技术领域
本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种高产雷帕霉素链霉菌的选育方法。
背景技术
雷帕霉素作为新型大环内酯类的抗排斥药物，是目前世界上最新的强效免疫抑制剂，临床上用于器官移植的抗排斥反应。另外，雷帕霉素也可用于治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病的药物，并具有发展为基因治疗药和抗肿瘤药物的潜力,从而具有广阔的应用前景。但是，国内外文献报道的吸水链霉菌发酵生产的水平都较低，大多在200mg/L左右。雷帕霉素是由吸水链霉菌发酵过程中产生的。为了提高雷帕霉素产量，国内外学者进行了大量研究工作，主要包括菌种选育、发酵方法优化两方面。
据文献报道，多年来，通过运用多种不同的诱变方法进行了雷帕霉素生产菌株的选育，获得了一些高产菌株。但诱变方法仍以传统的物理诱变和化学诱变居多，存在诱变方法随机、方向不易掌握、理想个体筛选困难等局限性。近年来，出现了一些新的手段，如钴离子、氮离子注入，其是集物理诱变和化学诱变为一体的综合诱变方法，可使遗传物质在基因水平上发生改变或缺失，显著提高生物的变异率，但这类设备昂贵，不易操作，从而使其受到了限制。
发明内容
针对现有技术中高产雷帕霉素链霉菌的选育方法中存在的诱变方法随机、方向不易掌握、理想个体筛选困难的问题，本发明提供一种高产雷帕霉素链霉菌的选育方法，其目的在于：采用常温常压等离子体诱变(ARTP)和紫外复合诱变，链霉素抗性筛选的选育方式，获得具有遗传稳定性的高产雷帕霉素菌株。
本发明采用的技术方案如下：
一种高产雷帕霉素链霉菌的选育方法，包括如下步骤：
[1]起始菌株的筛选：选择高产雷帕霉素水平高的菌株作为诱变出发菌株；
[2]菌种诱变：依次通过常温常压等离子体诱变、紫外诱变和复合诱变对步骤[1]得到的诱变出发菌株进行诱变；所述复合诱变为先进行紫外诱变，然后进行常温常压等离子体诱变；
[3]结合链霉素抗性对经过步骤[2]诱变的菌株进行抗性筛选，通过摇瓶验证复筛，筛选出高产菌株，制备冷冻管，进行菌种保藏。
优选的，在经过步骤[3]的处理后，还进行步骤[4]：进行传代验证，将筛选出的高产菌株进行连续斜面传代，连续传代5次，摇瓶验证发酵产雷帕霉素的能力。
优选的，常温常压等离子体诱变的条件为高纯氦气，功率120W，工作气流量10L/min，诱变距离2mm，诱变时间为10s～90s。
优选的，的紫外诱变的条件为用20W紫外灯在20cm处照射20～100s。
优选的，步骤[3]所述的抗性筛选为将经过诱变的菌株涂布于链霉素抗性平板上进行选育。
优选的，抗性筛选的链霉素浓度为0.2～0.8g/L。
优选的，菌株的发酵培养周期为192～240h。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
采用ARTP/紫外复合诱变，结合链霉素抗性筛选，获得的优良链霉菌AU35菌种，产雷帕霉素为0.8～1.0g/L，菌种传代稳定，有利于将来放大生产。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明提供一种高产雷帕霉素链霉菌的选育方法，包括如下步骤：
[1]起始菌株的筛选：选择高产雷帕霉素水平高的菌株作为诱变出发菌株；
[2]菌种诱变：依次通过常温常压等离子体诱变、紫外诱变和复合诱变对步骤[1]得到的诱变出发菌株进行诱变；所述复合诱变为先进行紫外诱变，然后进行常温常压等离子体诱变；
[3]结合链霉素抗性对经过步骤[2]诱变的菌株进行抗性筛选，通过摇瓶验证复筛，筛选出高产菌株，制备冷冻管，进行菌种保藏。
优选的，在经过步骤[3]的处理后，还进行步骤[4]：进行传代验证，将筛选出的高产菌株进行连续斜面传代，连续传代5次，摇瓶验证发酵产雷帕霉素的能力。
优选的，常温常压等离子体诱变的条件为高纯氦气，功率120W，工作气流量10L/min，诱变距离2mm，诱变时间为10s～90s。
优选的，的紫外诱变的条件为用20W紫外灯在20cm处照射20～100s。
优选的，步骤[3]所述的抗性筛选为将经过诱变的菌株涂布于链霉素抗性平板上进行选育。
优选的，抗性筛选的链霉素浓度为0.2～0.8g/L。
优选的，菌株的发酵培养周期为192～240h。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
为了利用ARTP/紫外复合诱变结合链霉素抗性筛选，通过摇瓶初筛和复筛，选出高产菌株。本实施例进行ARTP/紫外复合诱变、链霉素抗性选育，摇瓶筛选实验。
实验材料的准备如下：
1、链霉菌菌株。
2、种子培养基：可溶性淀粉1.0～2.0％，葡萄糖2.0～3.0％，棉籽粉0.5～1.0％，黄豆粉1.0～2.0％，酵母粉0.5～3.0％，pH6.0～7.0。
3、发酵培养基：葡萄糖1.0～2.0％，甘油3.0～4.0％，棉籽粉1.0～2.0％，黄豆粉1.0～2.0％，磷酸二氢钾0.5～1.0％，氯化钠0.5～1.0％，赖氨酸1.0～2.0％，硫酸镁0.05～0.1％，硫酸锰0.05～0.1％，pH6.0～7.0。
上述百分数均为质量百分数。
本实施例中实验操作步骤如下：
1、将配制好的种子培养基和发酵培养基，分别分装至250ml三角瓶中，装液量为30ml，在120～122℃下灭菌30min，冷却备用。
2、将经复合诱变所得菌株分别接种至发酵培养基中，在30℃、220rpm下培养192h，对培养得到的发酵液进行分析检测。
3、将经初筛获得的高产菌株接种至种子培养基中，在30℃、220rpm下培养72h，将培养好的种子转种至发酵培养基中，在30℃、220rpm下培养192h，对培养得到的发酵液进行分析检测。
4、发酵液雷帕霉素含量检测：取发酵液2ml加入4ml乙醇，漩涡震荡5min，3000rpm离心5min，取上清液进行高效液相分析检测，根据面积归一法计算雷帕霉素含量。
本实施例的雷帕霉素产量如下：
表1诱变菌株摇瓶复筛结果
如表1所示，通过摇瓶筛选得到一株菌株AU315比原始菌株产量提高42％。
实施例2
本实施例为了确定突变株是否具有良好的遗传稳定性，进行突变菌株传代稳定性试验。
实验材料的准备如下：
1、雷帕霉素突变菌株。
2、种子培养基：可溶性淀粉1.0～2.0％，葡萄糖2.0～3.0％，棉籽粉0.5～1.0％，黄豆粉1.0～2.0％，酵母粉0.5～3.0％，pH6.0～7.0。
3、发酵培养基：葡萄糖1.0～2.0％，甘油3.0～4.0％，棉籽粉1.0～2.0％，黄豆粉1.0～2.0％，磷酸二氢钾0.5～1.0％，氯化钠0.5～1.0％，赖氨酸1.0～2.0％，硫酸镁0.05～0.1％，硫酸锰0.05～0.1％，pH6.0～7.0。
上述百分数均为质量百分数。
本实施例中实验操作步骤如下：
1、将配制好的斜面培养基，分装至试管中，120～122℃下灭菌30min，冷却后备用。
2、将冷却后的斜面在培养箱中30℃下进行空白培养24h。
3、将突变株接种于斜面上，进行传代培养，培养好的菌株置于4℃冰箱中保存，待用。
4、将培养好的斜面，通过挖块法接种于种子培养基中，在30℃、220rpm下培养72h，将培养好的种子转种至发酵培养基中，在30℃、220rpm下培养192h，对培养得到的发酵液进行分析检测。
4、发酵液雷帕霉素含量检测：取发酵液2ml加入4ml乙醇，漩涡震荡5min，3000rpm离心5min，取上清液进行高效液相分析检测，根据面积归一法计算雷帕霉素含量。
根据菌株的传代次数，本实施例中的雷帕霉素产量数据如下：
表2突变菌株的传代稳定性试验结果
从表2可以看出，突变菌株在5代以内具有较好的遗传稳定性。
根据实施例1和实施例2的结果，以链霉菌N12为出发菌株，采用本申请中的ARTP/紫外复合诱变，结合链霉素抗性选育，得到一株雷帕霉素产量为0.8～1.0g/L的高产菌株AU35，产量比出发菌株提高了42％，且该菌株遗传稳定，表明ARTP/紫外复合诱变育种是有效可行的提高雷帕霉素产量的一种育种手段。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。