一种抗真菌蛋白及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101591385 B (45)授权公告日 2011.07.20 CN 101591385 B *CN101591385B* (21)申请号 200910074825.7 (22)申请日 2009.07.03 C07K 14/415(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C07K 1/14(2006.01) A23L 3/3472(2006.01) A01N 65/44(2009.01) A01P 3/00(2006.01) (73)专利权人 山西大学 地址 030006 山西省太原市小店区坞城路 92 号 (7。

2、2)发明人 王转花 白承之 李玉英 (74)专利代理机构 山西五维专利事务所 ( 有限 公司 ) 14105 代理人 杨耀田 CN 101148471 A,2008.03.26, 景巍 . 一种苦荞过敏性贮藏蛋白的研 究 .中国优秀博硕士学位论文全文数据库 （硕 士） 医药卫生科技辑 .2005, 第 2005 年卷 ( 第 7 期 ),E059-36. Zhuanhua Wang 等 .Cloning,Expression, and Identification of Immunological Activity of an Allergenic Protein in Tartary Buc。

3、kwheat.Biosci. Biotechonol. Biochem. .2006, 第 70 卷 ( 第 5 期 ),1195-1199. (54) 发明名称 一种抗真菌蛋白及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了一种抗真菌蛋白， 是从莜麦种 子水溶性提取物中纯化得到的， 表观分子量为 35kDa 左右的蛋白质。抗真菌蛋白的制备方法是 将莜麦种子粉碎， 脱脂， 使用缓冲液抽提， 经抽提 获得粗蛋白后， 经过两步色谱分离即 Resource S 阳离子交换和 Superdex 75 凝胶排阻层析纯化 而获得。该抗真菌蛋白对白腐菌和绿色木霉的 生长有显著的抑制作用， 对白腐菌最低抑制量。

4、为 0.42g， 对绿色木霉的最低抑制量为 0.21g。 另外对镰刀霉也有一定的抑制生长作用。该抗真 菌蛋白可作为食品防腐添加剂， 农作物抗真菌侵 害喷剂等， 在食品防腐以及农作物防病、 抗病方面 具有实用价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽华 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101591385 B1/1 页 2 1. 一种抗真菌蛋白， 其特征在于通过如下方法制得 ： (1) 取莜麦种子， 经过低温干燥， 粉碎， 在低温条件下加入丙酮搅拌脱脂， 减压抽滤， 弃 丙酮， 收集滤饼， 加入少量。

5、乙醚搅拌， 减压抽滤， 弃乙醚， 收集滤饼， 低温下干燥， 得粉末状莜 麦种子脱脂粉 ； (2) 取莜麦种子脱脂粉， 加入浸提缓冲液， 缓冲液配方为 ： 20mM Tris-HCl， pH 8.0 ； 在 低温条件下搅拌浸提 6 小时， 离心弃沉淀， 在上清中加入硫酸铵至 80饱和度， 低温条件下 搅拌盐析， 离心弃上清， 沉淀用浸提缓冲液溶解， 并对浸提缓冲液充分透析平衡， 得莜麦种 子水溶总蛋白 ； (3) 莜麦种子水溶总蛋白对 Resource S 阳离子交换层析平衡缓冲液充分透析平衡， 上样于 Resource S 阳离子交换柱 ； 平衡缓冲液条件 ： 20mM NH4OAc， pH 。

6、4.5， 洗脱缓冲液条 件 ： 20mM NH4OAc， 内含1M NaCl， pH 4.5， 控制流速在0.5ml/min， 待杂蛋白被洗脱之后， 设置 10， 20min 连续梯度洗脱 ； 收集活性洗脱峰 ； (4)收集到的活性洗脱峰对平衡缓冲液充分透析后， 上样于Superdex 75 10/300 GL 凝胶层析柱， 洗脱条件 ： 20mM Tris-HCl， 150mM NaCl， pH 8.0， 流速 0.5ml/min ； 收集活性洗 脱峰， 即得莜麦种子抗真菌蛋白。 2. 如权利要求 1 所述的一种抗真菌蛋白用于制备食品防腐添加剂。 3. 如权利要求 1 所述的一种抗真菌蛋白用。

7、于制备抗绿色木霉和白腐菌的药物。 权 利 要 求 书 CN 101591385 B1/4 页 3 一种抗真菌蛋白及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种植物抗真菌蛋白， 具体属于一种植物种子抗真菌蛋白及其制备方 法和应用。 背景技术 0002 植物种子抗真菌蛋白 (antifungal proteins and peptides， AFPs)， 是种子植物 在长期的生长进化过程中， 获得的一种保护机制， 使种子具有一定的抵御自然界微生物侵 蚀的能力。种子植物生长的全过程面临微生物的威胁， 这其中， 由于真菌 ( 特别是植物致病 霉菌 ) 的繁殖能力， 扩散速度和环境适应能力优于细。

8、菌， 所以， 植物种子贮藏面临的主要威 胁来自于真菌， 同样的， 通常植物种子中含有一种或多种抑菌谱广的抗真菌蛋白或抗真菌 肽， 这些天然植物抗真菌肽或者抗真菌蛋白具有来源广泛， 抗菌作用显著， 且对食品或农作 物无毒等特点， 近年来， 备受有关研究者的关注。从不同植物种子中分离纯化分子量不等， 具有一定的抗菌作用的蛋白已成为新的研究热点， 其市场前景广阔。 0003 从 2000 年至今， 陆续有多种植物抗真菌蛋白被纯化和鉴定， 这其中， 更加值得关 注的是来自于各种粮食和经济作物的抗真菌蛋白。 例如， 巴西科学家使用分子筛层析， 离子 交换层析和反相高压液相等三种层析手段， 于 2006 。

9、年在高粱 (Sorghum bicolor) 中纯化 得到一种分子量为 30 kDa 的抗真菌蛋白。现有的抗真菌蛋白纯化流程大多涉及高压液相 (HPLC)， 这样做的缺点是制备体系放大困难， 无法实现批量生产， 其规模只能停留在实验室 微量级制备阶段。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种抗真菌蛋白及其制备方法， 以及抗真菌蛋白的应用。所 述制备方法工艺简单、 有望实现批量生产。 0005 本发明提供的一种抗真菌蛋白， 是将莜麦 ( 裸燕麦 ) 种子粉碎， 通过丙酮脱脂、 缓 冲液搅拌浸提、 硫酸铵盐析、 Resource S 阳离子交换层析和 Superdex 75 凝胶过滤层析， 得。

10、到的一种抗真菌蛋白， 其在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量约为 35kDa， 纯度达到 95以上， 纯化倍数约为 188 倍。 0006 所述的莜麦， 学名裸燕麦， 是禾本科燕麦属一年生草本植物。 0007 本发明提供的一种抗真菌蛋白的制备方法， 包括如下步骤 ： 0008 (1) 取莜麦种子， 经过低温干燥， 粉碎， 在低温条件下加入丙酮搅拌脱脂， 减压抽 滤， 弃丙酮， 收集滤饼， 加入少量乙醚搅拌， 减压抽滤， 弃乙醚， 收集滤饼， 低温下干燥， 得粉 末状莜麦种子脱脂粉 ； 0009 (2)取莜麦种子脱脂粉， 加入浸提缓冲液， 缓冲液配方为 ： 20mM Tris-HCl， pH 8.。

11、0 ； 在低温条件下搅拌浸提， 离心弃沉淀， 在上清中加入硫酸铵至 80饱和度， 低温条件下搅拌 盐析， 离心弃上清， 沉淀用浸提缓冲液溶解， 并对浸提缓冲液充分透析平衡， 得莜麦种子水 溶总蛋白 ； 说 明 书 CN 101591385 B2/4 页 4 0010 (3) 莜麦种子水溶总蛋白对 Resource S 阳离子交换层析平衡缓冲液充分透析平 衡， 上样于 Resource S 阳离子交换柱 ； 平衡缓冲液条件 ： 20mM NH4OAc， pH 4.5， 洗脱缓冲液 条件 ： 20mM NH4OAc， 内含1M NaCl， pH 4.5， 控制流速在0.5ml/min， 待杂蛋白(。

12、穿透峰部分) 被洗脱之后， 设置 10， 20min 连续梯度洗脱 ； 收集活性洗脱峰 IV， 见图 1 ； 0011 (4) 收集到的活性洗脱峰 IV 对平衡缓冲液充分透析后， 上样于 Superdex 75 10/300 GL 凝胶层析柱， 洗脱条件 ： 20mM Tris-HCl， 150mM NaCl， pH 8.0， 流速 0.5ml/min ； 收集活性洗脱峰 I， 即得莜麦种子抗真菌蛋白， 见图 2。 0012 使用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检验， 分离胶浓度为 12.5， 浓缩胶浓度 为 4。莜麦种子抗真菌蛋白经 SDS-PAGE 分析表现为单一条带， 其表观分子量。

13、为 35kDa 左 右， 见图 3。 0013 通过上述方法得到的莜麦种子抗真菌蛋白， 经试验对白腐菌和绿色木霉的生长具 有显著的抑制作用， 不仅可用于制备食品防腐添加剂， 也可用于制备抗真菌药物如农作物 抗真菌侵害喷剂等， 在食品防腐以及农作物防病、 抗病方面具有实用价值。 0014 与现有技术相比本发明具有如下的优点和效果 ： 0015 该抗真菌蛋白的最低抑菌量显著低于已知的其他种类的抗真菌蛋白或抗真菌肽。 其中， 对于绿色木霉的最低抑菌量为0.21g。 这说明来自于莜麦种子的抗真菌蛋白具有更 高的真菌生长抑制活性。 0016 该抗真菌蛋白的制备方法的显著特点是 ： 纯化倍数高， 纯化步骤。

14、少。 0017 如表1所示， 在阳离子交换层析这一步骤具有最高的纯化倍数， 达72倍， 这与层析 条件的选择和梯度洗脱的设计有关。 已知的其他抗真菌蛋白的纯化一般联合使用三种以上 的层析手段 ( 亲和层析， 离子交换层析和分子筛层析 ) 和两套纯化系统 (FPLC 和 HPLC)， 才 能得到纯度较高的样品， 这样做的缺点是提高了纯化成本， 目的蛋白得率低， 且无法实现批 量生产。而本发明所提供的制备方法只涉及两种层析手段 ( 离子交换层析和分子筛层析 ) 及一套纯化系统 (FPLC)， 成本低， 周期短， 有工业级别的设备面市， 有望实现批量生产。 0018 如图 3 所示， 本发明所提供的。

15、制备方法获得的抗真菌蛋白纯度高， 达到 95以上。 附图说明 0019 下面结合附图用实施例来说明本发明的实质性内容， 但本发明的内容并不局限于 此 ： 0020 图 1 ： 为本发明莜麦种子抗真菌蛋白的 Resource S 阳离子交换层析图 0021 其中， 梯度设计采用 10连续梯度， 在洗脱组分中， 峰 IV 为活性洗脱峰。 0022 图 2 ： 为本发明莜麦种子抗真菌蛋白的 Superdex 75 排阻层析图 0023 其中， 峰 I 为活性洗脱峰。 0024 图 3 ： 为本发明莜麦种子抗真菌蛋白纯化结果的 SDS-PAGE 0025 泳道 1 ： 莜麦种子水溶性总蛋白 ； 泳道 。

16、2 ： 莜麦种子水溶性总蛋白在 pH 4.5 条件 下透析后的上清液 ； 泳道 3 ： Resource S 阳离子交换层析活性洗脱组分 ( 峰 IV) ； 泳道 4 ： Superdex 75 凝胶层析活性洗脱组分 ( 峰 I) ； Mr ： 低分子量标准蛋白。 0026 图 4-A ： 为本发明莜麦种子抗真菌蛋白对绿色木霉的生长抑制作用的剂量依赖性 实验 说 明 书 CN 101591385 B3/4 页 5 0027 其中 1 ： 对照组 ； 2 ： 样品组 (0.21g) ； 3 ： 样品组 (0.42g) ； 4 ： 样品组 (0.84g) 0028 图 4-B ： 为本发明莜麦种子。

17、抗真菌蛋白对白腐菌的生长抑制作用的剂量依赖性实 验 0029 其中 1 ： 对照组 ； 2 ： 样品组 (0.42g) ； 3 ： 样品组 (0.84g) 具体实施方式 0030 实施例 1 ： 制备莜麦种子抗真菌蛋白 0031 莜麦种子来自山西省大同市莜麦产区， 取当年收获莜麦种子 100g， 经过低温干燥 处理， 于种子粉碎机中粉碎， 过0.2mm孔径筛网， 以加入丙酮300ml， 于4条件下搅拌脱脂3 小时。减压抽滤， 弃丙酮， 收集滤饼， 加入少量乙醚搅拌， 减压抽滤， 弃乙醚， 收集滤饼， 低温 下干燥， 所得粉末为莜麦种子脱脂粉。 0032 取莜麦种子脱脂粉 20g， 加入浸提缓冲。

18、液 200ml， 缓冲液配方为 ： 20mM Tris-HCl， pH 8.0。 在4条件下搅拌浸提6小时， 12000rpm离心弃沉淀， 在上清中加入硫酸铵至80 饱和度， 4条件下搅拌盐析 6 小时， 12000rpm 离心弃上清， 沉淀用浸提缓冲液溶解， 并对浸 提缓冲液充分透析， 所得蛋白溶液为莜麦种子水溶总蛋白。 0033 莜麦种子水溶总蛋白对Resource S阳离子交换层析平衡缓冲液充分透析平衡， 上 样于 Resource S 阳离子交换柱 (1ml)。平衡缓冲液条件 ： 20mM NH4OAc， pH 4.5， 洗脱缓冲 液条件为20mM NH4OAc， 内含1M NaCl，。

19、 pH 4.5， 控制流速在0.5ml/min， 待杂蛋白(穿透峰部 分 ) 被洗脱之后， 设置 10， 20min 连续梯度洗脱。收集相应活性洗脱峰 IV， 见图 1。 0034 收集到的活性洗脱峰 IV 对平衡缓冲液充分透析后， 上样于 Superdex 75 10/300 GL 凝胶层析柱， 洗脱条件为 ： 20mM Tris-HCl， 150mM NaCl， pH 8.0。流速为 0.5ml/min。收 集相应的活性洗脱峰 I， 即得纯化的莜麦种子抗真菌蛋白， 见图 2。 0035 使用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检验， 分离胶浓度为 12.5， 浓缩胶浓度 为 4。莜麦种子。

20、抗真菌蛋白经 SDS-PAGE 分析表现为单一条带， 其表观分子量为 35kDa 左 右， 纯度达到 95以上， 见图 3。纯化倍数约为 188 倍， 见表 1。 0036 表 1 ： 各纯化步骤目的蛋白得率及纯化倍数计算 0037 0038 实施例 2 莜麦种子抗真菌蛋白对绿色木霉生长抑制的作用及其剂量依赖性实验 0039 准备 PDA 培养基， 将供试菌株绿色木霉 (Trichoderma reesei) 点植于培养基中 心， 于 28培养至霉菌菌落直径达到 1-2cm， 在菌落外围放置灭菌的牛津杯， 距离菌落边缘 1cm， 样品组(含目的蛋白)和对照组(相同条件缓冲液)使用0.22m微孔。

21、滤膜过滤除菌， 说 明 书 CN 101591385 B4/4 页 6 在牛津杯内加入 200l 制备的蛋白样品或相同体积的缓冲液做对照， 盖上陶瓦盖， 在 4 预扩散 24h， 将培养基转移到 28培养箱中培养 72h 后观察菌落生长状况。 0040 如图 4-A 所示 ： 设置四个牛津杯， 其中 1 为对照组， 2， 3， 4 为样品组， 其目的蛋白含 量分别为 0.21g， 0.42g， 0.84g。实验结果显示 ： 与对照组相比， 样品组显示出显著的 抑菌活性， 并且呈现剂量依赖性。其最小抑菌量为 0.21g。 0041 实施例 3 莜麦种子抗真菌蛋白对白腐菌生长抑制的作用及其剂量依赖。

22、性实验 0042 准备 PDA 培养基， 将供试菌株白腐菌 (Panus conchatus) 点植于培养基中心， 于 28培养至霉菌菌落直径达到 1-2cm， 在菌落外围放置灭菌的牛津杯， 距离菌落边缘 1cm， 样品组 ( 含目的蛋白 ) 和对照组 ( 相同条件缓冲液 ) 使用 0.22m 微孔滤膜过滤除菌， 在 牛津杯内加入 200l 制备的蛋白样品或相同体积的缓冲液做对照， 盖上陶瓦盖， 在 4预 扩散 24h， 将培养基转移到 28培养箱中培养 72h 后观察菌落生长状况。 0043 如图 4-B 所示 ： 设置三个牛津杯， 其中 1 为对照组， 2， 3 为样品组， 其目的蛋白含量 分别为 0.42g， 0.84g。实验结果显示 ： 与对照组相比， 样品组显示出显著的抑菌活性， 并且呈现剂量依赖性。其最小抑菌量为 0.42g。 说 明 书 CN 101591385 B1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101591385 B2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。