技术领域：
本发明涉及医学检测领域，尤其涉及细菌检测领域，特别是大肠埃希菌的检测。具体而言，本发明涉及一种快速、敏感、特异检测五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR试剂盒，能够对五种大肠埃希菌进行同时检测，适用于临床检测、卫生防疫以及流行病学调查等。本发明也涉及检测方法及其中专用引物。
背景技术：
针对腹泻病原的快速、敏感、特异性检测与鉴定是预防与控制腹泻病的关键技术环节，目前应用的腹泻病原检测方法费时费力、标准不统一、试剂供应不配套等问题，很难适应快速检测与鉴定的需要。随着人们对健康和卫生问题越来越重视，对检测方法的敏感性、特异性等指标的要求也越来越高。目前病原的检测技术主要分为以下几类：常规分离培养、免疫学检测、分子生物学检测、其它方法等。
为了说明的方便，首先将引起腹泻的大肠埃希菌列表如下(称为表1)，表1中的简写将在下文中更频繁的被使用：
表1.引起腹泻的大肠埃希菌
菌株作用部位疾病与症状致病机制 ETEC EIEC EPEC EHEC EAggEC小肠大肠小肠大肠小肠旅行者腹泻，婴幼儿腹泻，水样便，恶心，呕吐，腹痛，低热水样便，少量血便，腹痛，发热婴儿腹泻，水样便，恶心，呕吐，发热水样便，大量出血，剧烈腹痛，低热或无，可并发HUS、血小板减少性紫癜婴儿持续性腹泻，呕吐，脱水，低热LT和(或)ST肠毒素，大量分泌液体和电解质质粒介导侵袭和破坏结肠粘膜上皮细胞质粒介导粘附和破坏上皮细胞SLT-I或SLT-II，中断蛋白质合成集聚性粘附上皮细胞，阻止液体吸收
注解：
ETEC的英文全称是enterotoxigenic E.coli，中文全称是肠产毒素型大肠杆菌；
EIEC的英文全称是enteroinvasive E.coli，中文全称是肠侵袭型大肠杆菌；
EPEC的英文全称是enteropathogenic E.coli，中文全称是肠致病型大肠杆菌；
EHEC的英文全称是enterohemorrhagic E.coli，中文全称是肠出血型大肠杆菌；
EAggEC(也可以写作EaggEC，EAEC)的英文全称是enteroaggregative E.coli，中文全称是肠集聚型大肠杆菌；
LT的英文全称heat labile enterotoxin，中文全称是不耐热肠毒素，下文也称为热不稳定毒素；ST的英文全称是heat stable enterotoxin，中文全称是耐热肠毒素，下文也称为热稳定毒素；SLT-I和SLT-II是EHEC菌株产生的两种毒素。
其中临床上对腹泻的诊断主要基于患者的临床症状以及病原的分离培养及生化鉴定。虽然五种致腹泻大肠埃希菌引起的腹泻症状会略有不同，但仅靠临床症状进行诊断不易区分。病原的分离和鉴定方法虽然可以确定病原，但操作繁琐、费时，而且受人为等诸多因素影响，容易造成漏检。
免疫学检测方法是将抗原-抗体反应的特异性和可见性应用于检测抗原或抗体的一组可以定位、定性和定量的综合技术，具有高专一性和高敏感性。检测大肠埃希菌的免疫学方法包括血清凝集、ELISA、免疫金标技术等方法。
用诊断血清可以对大肠埃希菌进行分型，但目前只有抗EIEC、EPEC、ETEC的诊断血清，而且上述血清不能覆盖所有的这三种菌株，有些细菌之间还有交叉凝集现象，仅用血清凝集试验，只能对部分菌株确认和对其它菌株排除，并不能对所有的致腹泻大肠埃希菌进行分型。应用ELISA方法可以检测产肠毒素的ETEC和EHEC菌株，包括检测EIEC的热不稳定毒素LT(Ristaino，P.A.，M.M.Levine，and C.R.Young，Improved GM1-enzyme-linked immunosorbent assay for detection of EscherichiaColi heat-labile enterotoxin.J Clin Microbiol，1983.18(4)：p.808-15)、热稳定毒素STI(Carroll，P.J.，M.J.Woodward，and C.Wray，Detection of LT and STla toxins bylatex and EIA tests.Vet Rec，1990.127(13)：p.335-6)、EHEC的肠毒素VT1和VT2(Downes，F.P.，et al.，Development and evaluation of enzyme-linkedimmunosorbent assays for detection of shiga-like toxin I and shiga-like toxin II.JClin Microbiol，1989.27(6)：p.1292-7)等。但是，这些方法的敏感性并不稳定，敏感、可靠的商品化诊断试剂难以获得，而且依赖目的基因在不同培养条件下的相对表达水平，这些缺点使此方法不能检测难培养或不可培养的细菌(Roszak，D.B.and R.R.Colwell，Survival strategies of bacteria in the natural environment.Microbiol Rev，1987.51(3)：p.365-79)。Chapman等(Chapman，P.A.and C.A.Siddons，Acomparison of immunomagnetic separation and direct culture for the isolation ofverocytotoxin-producing Escherichia coli O157 from cases of bloody diarrhoea，non-bloody diarrhoea and asymptomatic contacts.J Med Microbiol，1996.44(4)：p.267-71)将大肠埃希菌O157的特异性抗体包被磁珠进行免疫磁性分离后富集，并与粪便标本直接接种麦康凯培养基进行比较，证明用免疫磁珠从人粪便中分离O157的方法简便、敏感。
综上，腹泻病原菌的免疫学检测方法，不需复杂仪器，操作简单。但各种细菌的抗原性与毒力因子并不是密切相关，从而影响了对病原的确定。另外，大肠埃希菌的抗原复杂，各种肠道细菌之间经常发生基因的水平转移，而且存在抗原表达不完全和抗原间抑制抗原-抗体凝集反应的现象，影响了免疫学方法的特异性和敏感性。虽然有的试剂盒可以直接用粪便悬液做酶联免疫吸附试验，但免疫学方法一般需要提供数量较多的纯化细菌或需对样品进行浓缩后收集，以提高细菌的浓度，从而较难在短时间内得到检测结果。另外，每一种免疫学检测方法都存在与非抗原物质之间的非特异反应，从而产生假阳性反应。此外，待检抗原被样品中一些物质或其它优势菌群所掩蔽，会产生假阴性反应。
随着对各种大肠埃希菌基因组研究的不断深入，许多基因与发病机制的关系已经得到确认，同时也为基因检测奠定了基础，主要方法包括DNA探针杂交和PCR依赖的技术。探针检测方法检测一种菌就需要制备一种探针，尽管该法检测速度快，但要达到检测的敏感性还要对样品进行一定时间的增菌培养，目前还不能根据DNA探针完全取得常规检验提供的细菌特性的信息，在菌株生物型鉴定、血清型和抗药性基因鉴定上有不足之处。检测临床标本时，标本中待检菌量低、杂质成分复杂、样品DNA纯度低等都会限制探针检测的敏感性。这些缺点限制了探针杂交方法的实际应用。依赖PCR的DNA指纹图谱技术是通过各种改进的PCR技术，使目标微生物的核酸经扩增后，产生多条DNA扩增片段，通过统计分析，找出某种微生物的特有条带，进行区别鉴定。常用方法有PCR产物的单链构象多态性(PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP)(Ouabdesselam，S.，et al.，Detection ofgyrA and gyrB mutations in quinolone-resistant clinical isolates of Escherichia coliby single-strand conformational polymorphism analysis and determination of levelsof resistance conferred by two different single gyrA mutations.Antimicrob AgentsChemother，1995.39(8)：p.1667-70)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)(Skwark，M.and A.J.Furowicz，Using the PCR-RFLP method for comparative analysis of the pathogenicEscherichia coli strains.Med Dosw Mikrobiol，2004.56(2)：p.173-7)、等位基因特异性扩增、随机引物扩增DNA多态性分析(random amplified polymorphic DNA，RAPD)(Venieri，D.，et al.，Differentiation of faecal Escherichia coli from human andanimal sources by random amplified polymorphic DNA-PCR(RAPD-PCR).WaterSci Technol，2004.50(1)：p.193-8)分型技术等，其中PCR-SSCP能区分基因间的微细差异(Stach，J.E.，et al.，PCR-SSCP comparison of 16S rDNA sequencediversity in soil DNA obtained using different isolation and purification methods.FEMS Microbiol Ecol，2001.36(2-3)：p.139-151)，RAPD能在多个基因位点形成具有鉴别力的指纹图，广泛应用于菌株分型鉴定。PCR技术已经用于食品中单一致病菌的检测，并得到一定程度的推广。但食品中往往含有多种致病菌，多重PCR的建立，可以实现多种肠道致病菌的同时检测。
多重PCR是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种致病菌的目的(Pass，M.A.，R.Odedra，and R.M.Batt，Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes.J Clin Microbiol，2000.38(5)：p.2001-4)。
定量PCR检测技术是对传统定性PCR技术的发展和补充，即在PCR反应体系中加入标记物，通过检测标记物的量，在定性的同时实现定量(Grant，M.A.，J.Hu，andK.C.Jinneman，Multiplex real-time PCR detection of heat-labile and heat-stabletoxin genes in enterotoxigenic Escherichia coli. J Food Prot，2006.69(2)：p.412-6)。
基因芯片(gene chip)是按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵列。其检测致病菌原理为：选择细菌的共有基因作为靶基因，用一对通用引物进行扩增，再利用芯片上的探针检测不同细菌在该共有基因上的独特碱基，从而区分不同的细菌。此法还可以通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应的探针来逐步扩大基因芯片的检测范围，并通过增加和调整探针来逐步提高基因芯片的准确性，可以在一个工作日内对单个克隆进行分型(Ballmer，K.，et al.，Fast DNA serotyping ofEscherichia coli by use of an oligonucleotide microarray.J Clin Microbiol，2007.45(2)：p.370-9)。
综上，分子生物学技术的应用提高了检测的速度和敏感性，主要用来检测体外不能培养或目前培养方法不敏感、花费高或费时间的微生物。用分子生物学方法检测致病菌时，筛选合适的靶基因是决定检测特异性及敏感性的主要因素。由于样品中存在死的致病菌、特异性核酸片段存在同源性或样品中存在不可培养微生物的情况等，常常造成PCR检测结果与常规方法相比，阳性率偏高的现象。在实际样品检测时，PCR技术可作为大通量的快速筛检技术，对其中出现的少数阳性标本，采用传统的方法加以验证，即可解决假阳性的问题。另外，非特异扩增产物的出现、引物二聚体的形成、产物的拖尾现象、无条带扩增等问题，也限制了PCR技术的应用。
PCR技术已经从扩增单一基因片段的单重PCR，发展到能同时扩增多个基因片段的多重PCR；基于荧光能量技术发展起来的荧光定量PCR(FluorescenceQuantified PCR，FQ-PCR)或实时PCR(real-rime PCR)以及多重实时PCR；与免疫学结合的PCR-ELISA等，检测的敏感性及检测速度等均有较大提高。其中除单重和多重PCR外，其它方法技术性较强、难度较大，需要配备特殊的仪器，未广泛应用。
除以上方法外，根据不同种类细菌的特性，还应用其它的方法进行检测。ETEC能产生一种或多种肠毒素，如热不稳定毒素(heat labile toxin，LT)LT-1和LT-2，热稳定毒素(heat stable toxin，ST)STa和STb；EHEC的主要致病能力是能产生两种细胞毒素——志贺样毒素(shiga-like toxin，Stx)Stx1和Stx2，有些EHEC菌株还含有编码黏附脱落损害的LEE(the locus of enterocyte effacement)位点，可以通过鉴定这些细菌产生的特异毒素来进行诊断。
EAEC的伞状结构称为集聚黏附边缘(aggregative adherence fimbrial，AAF)，包括AAF-I和AAF-II，与黏附HEp一2细胞和人红细胞有关，其检测的经典方法为Hep-2细胞黏附试验。
微生物的自动化检测，是微生物检测发展的方向之一，常用的有全自动微生物鉴定仪(VITEK-AMS)，可以在短时间内确定病原菌的种类。
色谱法的主要依据是不同病原体的化学组成或所产生的代谢产物各异，利用色谱检查可直接分析细菌的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测，其中以气相色谱应用较多。尽管该法具有简单、快速、可靠，在数小时内即可得出结果的特点，但由于使用的仪器设备相对比较昂贵，所以不适应现场的快速检测。
总体来说，腹泻病原菌的快速检测方法在卫生检验方面目前尚存在定性与精确定量难以兼顾的状况。分子生物学方法是腹泻病原菌检测的主要发展方向，尤其是多重PCR技术和DNA指纹图谱以及脉冲场凝胶电泳得到了快速发展。将生物芯片技术或多重PCR技术与荧光探针定量技术相结合，可以使病原菌的检测逐步向敏感性高、特异性强、重复性好、简便经济的方向发展。
国内也已有HCV检测及区分五种丙肝亚型的多重试剂盒、HPV分型多重联检试剂盒、检测呼吸道11种RNA和1种DNA病毒的多重PCR试剂盒等上市，这是针对病毒进行检测的产品，极大地丰富了这一方面的检测手段。
但是，鉴于检验人员习惯于使用培养方法检测细菌，目前没有研究人员和公司着力提供PGR检测细菌的方法以及相应的物质或者物质组合。本发明人注意到了这一空白，提供了采用PCR建立检测细菌的方法，实施细菌检测的方法以及临床用途，也可以用于卫生防疫以及流行病调查等。本发明也提供了同时检测多种致腹泻大肠埃希菌的试剂盒。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种可同时检测多种致腹泻大肠埃希菌的方法。
本发明另一目的在于提供了同时检测多种致腹泻大肠埃希菌的试剂盒。
本发明还有一个目的，在于提供用于同时检测多种致腹泻大肠埃希菌的多种引物对。
具体而言，本发明提供了一种PCR试剂盒，用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测，该试剂盒包括：
1).五种引物对中的一种或两种至五种的组合，五种引物对分别特异于基因
eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI；
2).PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTP；
3).对应1)中各种组合的标准阳性模板；以及
4).一份进行PCR反应的说明书；
5).上述1)到4)被包装在包装材料中。
进一步地，本发明的PCR试剂盒，所述多种引物对是分离装配于试剂盒中，使用时按照需要选择。
进一步地，本发明的PCR试剂盒，所述多种引物对可以以两种至五种组合混合后装配于试剂盒中；当混合装配引物对时，混合引物对按eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI五种引物对的摩尔数10～15∶15～20∶1∶15～25∶20～30比例混合；当五种引物对混合时，优选使各引物对在反应体系中的终浓度依次为418、482、32、627、739nmol/L的混合物。
本发明PCR试剂盒中，所述五种引物对分别为：
1)特异于基因eaeA引物对：
其中一个序列是：AACATTATGGAACGGCAGAGGT；
另一个序列是：GTAAAGCGGGAGTCAATGTAACG；
2)特异于基因aggR引物对：
其中一个的序列是：GCTGATGCTGACGATTCTGTATT；
另一个的序列是：TCCTTCTCGATTGTGTTTCTGAC；
3)特异于基因ipaH引物对：
其中一个的序列是：GCGCTCACATGGAACAATCTC；
另一个的序列是：TCACTCCCGACACGCCATAG；
4)特异于基因lt引物对：
其中一个的序列是：GCATAATGAGTACTTCGATAGAGGA；
另一个的序列是：TCACACCAAAATTAACACGATACC；
5)特异于基因stxI引物对：
其中一个的序列是：CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；
另一个的序列是：TAGGTACAATTCTGGCAACTCG。
具体而言，本发明提供了一种用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测的方法，该方法包括：
1).合成以上所述五种引物对，它们分别特异于五种致腹泻大肠埃希菌的基因；
2).提供PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTP；
3).形成一个PCR反应体系，其中使用两种至五种组合的引物对，对未知核酸样品进行PCR反应；
4).确定扩增产物的组成，所述扩增产物的组成反映致腹泻大肠埃希菌分型。
进一步地，所述检测方法中每一种引物对在反应体系的终浓度范围为从1nmol/L到1000nmol/L，优选终浓度在30nmol/L到800nmol/L之间；五种引物对同时使用时，最优选eaeA、aggR、ipaH、lt、和stx1五对引物对终浓度分别依次为418.2nmol/L、482.5nmol/L、32.2nmol/L、627.3nmol/L、和739.9nmol/L。
另一方面，本发明用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测PCR试剂盒中的引物对也属于本发明保护内容。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、简便，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。
2、快速，整个过程可在3h内完成，而传统的分离培养鉴定方法繁琐、费时。
3、与核酸杂交相比，更敏感、快速。
4、特异，核酸配对的特性决定了只能对互补的序列进行扩增。
5、系统性，通过一次反应即可同时对五种致腹泻大肠埃希菌进行初步筛查。
附图说明：
图1显示扩增结果，显示五种引物优化后多重PCR扩增结果。在图1中，从左边到右边，第一道是标准分子量，以M标示，后面的各道分别用数字1到6标示。分子量标准M是100bp ladder；1为优化后五重引物PCR扩增五种DEC；2～6单引物、单模板分别扩增五种DEC。特异序列分别为：EHEC、ETEC、EIEC、EAEC、EPEC。
图2显示多重PCR反应对五种大肠埃希菌的任意组合进行扩增的结果(分别以图2-A和图2-B命名)。其中包括：
单菌P、A、I、T、H；
两种菌PA、PI、PT、PH、AI、AT、AH、IT、IH、TH；
三种菌ITH、ATH、AIH、AIT、PTH、PIH、PIT、PAH、PAT、PAI；
四种菌AITH、PITH、PATH、PAIH、PAIT；
五种菌的组合PITHA。
上述单字母简称分别来自表1所列五种菌株的英文简称的第二个字母，即P代表EPEC，A代表EAEC，I代表EIEC，T代表ETEC，以及H代表EHEC。所以，上面关于图2中有关五种大肠埃希菌的任意组合的说明应该如此理解，比如两种菌中的两字母联合PA代表EPEC和EAEC菌株的组合，三种菌中的三字母联合ITH表示EIEC、ETEC和EHEC三种菌株的组合。其余依次类推。并且，这里的说明也适用于本申请说明书的其它部分。其它部分中也有使用上述单字母的情况，具有相同解释和指代。
图2-A显示五对引物扩增单模板和双模板的结果。在图2-A中，从左到右，泳道依次用英文小写字母标示。其中a、g、r：100bp ladder；b～f对应的模板：H、T、I、A、P；h～q对应的模板：TH、IH、IT、AH、AT、AI、PH、PT、PI、PA。
图2-B显示五对引物扩增三模板和四模板的结果。在图2-B中，从左到右，泳道依次用英文小写字母标示。其中a、g、r：100bp ladder；b～f对应的模板：PAIT、PAIH、PATH、PITH、AITH；h～q对应的模板：PAI、PAT、PAH、PIT、PIH、PTH、AIT、AIH、ATH、ITH。
图3是关于多重PCR方法的敏感性的实验结果。在图3中，从左到右，泳道依次用英文大写字母M和数字1到6标示，其中：
M：100bp ladder；
1～6模板菌量分别为(CFU)：3.2×102、1.6×103、8×103、4×104、2×105、106
由图3中可以看出，PCR方法扩增五个模板时，只有当每个反应中菌量不少于106时，5对引物的多重PCR才能同时扩增出5条带。
具体实施方式：
本发明提供了一种对含大肠埃希菌的样品进行检测的试剂盒。该试剂盒包括：反应液，聚合酶，至少一种引物以及使用说明书。引物为一种或两种至五种的组合，表现为多种引物组合使用或多种引物形成混合物后使用，五种引物对分别特异于基因eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI；通过按照使用说明书进行PCR反应，可以确定样品中的大肠杆菌的类型，其中所述类型是指根据致病性而确定的分类类型，包括：但不限于，ETEC(肠产毒素型大肠杆菌)；EIEC(肠侵袭型大肠杆菌)；EPEC(肠致病型大肠杆菌)；EHEC(肠出血型大肠杆菌)；EAEC(肠集聚型大肠杆菌)。
该试剂盒中，所述“多种引物形成混合物”，是指不同的引物按质量比(摩尔比)混合而成的混合引物；所述“多种引物组合”是指不同引物组合使用，包括将各自引物分别独立包装，使用时有针对性地选择并混合，也包括将不同引物两种至五种组合先行混合后形成混合引物后再选择使用。
具体的，该试剂盒中，引物包括至少可以扩增一种菌株的可区分基因的引物，特异于至少一种大肠埃希菌类型。
具体的，该试剂盒中，引物包括至少可以扩增两种不同菌株的可区分基因的引物，它们分别特异于两种不同大肠埃希菌类型。
具体的，该试剂盒中，引物可以是三种引物的组合，它们分别特异于三种不同大肠杆菌类型；引物可以是四种引物的组合，它们分别特异于四种不同大肠杆菌类型；更具体的，引物可以是五种引物的组合，它们分别特异于五种不同大肠杆菌类型。
当然，本发明试剂盒中还可以引入特异于更新类型的第六种、第七种......引物，那么，引物也可以包括加入新引物的六种、七种......引物的组合，它们分别特异于六种、七种......不同大肠杆菌类型。
也就是说，本发明试剂盒中的引物不限于是前述具体列举的两种至五种组合的方式，可以是五种以上的六种、七种......引物组合，可以将大肠杆菌分为更多的类型。或者随着大肠杆菌的新类型的发现，本发明的引物种类可以进一步增加。
本发明前述内容可以作出各种变化和扩展，这些也在本发明之中。采用PCR技术进行细菌鉴定、细菌种类确定是本发明的一个方面。自然包括从基因组开始的基因筛定和特定引物的序列确定以及合成。也可以仅仅包括比较基因、确定区别性基因，合成引物进行检测。总之，本发明有多种变化，有多种应用形态和领域。只要不背离本发明的精神和实质，就是在本发明的范围之内。
在更广泛的一个方面，本发明提供的方法包括：从不同的欲被检测的生物对象中确定出一系列基因，这些基因是针对某一类型生物特异的，用于这些基因扩增的引物具有序列上的可以区分的差异；合成这些引物，通过组合使用这些引物，在PCR扩增体系中进行一次性扩增，可以产生有大小差别的产物；通过显示这些产物，确定相应欲被检测生物是否存在。
在一个实施方案中，本发明提供的方法包括：从两种、三种或四种、五种生物对象或者生物材料中确定出两个、三个或四个、五个基因，这些基因是分别针对各种类型生物特异的，用于这些基因扩增的引物也具有序列上的特异性；合成这些引物，配制引物混合物；在PCR扩增体系中进行一次性扩增，可以产生有大小差别的产物；通过显示这些产物，确定相应欲被检测生物或者生物材料的存在与否。例如，不同基因的PCR产物具有100个pb的差异，而扩增这些基因的引物也是特异的，如果较大基因是生物对象或者生物材料(通称个体A)的，而较小基因是另一个生物对象或者生物材料(通称个体B)的，那么对一个样品的扩增结果可以用来判定A、B的存在与否。
代表每一种生物或者生物材料的基因个数不一定限于一个，也可用几个基因及其相应引物鉴定某一生物物种或者生物材料的存在与否。同样地，每一基因扩增中所用的引物可以是单一的，也可以是引物对。优选使用单一引物，特别是欲区分对象个数增加的情况下。
目的基因选择的是细菌的特异基因，此基因在其它细菌中不存在，通过鉴定此基因的有无即可推断出其对应的细菌是否存在。一般为细菌的毒力相关基因，也可能为其它与毒力无关的基因，以有利于检测为原则。
进一步地，对于新的物种，本发明的方法可以进一步包括对其基因组进行测序，从中确定某个基因或者几个基因作为其区别标志，通过合成相应引物进行扩增，可以对环境样本进行鉴定。
本发明的检测方法以大肠埃希菌为例进行了说明。当前，依据致病性，大肠埃希菌主要有五个类型。最优选地，本发明包括：从五种类型的大肠埃希菌中，各确定一个代表性基因；这些基因扩增的产物大小上有差异，该差异可以检测出来；合成这些基因扩增所需要的引物，进行PCR扩增；根据扩增结果，确定样品中大肠埃希菌的类型。
在本发明方法的具体实施方式中，检测对象是含有五种致腹泻大肠埃希菌P、A、I、T、H的样品；目标基因(也就是被扩增基因)依次对应是eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI；采用的引物对依次对应为(eae_F4，eae_R4)、(agg_F2，agg_R2)、(ipaH_F1，ipaH_R1)、(lt_F2，lt_R2)、(stx1A_F3，stx1A_R3)；扩增产物的大小分别是146bp、185bp、268bp、326bp、367bp。(实施例1)
在最终反应体系中，上述每一种引物在反应体系的使用终浓度可以是从1nmol/L到1000nmol/L之间的任何一个浓度。优选地，每一种引物的浓度是在30nmol/L到800nmol/L之间。
按照多重PCR的实验流程，最初在多重PCR反应中使用相同引物浓度(约为0.2μmol/L)时，扩增结果并不均一，即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显，各对引物对模板的扩增效率不同，其中ipaH的扩增效率最高，stx1扩增效率最低。通过调整不同引物的浓度，增加弱条带的引物量，减少亮条带的引物量，通过反复调整，可以获得比较均一的扩增产物。因此，在本发明的精神和范围内，本领域普通技术人员可以对引物的终浓度及其比例作出各种变化。
并且引物之间的浓度比例可以影响多重PCR扩增结果，优选的是：第一个引物对的两条引物浓度相同，其它各对引物对中的两条引物浓度也是相同的。
当五种引物对形成混合物后使用时，使分别特异于基因eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI的五种引物对在反应体系中的终浓度依次接近或达到418、482、32、627、739nmol/L。当五对引物按照上述要求的比例混合后进行扩增，五条扩增产物的片段产量基本一致，体现为电泳结果中各条带的亮度差别不大。实际上，引物的比例以及扩增后条带的可区分程度不是一个很严格的要求，本领域技术人员可以作出各种调整。优选的是，扩增后条带亮度相当，以便区分。
本发明的具体实施中，检测对象是五种致腹泻大肠埃希菌P、A、I、T、H的两种或者三种或者四种的混合样品，或者检测对象是五种致腹泻大肠埃希菌的五种类型的单一类型样品。通过运用上述PCR试剂盒，对一个从一种未知类型或者多种未知类型的致腹泻大肠埃希菌样品或者培养物所提取的核酸样品进行PCR反应，依据所得到的扩增产物类型确定该致腹泻大肠埃希菌样品或者培养物是单一类型还是多种类型混合物，以及其中的致腹泻大肠埃希菌究竟是何种类型。在选定引物的时候，主要是其扩增产物具有可以区分性，即产物的大小最好能用简单的琼脂糖凝胶电泳的方法进行区分。同时，应该考虑这些基因扩增所用引物具有对应于相应基因的特异性。检测目标可以是一个物种内部的进一步区分问题，也可以是不同物种之间的区分问题。关键在于利用扩增产物进行区分的技术方法。引物的设计和各种条件的选择是可以确定的。
本发明的关于五种致腹泻大肠埃希菌中所针对的基因，可以有其它的选择。在这些类型的基因组研究中，可以确定出不同的有区别性的基因，这些代表类型特异性的基因可以构成本发明各种改变方式的基础。也就是选定的目标基因可以不同于本发明具体描述的五个基因eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI构成的组合。
基因的可区分性，最显着的是其扩增产物的大小有差异，如果存在其它可以区分的办法也是可行的。
在广泛意义上，本发明提供这样一个技术方案，即对比要区分的多个对象(比如两个，三个或者更多)的基因组序列，选定各个对象中所存在的基因组中的一个片段，针对这些片段合成引物，形成引物混合物，进行PCR扩增。所以，本发明的扩增部分(即本文有时称作目标基因)可以是天然上不具有编码功能的基因组部分。因此，虽然本文在很多时候使用了目标基因，但是该目标基因可以是无意部分，即它们在自然状况下并不编码蛋白质。
本发明提供了一种对含大肠埃希菌的样品进行检测的试剂盒。该试剂盒包括：反应液，聚合酶，单一引物对或引物对混合物以及使用说明书。通过按照使用说明书进行PCR反应，可以确定样品中的大肠埃希菌的类型，其中所述类型是指根据致病性而确定的分类类型。引物混合物是两种至五种引物组合的混合物，它们分别特异于两种至五种不同大肠埃希菌类型。进一步，本发明的引物混合物可以是五种以上的引物混合物，可以将大肠埃希菌分为更多的类型。或者随着大肠埃希菌的新类型的发现，本发明的引物混合物中的引物种类可以进一步增加。
更具体地，也是示例性的，本发明的一个目的在于提供一种快速、敏感、特异检测五种大肠埃希菌的多重PCR试剂盒，该PCR试剂盒能在进行普通PCR的实验条件下进行操作，并能做到同时对五种致腹泻大肠埃希菌进行筛选。
详细的，本发明快速、敏感、特异检测五种大肠埃希菌的多重PCR试剂盒包括：
①多重PCR反应液，
②Taq DNA聚合酶，
③多重PCR反应液为优化好的反应体系，其中反应体系中各成分的浓度经反复摸索得到，且反应液中含有五种致腹泻大肠埃希菌的特异引物，如表2所示：
表2.五种致腹泻大肠埃希菌的引物及产物大小
病原种类 目标基因 引物及序列 引物长度 (nt) Tm值 (℃) 产物大 小(bp)EPEC和EHECEAECEIECETECEHEC eaeA aggR ipaH lt stx1 eae_F4，AACATTATGGAACGGCAGAGGT eae_R4，GTAAAGCGGGAGTCAATGTAACG aggR_F2，GCTGATGCTGACGATTCTGTATT aggR_R2，TCCTTCTCGATTGTGTTTCTGAC ipaH_F1，GCGCTCACATGGAACAATCTC ipaH_R1，TCACTCCCGACACGCCATAG lt_F2，GCATAATGAGTACTTCGATAGAGGA lt_R2，TCACACCAAAATTAACACGATACC stx1A_F3，CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG stx1A_R3，TAGGTACAATTCTGGCAACTCG 22 23 23 23 21 20 25 24 25 22 54.2 54.7 52.8 52.6 54.6 55.8 51.0 52.6 51.3 51.4 146 185 268 326 367
④标准阳性模板是五条特异扩增条带插入T载体构成的，且该载体可在DH5α和BL21中增殖。
上述发明的试剂盒是新颖的。重要的概念在于：特异于不同的致腹泻大肠埃希菌的引物，和同时进行的PCR反应。
上述发明的试剂盒是新颖的。重要的概念在于：特异于五种不同的致腹泻大肠埃希菌的引物，以及反应体系中各引物的优化浓度，和同时进行的PCR反应。
上述发明的试剂盒是新颖的。重要的概念在于：特异于五种不同的致腹泻大肠埃希菌的引物，以及反应体系中各引物的优化浓度，和同时进行的PCR反应是在一次反应中完成的。
在本发明的一个实施方案中，针对一种被区分单元的引物对是针对一个非编码序列的，针对另外一个被区分单元的引物对是针对一个编码序列的。
本发明包括这样的技术方案，即存在至少两种以上的需要区分鉴定的对象(分别称为第一对象，第二对象，等等)，从第一对象的基因组中确定一个扩增片段(称为第一扩增片段)，从第二对象的基因组中确定一个从大小上与前述第一对象的第一扩增片段不同的扩增片段(称为第二扩增片段)，以及设计针对上述第一扩增片段和第二扩增片段的引物对(分别称为第一引物对和第二引物对)，将有可能包含第一对象和/或第二对象的核酸提取物的样品进行PCR反应，依据扩增结果确定所述样品是否包含所述第一对象和/或第二对象。
本发明也可以包括这样的技术方案，即存在至少两种以上的需要区分鉴定的对象(分别称为第一对象，第二对象，等等)，从第一对象的基因组中确定一个扩增片段(称为第一扩增片段)，从第二对象的基因组中确定一个从大小上与前述第一对象的第一扩增片段不同的扩增片段(称为第二扩增片段)，以及设计针对上述第一扩增片段和第二扩增片段的引物对(分别称为第一引物对和第二引物对)，将有可能包含第一对象和/或第二对象的核酸提取物的样品进行PCR反应，依据扩增结果确定所述样品是否包含所述第一对象和/或第二对象。本发明的技术方案可以进一步包括：用第一对象和第二对象的核酸样品，以及第一引物对和第二引物对，进行系列PCR反应，分析所得结果在区分第一对象和第二对象上的差异，从而优化出最佳反应条件。
本发明也可以包括这样的技术方案，即存在至少两种以上的需要区分鉴定的对象(分别称为第一对象，第二对象，等等)，从第一对象的基因组中确定一个扩增片段(称为第一扩增片段)，从第二对象的基因组中确定一个从大小上与前述第一对象的第一扩增片段不同的扩增片段(称为第二扩增片段)，以及设计针对上述第一扩增片段和第二扩增片段的引物对(分别称为第一引物对和第二引物对)，将有可能包含第一对象和/或第二对象的核酸提取物的样品进行PCR反应，依据扩增结果确定所述样品是否包含所述第一对象和/或第二对象。本发明的技术方案可以进一步包括：用第一对象和第二对象的核酸样品，以及第一引物对和第二引物对，进行系列PCR反应，分析所得结果在区分第一对象和第二对象上的差异，从而优化出最佳反应条件。本发明还可以任选包括制作标准图谱、制备标准参照物等，从而确保鉴定分析的准确性。
本发明可以适用于已知所区别对象具有标志性蛋白质的情况。所以，本发明可以对现有的基于免疫反应的鉴定分析进行改造或者建立联合分析实验。通过标志性蛋白质，从基因组中钓出所述标志性蛋白质的基因，合成针对标志性蛋白的基因的引物对。针对每一个被区分的单元，可以是细胞类型、微生物菌株、或者某种病原体的各个类型，合成出相应的引物对。利用多种引物对，以包括欲区别对象的核酸提取物作为模板进行PCR扩增，用扩增结果区分所区别对象。
本发明可以适用于已知所区别对象具有个体特异性序列的情况。合成针对个体特异性基因的引物对。利用多种引物对，以包括欲区别对象的核酸提取物作为模板进行PCR扩增，用扩增结果区分所区别对象。
本发明可以适用于已知所区别对象具有个体特异性序列的情况。合成针对个体特异性基因的引物对。利用多种引物对，以包括欲区别对象的核酸提取物作为模板进行PCR扩增，用扩增结果区分所区别对象。本发明的一个区分方式是扩增产物的大小，这可以通过凝胶电泳确定。但是，本发明并不限于这种方式。
本发明的欲扩增片段可以是基因，也可以是非编码片段。因此，本发明的实施是从一个鉴定对象的基因组中选定一个可以扩增的片段，设计引物，以该可以扩增的片段作为模板，进行一个PCR反应；从产物的状况来确定被鉴定对象的存在和数量等信息。
在一个方面，本发明的引物种类确定的PCR反应，可以确定一个样品中的各个生物类型的组成状况。
在又一个方面，本发明的引物数量和其它条件可以严格控制，从而实现扩增产物的相对定量，也就是本发明可以确定一个样品中的各个生物类型的相对含量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1五种纯培养的致腹泻大肠埃希菌多重PCR方法的构建
(1)模板的制备：
得到五种纯培养的致腹泻大肠埃希菌，分别是EPEC、EAEC、EIEC、ETEC和EHEC，本实验中选用的为肠致病性大肠埃希菌EPEC2348/49、肠集聚性大肠埃希菌EAEC17-2、肠侵袭性大肠埃希菌EIEC8401、肠出血性大肠埃希菌EHEC882364、肠产毒性大肠埃希菌ETEC44824，这些菌可以商业获得，例如购自中国药品生物制品检定所。在本文中，为了描述简洁，代号依次为EPEC(代号P)、EAEC(代号A)、EIEC(代号I)、EHEC(代号H)、ETEC(代号T)。
分别取菌液400μl加入到1.5ml离心管中，13,000rpm离心1min，弃上清，向离心管中加入400μl去离子水吹打，使沉淀完全重悬，13,000rpm离心1min，弃去上清，加入300μl去离子水吹打混匀，水浴中煮沸10min，迅速放于冰上冷却1min，13,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离心管中-20℃保存备用。使用时取1μl作为单重PCR反应的模板。
按等比取上述五种不同菌液制备的模板混合得到多重PCR反应的模板。
(2)反应体系及反应条件：
五对引物：以表2列出的序列为引物序列。
单重PCR的反应体系和扩增条件：1.5×PCR Buffer，250μmol/L dNTPs，1U rTaqDNA聚合酶，各个反应中取引物1μl(引物的保存浓度为20μM)，加入50μl的反应体系中，使引物在反应体系中的终浓度为400nmol/L；94℃预变性5min后，按94℃30sec、52℃30sec、72℃45sec进行30个循环，然后72℃延伸7min，4℃保存。
多重PCR扩增体系和扩增条件：1.5×PCR Buffer，250μmol/L dNTPs，3U rTaqDNA聚合酶，反应体系中eaeA、aggR、ipaH、lt、stx1五对引物在反应体系中的终浓度分别为418.2nmol/L、482.5nmol/L、32.2nmol/L、627.3nmol/L、739.9nmol/L；94℃预变性5min后，按94℃30sec、52℃30sec、72℃45sec进行30个循环，然后72℃延伸7min，4℃保存。
(3)鉴定：分别取上述单重PCR扩增和多重PCR扩增得到的PCR产物15μl，在2.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压为80V，电泳时间为90min。扩增片段大小正确的条带进行回收、连接T载体并测序，结果与GeneBank序列进行比较，序列正确。单重扩增结果如图1中2～6泳道所示，多重PCR扩增结果如图1中泳道1所示。
通过图1结果显示，本发明的混合引物及其反应条件可以扩增出能够通过电泳方法区分的产物。图1显示本发明多重PCR扩增的条带(泳道1)和单重PCR的条带(泳道2-6)具有对应关系，说明本发明的多重PCR的扩增情况良好，多重PCR的技术方案的效果是很好的。
在上述致腹泻大肠埃希菌多重PCR方法的构建中，五对引物在反应体系中的终浓度分别可以是从1nmol/L到1000nmol/L之间的任何一个浓度，电泳结果均能显示出对应条带，但终浓度在30nmol/L到800nmol/L之间时条带更为明显，而eaeA、aggR、ipaH、lt、stx1五对引物终浓度依次为418.2nmol/L、482.5nmol/L、32.2nmol/L、627.3nmol/L、739.9nmol/L时条带显示效果最优。
另外，包含二种至四种引物对的多重PCR扩增体系和扩增条件与五对引物的相同，只是各引物在反应体系中的终浓度可以依据条带的显示效果进行优化，其终浓度之间的比例可以参考以上五种之间的比例进行适当调整，例如混合引物对按eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI五种引物对可参考其摩尔数(或质量数)以10～15∶15～20∶1∶15～25∶20～30的比例混合，那么可以使两两混合的引物对或三个之间混合的引物对或四个之间混合的引物对在反应体系中的终浓度达到一个比较优化的数值，使得对应每一引物的条带均显示得比较清晰，在此不一一例举。
实施例2 五种纯培养的致腹泻大肠埃希菌检测
1)特异性的检测：
培养其它相关细菌(参见表3所列)并分别制备DNA模板，然后用实施例1中的相关方法分别用五种引物对相关细菌进行交叉单重PCR扩增，验证引物的特异性。在表3所列的相关细菌中，除了EPEC外，EHEC菌株也含有eae基因，根据eae基因设计的引物，既能扩增EPEC，还能以EHEC为模板扩增出146bp的条带。另外，EIEC和志贺氏菌都含有ipaH基因，针对EIEC的ipaH基因设计引物，也能对志贺氏菌进行扩增，获得268bp特异性片段。其它三对引物只能扩增对应的模板，与其它相关菌株均无交叉。结果如表3所示：
表3. 引物特异性的检测
2)多重PCR检验：
用实施例1描述的多重PCR反应对由五种大肠埃希菌的任意组合进行扩增，包括单菌P、A、I、T、H；两种菌组合PA、PI、PT、PH、AI、AT、AH、IT、IH、TH；三种菌组合ITH、ATH、AIH、AIT、PTH、PIH、PIT、PAH、PAT、PAI；四种菌组合AITH、PITH、PATH、PAIH、PAIT；五种菌的组合PITHA。扩增结果如图2-A和图2-B所示。其中图2-A是关于五对引物扩增单模板和双模板的实验结果；图2-B显示五对引物扩增三模板和四模板的结果。在图2-A中，从左到右，泳道依次用英文小写字母标示。其中a、g、r：100bp ladder；b～f对应的模板：H、T、I、A、P；h～q对应的模板：TH、IH、IT、AH、AT、AI、PH、PT、PI、PA。
在图2-B中，从左到右，泳道依次用英文小写字母标示。其中a、g、r：100bp ladder；b～f对应的模板：PAIT、PAIH、PATH、PITH、AITH；h～q对应的模板：PAI、PAT、PAH、PIT、PIH、PTH、AIT、AIH、ATH、ITH。
以上扩增结果显示，用建立好的多重PCR方法扩增由五种DEC的所有组合，每个反应均能得到预期的与模板相对应的扩增条带，说明本发明所建立的多重PCR反应体系中，加入的目的核酸从1～5种时，均能获得有效的扩增，得到有效的区分，提示其具有较好的检测效果。
3)敏感性的检测：
用实施例1中多重PCR方法对单一菌的模板进行扩增时，其每个反应能检测到的最低菌量与单重PCR方法相同，对于五种菌EPEC、EAEC、EIEC、ETEC、EHEC的混合模板来说分别为2.88×102、8.77×103、5.1×101、1.68×104和1.31×105CFU/反应，如表4所示：
表4.多重PCR方法的敏感性
原浓度(CFU/ml) 检测到的最低稀释 度 敏感度(CFU/反 应) EPEC EAEC EIEC ETEC EHEC 2.25×109 2.74×109 1.98×109 5.25×109 1.64×109 5-6 5-4 5-7 5-4 5-2 2.88×102 8.77×103 5.1×101 1.68×104 1.31×105
多重PCR方法扩增五个模板结果参见图3，在图3中，从左到右，泳道依次用英文大写字母M和数字1到6标示，其中：M：100bp ladder；1～6模板菌量分别为(CFU)：3.2×102、1.6×103、8×103、4×104、2×105、106。由图3中可以看出，只有当每个反应中菌量不少于106时，5对引物的多重PCR才能同时扩增出5条带。
五种DEC过夜培养菌调整至等浓度后，等量混合并进行5倍稀释，用煮沸裂解法提取DNA作为多重PCR反应的模板，使其每种菌的最高浓度为106CFU/反应，结果显示，只有当每个反应中菌量不少于106CFU时，五对引物的多重PCR才能同时扩增出5条带；模板浓度为2×105CFU/反应时，能扩增出四条带，EHEC对应的条带未扩出；模板浓度为4×104CFU/反应时，四条条带均变模糊，且EIEC对应的条带仅能隐约可见。实验中观察到，多重PCR中五条带都扩增时的敏感性比单重PCR中的敏感性降低了大约一个数量级，而如果多重PCR扩增的模板中只有五种大肠埃希菌中的一种，即多重引物扩增单模板时，其敏感性与单重PCR相同。由于临床上五种大肠埃希菌混合感染不可能存在，常见的是只感染其中的一种甚至是两种，相对应的，本发明建立的多重PCR方法每个反应中能检测到的最低菌量要低于106CFU，而与单重PCR的敏感性相近。
实施例3：检测多种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR试剂盒组成与配制
基于以上所述和本申请其它部分的叙述，本发明设计了下述的试剂盒，所述试剂盒包括的要素有：
多种引物：这些引物可以是各自单独包装的，也可以多种引物配制成一个混合溶液包装在一个容器中；
反应体系：包括缓冲溶液、dNTP的混合物、聚合酶。
其中，如果这些引物是单独包装的，可以分别单独包装五种引物，使用时按说明书配制使用；如果这些引物是混合包装的，则可以从五种引物中选择两种、三种、四种或五种组合配制成混合溶液各自包装在一个容器中；
具体的，试剂盒终包括以下材料：
(1)dNTPs为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；rTaq酶为宝生物工程(大连)有限公司产品；琼脂糖BW-R0100购自BIOWEST公司；PCR产物回收试剂盒为Promega SV Minipreps DNA Purification System；DNA marker为TIANGEN100bp DNA ladder；其余试剂均为常规分析纯。LB细菌培养基、50×TAE(贮存液)、1×TAE(工作液)、磷酸盐缓冲液(PBS)等常用试剂参照《分子克隆实验指南》配制。
(2)1×PCR Buffer的组成：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，2mmol/LMgCl2。
(3)操作说明书：参见实施例1的描述，其中主要说明多重PCR模板的制备以及PCR反应体系的组成：1.5×PCR Buffer，250μmol dNTPs，1μl多重PCR模板，3U rTaq DNA聚合酶，提示eaeA、aggR、ipaH、lt、stx1五对引物在反应体系的终浓度分别为418.2nmol/L、482.5nmol/L、32.2nmol/L、627.3nmol/L、739.9nmol/L时最优。
(4)标准阳性对照：标准阳性模板是五条特异扩增条带插入T载体构成的，且该载体可在DH5α和BL21中增殖。
(5)引物组成：可按表5组配：
表5 试剂盒中引物的组合及浓度
标号 设计方案 引物名称 引物保存 浓度(μM) 引物使用 浓度(nM) 适用对象 1 2 3 4 5 五种单独 eaeA aggR ipaH lt stx1 20 20 20 20 20 400 400 400 400 400 与其它方法同时使 用，对怀疑的细菌进 行鉴定 6 五种混合 eaeA aggR ipaH lt stx1 1.79 2.07 0.14 2.69 3.31 418.2 482.5 32.2 627.3 739.9 对未知细菌进行初筛
实施例4检测五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR试剂盒与传统的检测大肠埃希菌方法的比较
鉴定致腹泻大肠埃希菌的经典方法为生化鉴定和血清凝集，但目前只有抗EIEC、EPEC、ETEC的诊断血清，而且上述血清不能覆盖所有的这三种细菌菌株，有些细菌之间还有交叉凝集现象。发明人对本实验室分离的细菌用单重PCR的方法进行筛选，共得到了16株致腹泻大肠埃希菌，分别用本发明多重试剂盒与经典的血清凝集方法进行分型，验证本发明多重PCR的检测结果。
多重PCR方法：
样品：将已知16株致腹泻大肠埃希菌作为待测样品，细菌浓度为108CFU/ml，采用实施例1中的煮沸裂解法制备模板。
试剂盒组成：实施例3中标号6的试剂盒。
操作过程：采用实施例1中的多重PCR操作，其中取五种混合引物11.5μl加入到50μl的反应体系中。
结果：如表6所示：
表6.三种检测方法的比较
阳性菌株数 单重PCR 多重PCR 血清凝集 EPEC EAEC EIEC ETEC EHEC 6 5 2 2 1 6 5 1 2 1 6 - 2 2 -
采用本发明建立的多重PCR方法鉴定这16株致腹泻大肠埃希菌，共有15株扩增阳性，其中EPEC 6株，EAEC 5株，EIEC 1株，ETEC 2株，EHEC 1株，得到的结果与单重PCR方法相比，符合率达到93.8％；与经典的血清凝集方法相比，血清凝集方法没有诊断出血清的EAEC、EHEC，多重PCR方法对其它三种菌的鉴定结果只有一株与血清凝集方法和单重PCR方法鉴定的结果不符。
从以上实验可以看出，本发明建立的多重PCR方法，可以进行临床分离菌株的初步筛选，并获得比较可靠的结果，而且具备单重PCR方法所没有的简便、节约的优点。