量 元素式 (估计) 估计质量 Δ (mmu) Δ (ppm) 离子归属 (估计) 1091.55815 C58H85ClN2O14Na1+ 1091.55815 0.00 0.00 [M+Na]1+ 936.54361 C51H79NO13Na1+ 936.54436 -0.75 -0.80 [M+Na]1+-C7H6ClNO
实施例5
在18mm试管中，将实施例3产物(0.046g，0.0422mmol)溶于5 mL甲醇，加入一匙突尖的Pd/C催化剂(Aldrich)。在3H2气压下， 将混合物在Parr仪上氢化60分钟。产物通过反相HPLC(柱：250×20 mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：85％甲醇∶水-90％，持续15 分钟，然后保持在90％，持续25分钟，流速＝20mL/min)层析纯化， 得到0.005g产物(11％得率，tR＝10.0分钟，分析型HPLC条件：柱＝ YMC ODS-A S-3 120，流动相/梯度：95％水(+0.025％甲酸)/乙腈 (+0.025％甲酸)-5％水，持续6分钟，保持在5％，持续9分钟，流速＝ 0.30mL/min)。表5提供MS数据，图5提供NMR谱。
表5
中性质量理论值：1090.52996
实施例6
按实施例3中所述，用0.108g(0.099mmol)2，2-二甲基-3-(吡啶- 2-基)-丙酸雷帕霉素42-酯(按美国专利5,385,908的方法制备)和0.032 g亚硝基苯(0.297mmol，3当量)合成该实施例化合物。将反应物在70 ℃下搅拌40小时，然后产物通过反相HPLC(柱：250×20mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：80-85％甲醇∶水，持续15分钟，然 后至90％甲醇，持续10分钟，然后在90％，持续15分钟，流速＝20 mL/min)层析纯化，得到0.007g产物(6％得率，tR＝13.0分钟)。MS 数据示于表6，图6提供NMR谱。
表6
中性质量理论值：1181.67632
实施例7
在18mm试管中，将按实施例1制备的化合物(0.031g，0.03mmol) 溶于5mL甲醇，加入一匙突尖的Pd/C催化剂(Aldrich)。在2.0H2气 压下，将混合物在Parr仪上氢化30分钟。产物通过反相HPLC(柱：250 ×20mm YMC ODS-A带50×20预柱，流动相：80％甲醇∶水，持续15 分钟，然后至85％，持续5分钟，然后保持在85％，持续20分钟， 流速＝20mL/min)层析纯化，得到0.016g产物(55％得率，tR＝9.95 min，分析型HPLC条件：柱＝YMC ODS-A S-3 120，流动相/梯度： 95％水(+0.025％甲酸)/乙腈(+0.025％甲酸)-5％水，持续6分钟，保持 在5％，持续9分钟，流速＝0.30mL/min)。表7提供MS数据：
实施例8
按Pong等在J.Neurochem.69：986-994，1997中所述，通过引用 全文结合到本文中，制备中脑多巴胺能神经元培养物。收集胚胎第15 日(E15)的大鼠胎鼠并在冰冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中解剖。切除含中 脑多巴胺能区的组织前侧(ventral)部分。将去除的组织部分集中在一 起，并转移至含20IU/mL木瓜蛋白酶的Earle’s平衡盐溶液 (Worthington Biochemical，Freehold，NJ，USA)的酶解离培养基中，在 37℃下温育60分钟。酶解离后，吸去木瓜蛋白酶溶液，在含2,000 IU/mL DNase和10mg/mL卵类粘蛋白蛋白酶抑制剂的完全培养基(补 充0.1mg/mL脱铁运铁蛋白和2.5μg/mL胰岛素的等体积极限必需培 养基(MEM)和F-12营养混合物(GibcoBRL))中，用火灼(fire-polished) 玻璃巴斯德吸管机械研磨组织。
对于多巴胺摄取实验，将单细胞的完全培养基悬浮液接种在聚 L-鸟氨酸和层粘联蛋白涂布的24孔板中。将培养物保存7天，然后 开始实验。用各种浓度的化合物预处理培养物24小时，然后将培养 物暴露在10mM MPP+中，保持1小时。温育1小时后，更换三次 培养基，加入新制备的化合物，再温育48小时。
在暴露于MPP+的中脑多巴胺能神经元培养物生长48小时后， 用Prochiantz在Nature 293：570-572，1981中所述的改良方法，通过 引用结合到本文中，进行高亲和力的3H-多巴胺摄取。用预热的含5.6 mM葡萄糖和1mM抗坏血酸的PBS洗涤培养物。然后，将培养物 和50nM 3H-多巴胺(31Ci/mmol，DuPont-NEN，Wilmington，DE，USA) 在37℃下温育15分钟。用缓冲液洗涤培养物两次，用0.5N NaOH 溶胞。将溶胞产物转移至含Ultima GoldTM闪烁合剂的闪烁瓶中，用 液体闪烁计数器测定放射性。或者，用缓冲液洗涤培养溶胞产物两 次，在室温下，和Optiphase SupermixTM闪烁合剂(Wallac Scintillation Products，Gaithersburg，MD，USA)一起温育2小时，用液体计数器测 量放射性。
按前述(Pong et al.，2001)制备分离的皮质神经元培养物。简言 之，收集胚胎第15日的大鼠胎儿，在冰冷PBS中解剖。将解剖的皮 层集中在一起，转移至含木瓜蛋白酶的酶解离培养基中。30分钟后， 用火灼玻璃巴斯德吸管机械研磨组织。将单细胞的完全培养基悬浮 液接种在聚L-鸟氨酸和层粘联蛋白涂布的96孔板中。24小时后，用 各种浓度的化合物处理培养物72小时。然后固定培养物，用抗微管 蛋白初生抗体(TUJ-1)和荧光标记的次生抗体染色。用Enhanced Neurite Outgrowth(ENO)算法和Cellomics ArrayScan测定神经轴突突 起，按平均神经轴突长度/细胞或总神经轴突长度/细胞表示。
由胚胎第15日(E15)的大鼠胎儿(Sprague-Dawley，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)制备脊髓神经元培养物。收集胚胎，在 不含Ca2+和Mg2+的冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)中摘除它们的脊髓。将 解剖的脊髓组织集中在一起，加入含20IU/mL木瓜酶的Earle’s平衡 盐溶液(Worthington Biochemical，Freehold，NJ)的酶解离培养基中。在 37℃温育30分钟。酶解离后，吸去木瓜蛋白酶溶液，在含2,000IU/mL DNA酶和10mg/mL卵类粘蛋白蛋白酶抑制剂的完全培养基 [Neurobasal培养基+B-27补充培养基(Gibco，Grand Island，NY)，100 IU/mL青霉素，100μg/mL链霉素，3.3μg/mL蚜栖菌素，0.5mM谷氨 酸]中，用火灼玻璃巴斯德吸管机械研磨。以1.0×104细胞/孔密度， 将单细胞在完全培养基中的悬浮液接种在预涂布聚L-鸟氨酸/层粘联 蛋白的96孔板(Becton-Dickinson，Bedford，MA)中。将脊髓神经元保 存24h，然后暴露于溶媒或各种浓度的化合物，保持72h。
在皮层神经元测定中，实施例1-3化合物均有活性，它们的EC50小于1μM。在多巴胺能摄取测定中，实施例1和6化合物均有活性， 它们的EC50小于1μM。在脊髓神经元测定中，实施例1-3和6化合 物均有活性，它们的EC50小于1μM。
经过对比，认为CCI-779和雷帕霉素在皮层神经元测定和多巴 胺能摄取测定中无活性，它们的EC50值大于1μM。雷帕霉素苯基三 唑啉二酮在多巴胺能摄取测定中有活性，其EC50值小于1μM。
实施例9-中脑动脉永久性梗阻(pMCAO)
通过鼻锥(nose cone)，用3％异氟烷、70％氧化亚氮和30％氧气 的混合气体将270-300g成年雄性Wistar大鼠(Charles River， Wilmington，MA)麻醉。在手术期间，用加热灯将温度保持在37℃。 通过电灼烧MCA的末梢部分(通过开颅术)，并将两条颈动脉结扎90 min，阻断侧支循环，诱发MCAO永久性闭塞(Chen ST，Hsu CY，Hogan EL，Maricq H Balentine JD(1986)A model of focal ischemic stroke in the rat：reproducible extensive cortical infarction(大鼠病灶性局部缺血性 中风模型：可再生性大面积皮层梗死形成).Stroke 17：738-743)。在形 成局部缺血1.5、5.5、24、48和72小时后，分别静脉内给予10mg/kg 化合物。观察大鼠21天，进行长期功能性恢复评价。根据Bederson 等在(Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，Nishimura MC，Davis RL， Bartkowski H(1986)Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination(大鼠中脑动脉 闭塞：对该模型的评价和神经紊乱发展的检查).Stroke 17(3)：472-476) 和DeRyck等在(DeRyck M，van Reempts J，Duytschaever H，van Deuren B，Clincke G(1992)Neocortical localization of tactile/proprioceptive limb placing reactions in the rat(大鼠触觉/本体感受肢体的神经皮质定位定 位的空间反应).Brain Res 573：44-60)中报道，用由早期试验改良的三 种行为试验评价感觉运动和反射功能。简而言之，对于姿式试验， 将大鼠悬挂在空中，大鼠尾末端距台面约30cm。大鼠的两条前肢向 台面伸展，评分为0；对侧肢向身体弯曲和/或向内侧旋转对侧肩和 肢，评分为1，向对侧面翻转身体和试图抓尾，评分为2。前肢定位 试验由两个分试验组成，视觉和触觉定位试验。对于视觉定位试验， 将大鼠固定，让前肢在空中随意活动，使其从正面或旁路接近台面。 为进行触觉定位试验，固定大鼠，使它不能看到台面。使前爪的背 和侧面轻微触及台面。在每次试验中，如果定位反应快速和正常， 则评分为0；如果定位迟缓(＞2秒)或偶然，则评分为1；如果无反应， 则评分为2。对于后肢定位试验，将大鼠固定在台面边缘，将大鼠的 对侧后肢拉离边缘，释放。大鼠立即缩回台面上的后肢，评分为0， 迟缓(＞2秒)评分为1，未能缩回后肢评分为2。总分范围为0-12。静 脉内给予(10mg/kg)实施例2中制备的化合物，然后进行pMCAO， 证实它减少大鼠行为缺陷评分，具有统计学显著意义。
实施例10-T细胞测定
在以下测定中，按照厂商(StemCell Technologies，Inc.Vancouver， British Columbia)说明书，用RosetteSep，通过在外周血淋巴细胞中 进行负选择，纯化人CD4+T细胞。
A.抗CD3/-CD28刺激和IL-2再刺激测定
按Blair等在J.Immunol.，160：12，1998中所述，在甲苯磺酰活化 的磁性微球(Dynal，Great Neck，NY)上涂布抗CD3Ab(1μg/107微球) 和抗-CD28Ab(0.5μg/107微球)。用鼠IgG使微球的结合容量饱和(总 蛋白＝5μg/107微球)。将涂布蛋白的微球加入到纯化的CD4+T细胞 中(2×106细胞/mL，比例为1珠：1细胞)，在RPMI、10％胎牛血清、 2mM谷氨酸培养基中活化72小时。收获细胞，洗涤，在新鲜培养 基中培养过夜，按Bennett等在J.Immunol.170：711，2003中所述，用 IL-2再刺激。简而言之，再将过夜静息细胞计数，在平底96孔微量 滴定板接种(105细胞/孔)，在递增浓度的化合物存在下，用1ng/mL 人IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)刺激。再刺激培养物72小时 后，用1μCi/孔氚化胸苷使板脉冲化，温育6-16小时。
实施例1和3化合物抑制IL-2产生的IC50小于约1μM，优选小 于约200nM。实施例1和3化合物的IL-2产量与雷帕霉素和CCI-779 的IL-2产量想当。
B.佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)/伊屋诺霉素激活测定
用该测定法测定化合物的增殖。将CD4+T细胞(5×105细胞/孔) 接种在含RPMI、10％胎牛血清、2mM谷氨酸培养基的平底96孔微 量滴定板中，在递增浓度的化合物存在下，用PMA(10ng/mL)和伊 屋诺霉素(200ng/mL)刺激。激活72小时后，收集100μL培养基， 进行IL-2测定，再向各孔中加入100μL新鲜培养基，用氚化胸苷(1 μCi/孔)标记培养物，保持6小时。收获培养物，用Trilux(Perkin Elmer， Shelton，CT)评价氚化胸苷结合(每分钟计数一次，CPM)。按厂商(R&D Systems，Minneapolis，MN)说明书，用ELISA测定IL-2产量。
在该测定中，实施例1和3化合物抑制增殖的EC50范围为4.9-0.2 μM。
实施例11
使PTEN肿瘤抑制基因(在染色体10上缺失磷酸和张力蛋白同 系物)编码脂质磷酸酶，该酶在PI3K/AKT信号途径的负调节中起关 键作用。在脑、前列腺、子宫内膜、甲状腺、乳腺的瘤和淋巴样瘤 中，发现PTEN基因突变或缺失。参见Cantley et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.96：4240-4245，1999；Ali et al.，J.Natl.Cancer Inst.91：1922- 32，1999；Scott et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：7772-7777，1998； 和Nave et al.，Biochem.J.344：427-431，1999。
在该测定中，进行基于细胞的增殖测定，以评价本发明化合物 抑制细胞生长的能力，这些细胞包括乳腺瘤细胞系MDA468(突变的 PTEN)ATCC号HTB-132或前列腺瘤细胞系LNCap(突变的PTEN) ATCC CRL-1740。
(i)第1天，将细胞接种到96孔培养板中，
(ii)第2天，将预定浓度的化合物加入细胞。
(iii)第5天，按SA O′Toole等在Cancer Detection and Prevention， 27(1)，2003中所述标准MTS测定方案，测量细胞增殖。用96孔格 式板读出仪，记录A490吸光度结果。
(iv)然后计算由化合物处理孔得到的MTS结果(A490单位)，以 相对于在同一培养板上的对照孔(未处理)的对照生长％表示。
该数据说明，实施例1化合物对MDA468和LNCap细胞系的IC50值均小于0.01μM。
实施例12-调节利阿诺定受体钙流
当按以下测定测试时，预计化合物通过使与利阿诺定受体结合 的FKBP12.6稳定，调节利阿诺定受体钙流。
A.钙摄取测定
按(1)T.Yamamoto等Cardiovasculai Research，44：146-155(1999) 或(2)M.Yano等在Circulation，102：2131-2136(2000)中所述方法测定 钙(Ca2+)摄取。
按照Kranias等在Biochem.Biophys.Acta.，709：28-37(1982)中所 述方法，制备用于这些测定的肌质网(SR)小泡。将自诱发心衰的狗获 得的左心室在含30mM Tris-苹果酸盐，0.3M蔗糖，5mg/L亮抑酶肽 和0.1mM PMSF的pH 7.0的溶液(溶液I)中匀浆。将该匀浆在5500g 下离心10分钟，使得到的上清液通过4层粗棉布过滤，然后在12,000 g下离心20分钟。将上清液再通过粗棉布过滤，在143,000g离心30 分钟。将沉淀再悬浮于含0.6M KCl，30mM Tris-苹果酸盐、0.3M蔗 糖、5mg/L亮抑酶肽、0.1mM PMSF的pH 7.0的溶液(溶液II)中。 按上述方法，将悬浮液在143,000g离心。将沉淀悬浮于溶液I，并 在143,000g下离心。将含SR小泡的微粒体组分沉淀悬浮于含0.1M KCl、20mM Tris-苹果酸盐、0.3M蔗糖、5mg/L亮抑酶肽、0.1mM PMSF的pH 7.0的溶液中，得到终浓度10-20mg/mL蛋白。
(1)将以上制备的SR小泡(0.2mg/mL)在含0.15M KCl、1mM MgCl2、30μM45CaCl2(1mCi/mL)、10mM NaN3和20mM MOPS的 pH 7.1的2mL溶液(22℃)中温育。通过加入1mM ATP，启动Ca2+摄取，在各个时间段，通过将2mL等分试样加入0.45μm Millipore 滤器，用含30mM EGTA和15μM钌红)的5mL洗涤缓冲液(0.15M KCl、20mM MOPS、pH 7.1(22℃)洗涤，测定摄取。
通过液体闪烁计数，测定残留在滤器上的放射性。
(2)将以上制备的SR小泡(0.2mg/mL)在含0.15mol/L葡糖酸 钾、1mmol/L MgCl2、0.2mmol/L EGTA-钙缓冲液(不含[Ca2+]0.3μM)， 10mM NaN3和20mM MOPS的pH 6.8的0.5mL溶液中温育。通过 将0.5mM ATP加入杯中，启动Ca2+摄取。用fluo 3作Ca2+指示剂， 在分光光度计spectrophotometrica上(于480nm，处激发，于530nm 处发射)监测Ca2+摄取。
B.钙泄漏测定
按M.Yano等在Circulation，102：2131-2136(2000)中所述方法测 定钙(Ca2+)摄取。
按照以上″A.钙摄取测定，(2)″中所述方法，在SR小泡中Ca2+摄 取到达平台后，在抑制SR Ca2+-ATP活性的1μM毒胡萝卜素存在下， 加入各种浓度的FK506，监测产生的Ca2+泄漏。
C.共定位(Co-Localization)测定
按C.George等在Circulation Research，93：531-540(2003)中所述 方法，测定共定位至FKBP 12(或FKBP 12.6)的心肌利阿诺定受体 (RyR)。
将表达人心肌利阿诺定2受体(hRyR2)的HL-1心肌细胞 (cardiomyocytes)在明胶(0.02％[重量/体积]/纤连蛋白(10μg.mL)基质上 培养，并保存在补充胎牛血清(10％[体积/体积]，谷氨酸(2mM)，去甲 肾上腺素(0.1mM)，青霉素(100u/mL)和链霉素(100μg/mL)的 Claycomb培养基(JRH Biosciences)中。用共免疫沉淀测定法，分别用 pAb129(抗RyR2)和抗FKBP进行共免疫沉淀和免疫印迹，测定 FKBP12.6:hRyR2相互作用。
用pAb129和Alexa488缀合次生抗体将RyR2免疫定位，用N-19 (Santa Cruz Biotechnology)和Alexa546次生抗体将FKBP共染色。
D.蛋白质印迹法
按C.George等在Circulation Research，93：531-540(2003)中所述 方法，测定心肌利阿诺定受体(RyR)表达和与FKBP12(或FKBP12.6) 结合。
可用常规技术，对取自按以上″C.共定位测定″中所述培养的 HL-1心肌细胞的微粒体组分进行蛋白质印迹。用抗-RyR2(pAb129)， 使HL-1细胞中的微粒体组分(100μg)免疫沉淀，然后进行抗-FKBP 免疫印迹。
E.SR Ca2+泄漏的电生理学测定
按T.Shannon等在Circ.Res.，93：592-594(2003)中所述方法， 测定肌质网(SR)Ca2+泄漏。
从通过使主动脉供血不足和狭窄结合诱发心衰的新西兰白兔 (Myrtle′s Rabbitry，Inc.，Thompson Station，Tenn.，USA)中分离心室肌细 胞。在细胞刺激至稳态期间，在不同负荷的不同频率下，测量舒张SR Ca2+。可通过注入丁卡因(tetracine)(RyR阻滞剂)后，测量总肌质网Ca2+负荷([Ca2+]SRT)增加，评价舒张利阿诺定受体(RyR)Ca2+泄漏水平。
实施例13-心血管作用
按标准药理试验方法，用ApoE剔除(EKO)小鼠证明本发明化合 物治疗和抑制心血管病或周围血管病的效力，这种小鼠是完全公认 的人动脉粥样硬化的动物模型。所用的方法简述如下。
将4-6周龄雄性EKO小鼠关在鞋形箱笼中，让它们随意接触食 物和水。将这些动物按重量随机分为5组(N＝12-15小鼠/组)，在研究 的第一个星期，用Purina Rodent Chow饲料饲养。在该研究期间和剩 余的12周中，每2天皮下(s.c)给予动物0、1、2、4或8mg/kg雷帕 霉素类似物，用2％吐温-80、1％羧甲基纤维素作溶媒和对照。在研 究的第2-第13周中，将动物饲料改为基于酪蛋白的Western Diet。 在研究结束时，将动物无痛处死，采集血样，依次用盐水、10％甲醛 灌注心脏。分别用Boehringer Mannheim和Wako Biochemicals的市 售试剂盒及Boehringer Mannheim Hitachii 911分析仪(Boehringer Mannheim Diagnostic Laboratory Systems，Indianapolis，Ind.)，用酶法 测定总胆固醇和甘油三酯。用FPLC尺寸分级，进行血脂蛋白的分离 和纯化。简言之，将50-100ml血清过滤，在两条串联的Superose 6 柱(Amersham Pharmacia Biotech，UK，Ltd)上进样，以恒定流速，用1 mM EDTA钠和0.15M NaCl洗脱。用Millennium软件(Waters Technologies Corporation)将代表VLDL、LDL和HDL的各个曲线面 积积分，通过将总胆固醇值乘以每个相应峰的相对面积百分数，对 每种脂蛋白组分定量。小心分离大动脉，将其保存在甲醛中，固定48-72 小时，然后处理。通过油红O(Oil Red O)染色，鉴定动脉粥样硬化 损害，该染色法是鉴定中性脂质例如胆固醇和甘油三酯的完全公认 的方法。将血管脱色，然后用配备同步Sony 3CCD摄像系统的Nikon SMU800显微镜拍摄，用IMAQ Configuration Utility(National Instrument)作映像捕获软件。用Robert Coll(Coleman Technologies)设 计的定制阈值效用软件包对沿主动脉弓的损害定量。用该程序的阈 值函数，自动评价血管的损害，尤其在包含从右颈总动脉的近边到 左锁骨下动脉远边的大动脉弓区域内的损害。将大动脉粥样硬化数 据表示为涉及严格限于该定义腔区域内的损害(脂质)％。用Dunnett’s 检验测得在对照组和处理组之间具有统计学显著意义(1％显著性水 平)(p＜0.01)。
结果如所预期的，与对照EKO小鼠相比，用本发明化合物处理 将显著(p＜0.01)提高循环血HDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平，而不显 著影响甘油三酯、总胆固醇或VLDL-胆固醇水平。结果还如所预期 的，在处理小鼠中，显示动脉粥样硬化水平明显和剧烈降低(脂质分 解)的结果。
结果还如所预期的，显示本发明化合物可防止血管壁上的蓄积 和所述典型的动脉粥样硬化病的发展。
列于本说明书中的所有专利、专利公布和其它刊物均通过引用 结合到本文中。虽然通过参照尤其优选的实施方案说明本发明，但 本领域技术人员会意识到，在不偏离本发明精神的前提下，可进行 各种改进。此类改进应在本发明权利要求的范围内。