技术领域
本发明涉及一种酪醇的制备方法，属于属于红景天中酪醇提取、分离纯化及精制领域。
背景技术
酪醇是一种天然的抗氧化剂，是红景天药材中的主要活性成分之一，是苯乙醇的一种衍生物。其具有极强的抗心肌缺血、缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡数，降低缺血再灌注动物室性心动过速和室颤的发生率及严重度。同时还能提高喂高胆固醇饲料的敲除低密度脂蛋白受体小鼠的抗氧化能力，并降低被升高的血胆固醇和甘油三酯水平。
酪醇可以显著提高柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心脏中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低血清乳酸脱氢酶活性和过氧化脂质含量，对心脏有很好的保护作用，临床上主要用于治疗心血管方面疾病。
目前提取分离酪醇的方法主要有：
高山红景天中红景天苷、苷元酪醇、香豆素的生产工艺(王化田,东北农业大学硕士论文)公开了一种红景天中酪醇提取方法，具体是：采用超临界萃取后的粉渣，用40％乙醇浸泡提取，提取液过滤浓缩，浓缩液上大孔树脂，乙醇-二氯甲烷(3:7)洗脱后，浓缩至干，少量蒸馏水溶解，过滤，浓缩至小体积，真空冻干，得到红景天苷和酪醇的提取物，其中红景天苷和酪醇含量之和约为80％，收率为0.27％。该方法提取过程中大量使用了二氯甲烷，其毒性较大，导致产品存在安全隐患，且酪醇收率较低，极大的浪费药材。
橄榄多酚中酪醇等成分的分离纯化研究(黄北川.西北大学硕士论文)公开了一种酪醇提取分离方法，具体是：采用了超声提取，提取条件为：温度为60，时间为20min，料液比为1:25。提取液采用硅胶柱层析法分离酪醇，分出的酪醇纯度为85.81％。用氧化铝吸附法分离酪醇纯度为40％。该方法提取酪醇是采用硅胶柱层析法进行分离，由于硅胶柱死吸附较严重，导致酪醇损失较多，且产业化过程中会用到大量的有机溶剂，对操作工人身体不利；由于大量的使用有机溶剂且分离过程使用的硅胶柱无法重复利用，导致酪制备过程中成本较高。
红景天苷和红景天苷元标准品的制备方法研究(丁朝武.分析测试学报,1997,16(1):38-41)公开了酪醇标准品的制备方法，其具体是采用了超声提取，提取液加醋酸铅溶液除鞣质、黄酮等，后用活性炭吸附除色素，最后经膜过滤后用制备色谱柱进行分离，得到的酪醇纯度为97％。该方法采用制备色谱来进行分离，仅仅只能适应实验室的分离，无法实现产业化。
红景天中红景天苷和酪醇提取工艺研究(李辰,陈东生,陈娟等.中药材,2006,29(11):1239-1241)公开了酪醇提取工艺，其是采用了80％乙醇回流提取，溶剂用量为6倍，提取2次，每次2小时。贺美艳，张小龙.唐古特发表的红景天提取工艺研究(中国现代应用药学,2012,29(6):495-497)公开了酪醇提取方法，其是采用了8倍量50％乙醇80℃时回流提取，提取2次，每次1小时。马涛,熊春媚,张忠华发表的正交试验法提取云南大花红景天中的红景天苷和酪醇(昆明师范高等专科学校学报,2006,28(4):14-16)公开了酪醇的提取方法，其实采用了65℃时用90％甲醇或无水甲醇超声提取，提取时间为15分钟，料液比为1:20。得到的酪醇含量为0.015％。专利名称为一种乙醇为夹带剂的苷元酪醇CO2超临界萃取方法开了一种提取酪醇的方法，其实采用超临界萃取的方法提取酪醇，得到酪醇的提取率为1.637％。这些方法均是初步的提取研究，其分别采用了回流提取、超声提取和超临界萃取，没有进一步分离纯化酪醇，因此纯度均较低。
专利名称名称为一种提纯橄榄多酚粗品中酪醇的方法公开了另一种提取酪醇的方法，具体是将橄榄多酚粗粉用酸水溶液溶解，将氯化钠加入上述橄榄多酚溶液中，制得食盐饱和的橄榄多酚溶液；用乙酸乙酯萃取食盐饱和的橄榄多酚溶液中的酪醇；除去乙酸乙酯萃取相中的水分。液相法测得乙酸乙酯相中酪醇含量为70％-90％。该方法得到的酪醇纯度较低，其所述70％-90％为采用峰面积归一化法所得，真实纯度应该是50％-70％。
专利名称为酪醇及酪醇副产物红景天苷植物提取物及其制剂与用途公开了另外一种提取酪醇的方法，具体是将原材料用乙醇回流、浸渍或渗漏提取，收集提取液，浓缩至无醇味，加水冷藏，去沉淀，水溶液用酸性溶液调PH至2-4，冷藏，去沉淀，澄清液上弱极性大孔树脂，先用水洗脱至流出液呈中性，再以碱性溶液洗脱大孔树脂，然后再以去离子水洗至中性，再以酸性溶液洗脱，再以去离子水洗脱至偏中性，以上洗脱液均弃去；再以5％-30％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥后用有机溶剂溶解，去除不溶物，澄清液浓缩，加沉淀用有机溶剂，充分搅拌，冷藏，去沉淀，取澄清液浓缩后，加入层析硅胶进行拌样，蒸干，上硅胶层析柱；采用有机溶剂或者混合有机溶剂进行除杂和洗脱或者梯度洗脱，采用薄层检测，收集主斑点为酪醇的洗脱液，回收洗脱液，得固体物质以重结晶有机溶剂进行重结晶，即得。该方法操作复杂繁琐，分离纯化时间长，且硅胶柱死吸附严重，酪醇损失较多；洗脱液用薄层来监测酪醇，收集主斑点为酪醇的洗脱液合并，浓缩，这种方式不适用与大规模的生产上；由于硅胶柱无法重复利用，成本较高，并且不利于环保及节能减排。
发明内容
本发明为了解决上述的技术问题是提供一种酪醇的制备方法,操作步骤简单,适合工业化生产,成本低,死吸附少,酪醇转移率高,无有毒溶剂的使用,安全性高。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种酪醇的制备方法,包括以下步骤：
步骤(1)：取红景天药材，采用煎煮、超声、微波、回流、渗漏、浸渍或温浸工艺提取；
步骤(2)：将步骤(1)制备的提取液中边加入絮凝澄清边搅拌、静置后，过滤；
步骤(3)将步骤(2)过滤后的滤液过纳滤膜，纳滤膜的孔径为1～2nm，截留分子量在100～1000道尔顿；
步骤(4)经过步骤(3)处理的膜过滤液过高分子微球，微球粒径300um以下；
步骤(5)经步骤(4)高分子微球的滤液用水或0.5-5wt％乙醇洗脱除杂，10％-25wt％乙醇洗脱，从酪醇被洗脱下来开始时收集洗脱液，合并洗脱液获得收集液；优选高分子微球的滤液0.5-5wt％乙醇洗脱除杂，除杂效果好，再用25wt％乙醇洗脱，酪醇转移率高。
步骤(6)将步骤(5)获得的收集液减压浓缩，干燥获得纯度为80％以上的酪醇。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，步骤(1)提取液为水或1～100％乙醇，提取1～3次，溶剂用量为3～20倍。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，所述絮凝剂选择醋酸壳聚糖溶液、ZTC1+1溶液、果汁澄清剂或中药澄清剂中的一种或任意几种。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，所述果汁澄清剂选择KBT-GZC果汁澄清剂或101果汁澄清剂。所述中药澄清剂选择KBT-ZTC系列中药澄清剂中的一种或任意几种。所述醋酸壳聚糖溶液中壳聚糖与1％醋酸的质量/体积分数为1～3％。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，高分子微球材料选自聚 苯乙烯型或二乙烯基苯聚合物型或聚甲基丙烯酸甲酯型或聚丙烯酸脂型中任意一种。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，所述微球粒径范围5～200um。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，所述微球粒径范围100～150um。采用该粒径范围的高分子微球可获得较高纯度酪醇，其纯度达90％以上。
本发明如上所述一种酪醇的制备方法,进一步，所述絮凝剂加入量0.5～5wt％，搅拌时间为5分钟～2小时，静置时间为6～24小时。
本发明与现有技术相比存在以下优势:
1、艺操作过程简单，适合工业化生产；
2、提取分离纯化过程中所有材料都是可以重复利用的，成本低；
3、本发明方法采用了纳滤膜及高分子微球分离纯化，死吸附较少，酪醇转移率高；
4、本发明方法制备酪醇的过程中仅用水、乙醇，均属于无毒试剂，对操作人员身体危害小。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例所用的果汁澄清剂及中药澄清剂均购自科立尔生物科技公司。
实施例1
取红景天药材1kg，加8倍量水，微波提取2次，每次5分钟，提取液合并到一起，加入2.5％量(V/V，体积比)的1％醋酸壳聚糖溶液，边加边搅，30分钟后停止搅拌，室温放置6小时，过滤，滤液过NE40膜(型号为纳滤 膜，4.0英寸)，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为NM100，粒径为150um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成15％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，真空干燥，得到酪醇。纯度检测为90％，酪醇转移率为73％。
实施例1使用的1％醋酸壳聚糖溶液是实验室现配产品，具体的配制方法是：1％壳聚糖溶液的配制：先用冰醋酸和水配制1％的醋酸溶液，然后用少量1％醋酸溶液溶解1g壳聚糖粉，搅拌均匀，再加入剩下量的1％醋酸溶液，充分溶解成胶体溶液，即得。
实施例2
取红景天药材1kg，加10倍量水，煎煮提取3次，每次2小时，提取液合并到一起，加入4％量(V/V，体积比)的ZTC1+1溶液，边加边搅，3分钟后停止搅拌，室温放置12小时，过滤，滤液过NE80膜(型号为纳滤膜，8.0英寸)，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为UniPs 5-100，粒径为5um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成10％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，微波干燥，得到酪醇。纯度检测为81％，酪醇转移率为67％。
实施例2中ZTC1+1溶液是实验室现配产品，具体的配制方法是：
ZTC1+1澄清剂
1％A溶液的配制：称取1g，加水到100ml配制方法：先用少量水溶解，搅拌，再加入剩下量的溶剂，搅拌均匀，溶胀24小时后，滤过，即得。
1％B溶液的配制：称取1g，加1％醋酸溶剂100ml
配制方法：先用冰醋酸和水配制1％的醋酸溶液，然后用少量1％醋酸溶液溶解1gB组分，并搅成糊状，再加入剩下量的1％醋酸溶液，溶胀24小时，滤过，即得。
使用时先加入A，搅拌3分钟，后加入B，搅拌均匀，6O℃水浴条件下15min。
实施例3
取红景天药材1kg，加6倍量水，超声提取2次，每次30分钟，提取液合并到一起，加入5％量(V/V，体积比)的中药澄清剂(现配)，边加边搅，3分钟后停止搅拌，放置24小时，过滤，滤液过NE25膜(型号为纳滤膜，2.5英寸)，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为UniCoreS 10,粒径为10um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成20％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，喷雾干燥，得到酪醇。纯度检测为83％，酪醇转移率为70％。
实施例3中药澄清剂是实验室现配产品，具体的配制方法是：
5％A的配制：量取5mlA组分，加水至100ml，搅拌均匀，即得。
5％B的配制：称取5gB组分，加水至100ml，搅拌均匀，即得。
使用时，向待澄清液中先加入A剂的5％稀释液，搅拌均匀(加入澄清剂时搅拌速度宜为60-100r/min，搅拌时间2－3min，均匀即可)，50℃－60℃保温静置30-60分钟，在搅拌下加入B剂的5％稀释液，添加量与A剂相同，搅拌2-3min混匀后，停止搅拌，静待5-10min。
实施例4
取红景天药材1kg，加20倍量40％乙醇，连续渗漏提取，浸渍24小时，开始收集浸渍液，边收集边加入新的40％乙醇至20倍量，提取液合并到一起，加入6％量(V/V，体积比)的果汁澄清剂，边加边搅，2分钟后停止搅拌，放置12小时，过滤，滤液过NE18膜(型号为纳滤膜，1.8英寸)，截留分子量在100～1000道尔顿，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为UniPMM 50-300,粒径为50um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成25％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时 开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，真空干燥，得到酪醇。纯度检测为87％。酪醇转移率为76％。
实施例4果汁澄清剂是实验室现配产品，具体的配制方法是：称取适量A剂，加水稀释为5％的溶液；称取适量B剂，加水稀释为5％的溶液。使用时向待澄清溶液中先加入A剂的5％稀释液，搅拌均匀(加入澄清剂时搅拌速度宜为60-100r/min，搅拌时间1-2min混合均匀即可)，静置10-30分钟，再搅拌下加入B剂的5％稀释液，添加量与A剂相同，加入B剂混匀后，停止搅拌，静待2-10min即可见絮状沉淀生成并逐渐沉降。
实施例5
取红景天药材1kg，加8倍量水，微波提取2次，每次5分钟，提取液合并到一起，加入2.5％量(V/V，体积比)的1％醋酸壳聚糖溶液，边加边搅，30分钟后停止搅拌，室温放置6小时，过滤，滤液过NE40膜(型号为纳滤膜，4.0英寸)，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为NM100，粒径为100um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成15％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，真空干燥，得到酪醇。纯度检测为91％，酪醇转移率为73％。
实施例6
取红景天药材1kg，研磨成粗粉，加8倍量水，微波提取2次，每次5分钟，提取液合并到一起，加入2.5％量(V/V，体积比)的1％醋酸壳聚糖溶液，边加边搅，30分钟后停止搅拌，室温放置12小时，过滤，滤液过NE40膜(型号为纳滤膜，4.0英寸)，收集膜过滤液，膜过滤液上高分子微球(微球为聚苯乙烯型，型号为NM100，粒径为150um)，先用水洗脱至流出液几乎不含其它成分，后换成15％乙醇洗脱，液相检测，当酪醇被洗脱下来时开始收集，至酪醇不再下来，合并收集液，减压浓缩至小体积，真空干燥，得到酪醇。纯度检测为92.5％，酪醇转移率为74％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。