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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610225609.8 (22)申请日 2016.04.08 (71)申请人 江苏齐氏生物科技有限公司 地址 214434 江苏省江阴市东盛西路6号A7 楼1单元 （扬子江生物医药加速器） (72)发明人 何刚张亚洲蒋敏齐来俊 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 (57)摘要 本发明提供了一种大鼠脑垂体细胞的分离 及培养方法， 包括以下步骤： (1)选取8d的雄性SD 大鼠， 麻醉处死； (2。
2、)将大鼠麻醉后腹面向上固定 于板上， 无菌条件下取出大鼠脑垂体， 将脑垂体 放入预冷PBS液中洗涤数次除去血渍， 去除垂体 包膜； (3)无菌条件下， 在预冷的PBS中用眼科剪 将脑垂体剪成1mm1mm碎块； (4)用预热的III型 胶原酶结合中性酶混合消化； (5)终止消化， 过 滤， 收集滤液离心， 弃上清， 加培养基重悬， 重复 操作三次； (6)接种到24孔培养板培养； (7)将培 养7d的细胞经胰酶消化后再次筛网纯化， 离心弃 上清， 重悬接种于处理后的培养板中； (8)细胞免 疫荧光鉴定。 本发明提供的一种大鼠脑垂体细胞 的分离及培养方法， 操作简单， 所得脑垂体细胞 存活率高、 。
3、活性好， 可用于建立体外实验模型细 胞， 满足脑垂体细胞实验的要求。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 107267438 A 2017.10.20 CN 107267438 A 1.一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)选取8d的 雄性SD大鼠， 腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉； (2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上， 局部常规消毒， 用眼科剪剪去大鼠颈部被毛， 无菌条件下十字切口， 取出大鼠脑垂体， 将脑 垂体放入预冷无菌含双抗PBS液中洗涤数次除去血渍， 去除垂体包膜； (3)无菌条件下， 在预 冷的PBS中用眼科剪将脑垂体组织剪成1。
4、mm1mm的碎块； (4)用37预热的III型胶原酶结 合中性酶混合消化； (5)用含大鼠血清、 双抗、 胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止 消化， 用吸管反复吹打， 收集脑垂体细胞悬液用300500钼网筛过滤， 所得滤液80150g离 心6分钟， 去掉上清液， 加入15ml的混合培养基并用吸管吹打， 重复上述操作3次； (6)用细胞 计数板计数， 再将细胞密度调至1105个/ml， 接种至铺多聚赖氨酸包被的的24孔培养板 中， 置于37、 5CO2环境中培养， 5h后贴壁， 2d后换体积分数为5大鼠血清DMEM/F12培养 基培养， 4d后换体积分数2.5大鼠血清DMEM/F12培养基。
5、培养， 5d后换无血清培养基培养， 每24h观察细胞的生长状况及形态变化； (7)将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化36分钟后再 300500钼筛网纯化， 300400g离心5分钟弃上清， 所得细胞沉淀用培养基重悬后接种于 处理后的培养板中； (8)体外培养45d， 细胞免疫荧光鉴定。 2.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于所用预冷的PBS 浓度为0.01M， PH为7.27.4。 3.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤4所述消化 温度为37， 消化过夜(16h)， 消化酶混合液由1.02.0g/l的III型胶原酶和1.02.0g/l 的。
6、中性酶混合并且搅匀后制得， 所述两种酶混合比例1111.5。 4.根据权利要求3所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤4所述消化 温度为37， 消化过夜(16h)， 消化酶混合液由1.5g/l的III型胶原酶和1.5g/l的中性酶混 合并且搅匀后制得， 所述两种酶混合比例11.2。 5.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤5所述的培 养基为含10大鼠血清、 含100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素的双抗、 46 g/ml胰岛素 的DMEM/F12(11)培养基。 6.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤5所述的网。
7、 筛为400钼， 离心速度100g， 每次6min。 7.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤6所述的培 养板用34 g/cm2的多聚赖氨酸包被， 培养条件为37、 5CO2培养箱。 8.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤7所述的纯 化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后， 再次通过400钼的筛网， 收集滤液， 300 400g离心5分钟弃上清， 重悬接种。 9.根据权利要求8所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法， 其特征在于步骤7所述的纯 化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后， 再次通过400钼的筛网， 收集滤液，。
8、 350g 离心5分钟弃上清， 重悬接种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107267438 A 2 一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 技术领域 0001 本发明属于细胞技术领域， 具体涉及一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法。 背景技术 0002 脑垂体(pituitarygland)又名脑下腺， 是内分泌系统的重要组成部分， 位于间脑 腹面， 视交叉后方， 与丘脑下部相连。 垂体是生物体内最重要的内分泌腺。 垂体前叶由促甲 状腺激素细胞、 促性腺激素细胞、 生长激素细胞等多种细胞构成。 垂体受下丘脑和靶器官激 素的双重调节， 它在机体新陈代谢， 保持内环境稳定， 机体的生长发育等方面均。
9、具有重要作 用。 体外培养垂体细胞可以被用于研究刺激促黄体素(Luteinizinghormone， LH)合成和分 泌机理， 促卵泡素(Folliclestimulatinghormone， FSH)的分泌调节。 目前国内外对于大 鼠脑垂体细胞的分离与培养的研究较少， 分离方法不成熟， 获得的细胞纯度低， 数量少。 本 发明旨在提供一种操作简单、 高效的获得生长状态好、 纯度高的大鼠脑垂体细胞的方法， 建 立一套完善可靠的大鼠脑垂体细胞体外培养技术。 发明内容 0003 根据上述问题， 本发明提供了一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法， 该方法操 作简单， 细胞产量和成活率高， 是一种较为理想。
10、的大鼠脑垂体细胞原代培养方法。 可以满足 多种生理生化实验的要求。 0004 本发明提供的技术方案包括如下步骤： 0005 (1)选取8d的雄性SD大鼠， 腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉； 0006 (2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上， 局部常规消毒， 用眼科剪剪去大鼠颈部被 毛， 无菌条件下十字切口， 取出大鼠脑垂体， 将脑垂体放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉 素， 100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.0080.015M， PH为7.27.4)中洗涤数次除去血渍， 去除垂体包膜； 0007 (3)无菌条件下， 在预冷的PBS(浓度为0.0080.015M， PH为7。
11、.27.4)中用眼科剪 将脑垂体组织剪成1mm1mm的碎块； 0008 (4)用37预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化； 0009 (5)用含10大鼠血清、 双抗(100u/ml的青霉素， 100u/ml的链霉素)、 46 g/ml胰 岛素的DMEM/F12(11)混合培养基(简称混合培养基)终止消化， 用吸管吹打重悬， 收集脑垂 体细胞悬液用300500钼网筛过滤， 所得滤液80150g离心6分钟， 去掉上清液， 保留沉淀 (脑垂体细胞在沉淀中)， 加入15ml的混合培养基并用吸管吹打重悬， 重复上述操作3次； 0010 (6)在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片， 用玻璃虹吸管吸取细胞。
12、悬液， 让虹 吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液， 至盖玻片被细胞悬液充满为止， 置于显 微镜下计数四角大方格内的细胞总数(四大格细胞总数/4104)。 计数完成后再加入培养 基将细胞密度调至1105个/ml， 接种至铺多聚赖氨酸包被的的24孔培养板中， 置于37、 5CO2环境中培养， 5h后贴壁， 2d后换体积分数为5大鼠血清DMEM/F12(11)培养基培养， 说明书 1/4 页 3 CN 107267438 A 3 4d后换体积分数2.5大鼠血清DMEM/F12(11)培养基培养， 5d后换无血清培养基培养。 每 24h观察细胞的生长状况及形态变化； 0011 (7)将培养7d。
13、的细胞经胰蛋白酶消化36分钟后再300500钼筛网纯化， 300 400g离心5分钟弃上清， 所得细胞沉淀用DMEM/F12(11)培养基重悬后接种于处理后的培养 板中； 0012 (8)体外培养45d， 细胞免疫荧光鉴定。 0013 其中， 步骤(1)所选的大鼠体重15010g， 8d雄性大鼠。 0014 其中， 步骤(2)所述的PBS已4预冷， PBS浓度为0.01M， PH为7.27.4； 培养皿置于 冰上。 0015 其中， 步骤(4)所述消化温度为37， 消化过夜(16h)， 消化酶混合液由1.02.0g/ l的III型胶原酶和1.02.0g/l的中性酶混合并且搅匀后制得， 所述两种。
14、酶混合比例11 11.5。 0016 其中， 步骤(5)所述培养基为DMEM/F12(11)培养基， 含10大鼠血清， 含100u/ml 的青霉素、 100u/ml的链霉素的双抗， 5 g/ml的胰岛素。 0017 其中， 步骤(5)所述所得脑垂体细胞悬液用400钼网筛过滤， 所得滤液100g离心6分 钟。 0018 其中， 步骤(7)所述细胞的纯化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后再 次400钼筛网纯化， 350g离心5分钟， 弃上清， 细胞沉淀用DMEM/F12(11)培养基重悬后接种 于处理后的培养板中。 0019 本发明建立了一种简单、 高效的分离培养大鼠脑垂体细胞的方法， 。
15、所得细胞数量 多、 纯度高、 活性好， 细胞成活率达95以上， 细胞纯度达96以上； 采用SD大鼠为材料， 来 源广泛； 采用胶原酶和中性酶联合消化方法， 克服了垂体分离困难的难题， 减少了细胞损 伤， 所得细胞悬液粘度小、 易过滤， 并且细胞数量多， 细胞存活率高； 本发明采用多聚赖氨酸 包被培养板， 细胞生长状态好， 可满足脑垂体细胞实验的要求， 多聚赖氨酸包被比APES包被 制作更简单， 更易保存； 本方法经济实用， 简便易行， 有利于建立体外实验模型细胞， 研究垂 体细胞的分泌特性， 用于研究药物、 促激素等对垂体激素合成与释放的调节作用。 以及靶器 官激素对垂体的反馈调控机理研究。 。
16、附图说明 0020 图1培养7d的大鼠脑垂体细胞图片(100) 0021 图2培养7d的大鼠脑垂体细胞图片(200) 0022 图3培养7d大鼠脑垂体细胞免疫荧光图片(100) 0023 图4培养7d大鼠脑垂体细胞免疫荧光图片(200) 具体实施方式 0024 下面结合附图和实例对本发明进行详细说明， 本发明的保护内容不限于下述实施 例。 0025 本实验所用的实验仪器与试剂如下： 0026 外科手术器械一套， 低温离心机(TD24B-WS， 上海)， 电子分析天平(Sartorius， 美 说明书 2/4 页 4 CN 107267438 A 4 国)， 超净工作台(HJ-CJ-1D， 上海。
17、)， 二氧化碳细胞培养箱(SANYOMCO-17AI， 日本)， 血细胞 计数板(2516， 上海)。 0027 DMEM/F12(11)购于Corning公司， 青霉素-链霉素双抗于Gibco购买， 大鼠血清购 买于Bioind公司， PBS自制(8.0gNal、 0.2gKCl、 0.2gKH2PO4、 1.44gNa2HPO4溶于1000ml去离子 水中， 调整PH为7.27.4， 非特殊指出， 本专利所用的PBS皆为此配方)， 胰酶购买于Bioind 公司， III型胶原酶购买于德国SERVA公司， Nephrin抗体。 0028 本发明提供的技术方案包括如下步骤： 0029 (1)选。
18、取体重15010g， 8d雄性SD大鼠， 腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉； 0030 (2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上， 局部常规消毒， 用眼科剪剪去大鼠颈部 被毛， 无菌条件下十字切口， 取出大鼠脑垂体， 将脑垂体放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青 霉素， 100u/ml的链霉素)的PBS(浓度为0.01M， PH为7.27.4)液中洗涤数次除去血渍， 去除 垂体包膜； 0031 (3)无菌条件下， 在预冷的PBS(浓度为0.01M， PH为7.27.4)中用眼科剪将脑垂体 组织剪成1mm1mm的碎块； 0032 (4)用37预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化， 消化过夜。
19、(16h)， 所述消化酶 溶液由1.5g/l的III型胶原酶和1.5g/l的中性酶(11.2)混合并且搅匀后制得； 0033 5)用含10大鼠血清、 双抗(100u/ml的青霉素， 100u/ml的链霉素)、 5 g/ml胰岛素 的DMEM/F12(11)混合培养基(简称混合培养基)终止消化， 用吸管反复吹打， 收集脑垂体细 胞悬液用400钼网筛过滤， 所得滤液100g离心6分钟， 去掉上清液， 所得细胞沉淀加入15ml培 养基并用吸管吹打重悬， 100g离心6分钟， 重复上述操作3次； 0034 (6)在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片， 用玻璃虹吸管吸取细胞， 让虹吸管 在盖玻片上或下侧。
20、的计数板凹蹧处流出悬液， 至盖玻片被液体充满为止， 置显微镜下计数 四角大方格内的细胞总数(四大格细胞总数/4104)。 对于压线的细胞只计数在上线和左 线者， 对于细胞团按单个细胞计数。 计数完成后再加入培养基将细胞密度调至1105个/ ml， 接种至铺3-4 g/cm2多聚赖氨酸包被的24孔培养版中， 置于37、 5CO2环境中培养， 5h 后贴壁， 2d后换体积分数为5大鼠血清DMEM/F12(11)培养基培养， 4d后换体积分数2.5 大鼠血清DMEM/F12(11)培养基培养， 5d后换无血清培养基培养。 每24h观察细胞的生长状 况及形态变化； 0035 (7)将培养7d的细胞经胰。
21、蛋白酶消化4分钟后再次400钼筛网纯化， 350g离心5分 钟， 弃上清， 所得细胞沉淀用DMEM/F12(11)培养基重悬后接种于处理后的培养板中； 0036 (8)细胞免疫荧光鉴定： 将大鼠脑垂体细胞的悬液滴在涂有多聚赖氨酸的24孔板 的玻片上， 体外培养45d， 取出玻片， 用PBS冲洗3次， 每次3min。 用Zamboni液体固定； 4多 聚甲醛固定2030min， PBS洗3次， 每次10min， 0.2渗透液Triton-100室温(15-25)下孵 育10min， PBS洗3次， 每次10min， 5BSA室温封闭1h， 吸去封闭液。 加入Nephrin抗体(用1 BSA稀释)。
22、于冰箱4过夜孵育， PBS洗3次。 滴加羊抗鼠PE荧光二抗IgG(用1BSA稀释)， 在室 温下置于湿盒内孵育45min， PBS洗3次， 自然晾干后在显微镜下观察。 0037 本发明所得到的大鼠脑垂体细胞数量多， 细胞成活率达95以上， 细胞纯度达 96以上。 0038 以上所述， 仅为本发明较佳的实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此实施 说明书 3/4 页 5 CN 107267438 A 5 实例。 任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改， 等同替换和改进等， 均应包含在本发 明的保护范围内。 说明书 4/4 页 6 CN 107267438 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 107267438 A 7 图3 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 107267438 A 8 。