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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710408300.7 (22)申请日 2017.06.02 (71)申请人 合肥市第六中学 地址 230039 安徽省合肥市长江路397六中 南区 申请人 安徽省农业科学院植物保护与农产 品质量安全研究所 (72)发明人 戚竞文赵伟鲍康胜迟元凯 陈晴晴汪涛严丹侃 (74)专利代理机构 安徽合肥华信知识产权代理 有限公司 34112 代理人 余成俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(20。
2、06.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP 引物、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于基因工程领域， 具体公开了一种 用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物、 试剂 盒及其应用。 大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测靶 标序列为钙调素(Calmodulin,CaM)编码基因及 引物组FIP、 BIP、 F3、 B3， 并形成检测混合溶液， 加 入2L待检测DNA溶液并将反应体系定容至总体 积25L， 恒温反应62 C， 60min， 反应结束后加 入0.25LSYBRGreenI作为显色反应指示剂。 阳性反应溶液变为黄绿。
3、色， 紫外灯下可以观察到 荧光， 表示存在大豆拟茎点种腐病菌， 阴性反应 溶液没有出现颜色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不 发荧光， 表示不存在大豆拟茎点种腐病菌， 或所 含大豆拟茎点种腐病菌未达到最低检测量。 本发 明具有更高的准确性、 灵敏度和时效性。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 107245517 A 2017.10.13 CN 107245517 A 1.钙调素CaM蛋白编码基因序列作为靶标在检测大豆拟茎点种腐病菌中的应用， 其特 征在于： 所述的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。 2.一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物组， 其特征在于， 包括下列。
4、引物 ： 正向外引物F3： 5 -TGCTAACGGACCGTTTTCG-3 ， 反向外引物B3： 5 -AAGGGACCGCATGACTGT-3 ， 正向内引物FIP： 5 -TGCGTAGCTGAGAAAGAGGGGAGCCTGCAGGATAAGGATGG-3 反向内引物BIP： 5 -CGTGCAGCTACTCCGACCGAGTGATTTGTCCTACACGCCA-3 。 3.权利要求2所述的LAMP引物组在检测大豆拟茎点种腐病菌中的应用。 4.权利要求2所述的LAMP引物组在制备检测大豆拟茎点种腐病菌的试剂盒中的应用。 5.一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP试剂盒， 其特征在于：。
5、 包含权利要求2所述 的引物组。 6.根据权利要求5所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP试剂盒， 其特征在于包 含： 2.5 L 10 ThermoPol Buffer， 6mM MgSO4、 0.8M Betaine, 1.4mM dNTPs, LAMP所用 的LAMP特异性引物0 .2M F3 , 0 .2M B3 , 1 .6M FIP , 1 .6M BIP， 8U Bst DNA polymerase组成的检测溶液。 7.一种大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 取16.5 L权利要求6所述的检测溶液， 加入2 L待检测DNA溶液， 加6。
6、.5 L灭菌超纯水 至反应总体积25 L， 60 C下反应60 min； （2） 反应结束后加入0.25 L SYBR Green I作为显色反应指示剂， 阳性反应溶液变为黄 绿色， 紫外灯下可以观察到荧光， 表示存在大豆拟茎点种腐病菌， 阴性反应溶液没有出现颜 色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不发荧光， 表示不存在大豆拟茎点种腐病菌， 或所含大豆拟茎 点种腐病菌未达到最低检测量。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107245517 A 2 一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物、 试剂盒及其 应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 具体涉及一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的 。
7、LAMP 引物、 试剂盒及其检测方法。 背景技术 0002 大豆是世界上重要经济农作物， 大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)是 大豆生产上的一种重要病原菌， 可侵染大豆的根部、 茎部和豆荚， 引致大豆种腐、 根腐和茎 枯等。 茎部感病后， 常在下部茎秆叶、 分枝与茎连接处产生病斑， 颜色较淡， 病斑沿茎扩展、 环茎， 失水褪绿、 萎缩和干枯， 导致植株上部萎蔫和枯死， 叶片不脱落； 病株根系完整、 健康； 发病较轻植株， 上部叶片沿脉间褪绿。 豆荚或种子感染后， 发病的种子会出现皱缩、 伸长、 破 裂、 发白， 影响种子质量， 造成大豆品质下降， 并可能导致大豆种子。
8、不能发芽或发芽缓慢， 重 发时能造成90的种子不能萌发或腐烂。 目前该菌在美国、 阿根廷、 意大利、 韩国、 南斯拉夫 等都有报道。 我国是大豆消费大国， 也是大豆贸易大国， 每年需大量进口大豆， 其中2015年 进口大豆达8169万吨， 是国内生产量的6.8倍， 占国内消费量的87。 进口大豆多来自美国、 巴西等大豆种腐病等病害发生较重的国家， 而大豆拟茎点种腐病菌常残留在大豆种子和豆 荚、 豆秆等病残体上， 并通过远距离运输而传播蔓延， 因此， 我国存在较大的拟茎点种腐病 菌输入风险。 大豆拟茎点种腐病菌侵染到大豆组织后具有一定的潜育期， 并未显症或症状 不明显， 常导致漏诊或误诊。 在这。
9、种严峻的形势下， 快速准确地检测病原菌和诊断病害是控 制病害成灾的主要措施之一。 0003 拟茎点霉属真菌检测与鉴定的方法主要有形态学鉴定、 血清学方法和分子生物学 方法等。 目前拟茎点霉属传统的检测方法主要以形态学监测为基础， 即： 将待鉴定菌株接种 在培养基上或其寄主上培养， 利用光学显微镜和电子显微镜等仪器观察菌落特征、 菌丝形 态、 产孢结构和孢子结构等表型特征， 结合寄主上的发病症状， 对照相关资料， 再确定该菌 的分类地位。 这种方法需要较长的时间， 且需大量的形态观察， 无疑加大了检测难度。 血清 学检测方法主要是ELISA法， 该技术目前已广泛应用于植物病毒检测中， 但在真菌检。
10、测中并 不普遍， 同时， 由于血清制备困难、 近似种特异性差及检测成本过高， 以及成品试剂盒不易 获得等原因， ELISA方法在拟茎点霉真菌检测上的应用很少。 用于拟茎点霉属真菌分子检测 鉴定的常用方法包括PCR、 多重PCR、 巢式PCR、 荧光PCR、 RLFP、 RAPD、 SSR等， 近年来， DNA指 纹、 基因芯片技术等亦开始起步， 虽然这些分子检测技术的效率高、 灵敏度高， 且能从植物 组织中直接检测到病原菌， 但大部分技术又存在重复性、 可操作性、 多态性、 成本、 检测范围 及环境因素等问题， 例如巢式PCR、 多重PCR需要染胶处理， 实时荧光PCR因荧光染料和荧光 探针的。
11、价格及仪器价格等因素使得检测成本较高， RAPD只能对室内纯培养的菌进行检测， 而在自然界的发病植株中， 往往会感染多种真菌， 这会导致分子检测结果不全面， 只能检测 到某种或某几种病原菌。 因此， 这些检测技术并未能得到普遍应用。 0004 2000年， Notomi等人研发出了一项全新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术 说明书 1/4 页 3 CN 107245517 A 3 (LAMP,loop-mediated isothermal amplification)。 该技术使用四条或六条引物， 以Bst DNA聚合酶作为扩增酶， 恒温条件下对目标片段进行扩增。 其产物可以通过凝胶电泳进行观。
12、 察， 同时可以通过田间显色反应指示剂目测直接进行观察。 LAMP技术的发明， 为病原物快速 检测建立了一个良好的平台， 该技术具有非常鲜明的特点， 不需要模板核酸片段的热变性、 长时间的温度变化循环、 实验结果不需要凝胶电泳染色后进行紫外观察， 这就避免了普通 PCR所需要昂贵的实验仪器以及专业的实验操作场所， 因而该技术适合在基层、 进出口检疫 部门进行快速的病原物诊断。 0005 发展分子检测最重要的一点就是选用合适的分子检测靶标。 钙调素 (Calmodulin, CaM)编码基因在进化较为保守， 其外显子区域在属间具有一定的保守性， 同时该基因存在序 列差异较大的非编码的内含子区域，。
13、 该区域在碱基水平上具有明显的种间差异， 因此该编 码基因可以用来作为分子检测的靶标而加以应用。 本发明通过序列比对分析大豆拟茎点种 腐病菌和其他拟茎点霉病菌及大豆常发病原菌在CaM基因序列上的差异， 设计了大豆拟茎 点种腐病菌特异性的 LAMP引物， 在此基础上建立了大豆拟茎点种腐病菌LAMP快速检测试 剂盒。 本发明能实现拟茎点种腐病菌引致病害的早期准确诊断， 对及时采取防控措施、 减少 农药使用、 保障大豆生产安全和质量安全具有重要作用。 发明内容 0006 本发明公开了钙调素CaM蛋白编码基因序列作为靶标在检测大豆拟茎点种腐病菌 中的应用， 目的是提供一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的L。
14、AMP引物组。 0007 本发明的另一目的是提供用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物组的应用。 0008 本发明的又一目的是提供用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP试剂盒。 0009 为实现上述目的本发明采用如下技术方案如下： 0010 钙调素CaM蛋白编码基因序列作为靶标在检测大豆拟茎点种腐病菌中的应用， 其 特征在于： 所述的基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。 0011 用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物组， 包括下列引物： 0012 正向外引物F3:5 -TGCTAACGGACCGTTTTCG-3 ， 0013 反向外引物B3:5 -AAGGGACCGCATGACT。
15、GT-3 ， 0014 正向内引物FIP(F1C+F2): 0015 5 -TGCGTAGCTGAGAAAGAGGGGAGCCTGCAGGATAAGGATGG-3 ， 0016 反向内引物BIP(B1C+B2): 0017 5 -CGTGCAGCTACTCCGACCGAGTGATTTGTCCTACACGCCA-3 0018 所述的用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP试剂盒， 包括： 2 .5L 10 ThermoPol Buffer， 6mM MgSO4、 0.8M Betaine,1.4mM dNTPs,LAMP所用的 LAMP特异性引物 0.2 M F3,0.2 M B3,1.6 M FI。
16、P,1.6 M BIP， 8U Bst DNA polymerase组成的检测溶液。 0019 一种大豆拟茎点种腐病菌的LAMP检测方法， 取16.5 L检测溶液， 加入2 L 待检测 DNA溶液， 加6.5 L灭菌超纯水至反应总体积25 L， 反应62， 60min。 反应结束后加入0.25 L SYBR Green I作为显色反应指示剂， 阳性反应溶液变为黄绿色， 紫外灯下可以观察到荧光， 表示存在大豆拟茎点种腐病菌， 阴性反应溶液没有出现颜色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不发 荧光， 表示不存在大豆拟茎点种腐病菌， 或所含大豆拟茎点种腐病菌未达到最低检测量。 说明书 2/4 页 4 CN 。
17、107245517 A 4 0020 有益效果： 0021 与传统的检测技术相比， 本发明具有更高的准确性、 灵敏度和时效性。 以形态特征 为基础的传统检测方法耗时长、 需要检测的样品量大， 而且要求操作者具备专业的真菌分 离、 形态学鉴定知识和丰富的实践操作经验， 因而经常导致漏检， 检测准确率较低。 本发明 通过实验验证， 在不同的大豆病害之间， 大豆拟茎点种腐病菌的检出率为100， 准确性及 特异性高； 本发明最低可以检测出100pg DNA含量的样品， 灵敏度高； 本发明的耗时只要 60min， 加上样品的富集及DNA 的提取， 一般只需要半个工作日， 时效性高。 0022 本发明在生。
18、物信息学的基础上 ， 通过基因序列比 对分析 ， 得到的钙调素 (Calmodulin,CaM)编码基因在进化时较为保守， 其外显子区域在属间具有高度的保守性， 同时该基因存在序列差异较大的非编码的内含子区域， 该区域在碱基水平上具有明显的种 间差异， 因此该编码基因可以用来作为分子检测的靶标而加以应用。 通过LAMP引物设计软 件设计出多条符合设计参数的引物， 但并不是每组引物都具有较好的特异性和扩增灵敏 度， 容易出现假阳性， 导致出现误判及错误的检测结果。 因此， 如何将软件设计的引物同实 际应用结合起来， 显得尤为关键， 本发明核心正是在一定的理论基础上， 经过数次实验筛 选、 验证和。
19、甄别出来的。 0023 与现在普遍使用的普通PCR分子检测技术相比较， 本发明对实验场所的要求简单、 实验操作方便、 结果观察简便直观。 普通PCR分子检测技术需要不同的温度变化循环， 需要 较为专业的PCR操作仪器， 实验结果需要凝胶电泳染色后在凝胶成像仪中进行观察， 因此整 个实验需要专业、 昂贵的实验操作仪器， 而且操作较为繁琐。 本发明在62恒温条件下对目 标片段进行扩增， 实验结果通过直接观察反应体系颜色的变化即可进行判断。 因此本发明 非常适合在基层及进出口检验检疫部门推广使用。 具体实施方式 0024 一种用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP引物组， 包括下列引物： 0025 正。
20、向外引物F3： 5 -TGCTAACGGACCGTTTTCG-3 ， 0026 反向外引物B3： 5 -AAGGGACCGCATGACTGT-3 ， 0027 正向内引物FIP： 0028 5 -TGCGTAGCTGAGAAAGAGGGGAGCCTGCAGGATAAGGATGG-3 0029 反向内引物BIP： 0030 5 -CGTGCAGCTACTCCGACCGAGTGATTTGTCCTACACGCCA-3 。 0031 实施列1 0032 用于检测大豆拟茎点种腐病菌的LAMP试剂盒， 包括： 2.5 L 10 ThermoPol Buffer， 6mM MgSO4、 0.8M Betai。
21、ne,1.4mM dNTPs,LAMP所用的LAMP特异性引物0.2 M F3, 0.2 M B3,1.6 M FIP,1.6 M BIP， 8U Bst DNA polymerase组成的检测溶液。 各组分的浓度 表示其在检测溶液中的终浓度。 0033 实施列2大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物的特异性试验 0034 为验证大豆拟茎点种腐病菌LAMP引物的特异性， 选择了4个大豆拟茎点种腐病菌、 14个其它病原菌(1-4： Phomopsis longicolla， 5:Diaporthe actinidiae， 6： Diaporthe melonis， 7： Colletotrichum t。
22、runcatum， 8:C.scovillei， 9： C.spaethianum， 10： Fusarium 说明书 3/4 页 5 CN 107245517 A 5 oxysporum， 11： F.equiseti， 12:F.graminerum， 13： F.solani， 14： F.proliferatum， 15： F.culmorum， 16： Phytophthora sojae， 17:Alternaria tenussima， 18： Nigreospora sphaerica)的DNA作为模版， 取 16.5 L实施列1所述的检测溶液， 加入2 L待检测DNA溶液， 。
23、加6.5 L灭菌超纯水至反应总体积25 L， 反应62， 60min。 反应结束后加入0.25 L SYBR Green I作为显色反应指示剂。 含有大豆拟茎点种腐的样品(1-4号)反应溶液变为黄绿色， 紫外灯下可以观察到荧光， 反应结果为阳性。 而其它病原菌为模版的反应溶液没有出现颜 色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不发荧光， 反应结果为阴性， 表示不存在大豆拟茎点种腐病菌。 该结果表示， 利用大豆拟茎点种腐病菌LAMP 引物及其反应溶液， 恒温扩增后添加SYBR Green I作为显色反应指示剂可以特异性的检测出含有大豆拟茎点种腐病原菌的存在， 且 具有省时、 省钱、 省力、 可操作性强等诸。
24、多优点。 0035 实施列3大豆拟茎点种腐病菌LAMP特异性引物的灵敏度试验 0036 为验证大豆拟茎点种腐病菌LAMP特异性引物的灵敏度， 将提取的大豆拟茎点种腐 病菌菌株DNA进行10倍递度稀释后(从1 g/ L到1fg/ L)， 取16.5 L 实施列1所述的检测溶 液， 加入2 L系列稀释的DNA溶液， 加6.5 L灭菌超纯水至反应总体积25 L， 反应62， 60min。 反应结束后加入0.25 L SYBR Green I作为显色反应指示剂进行结果观察， 模版浓度较高 时， 发生LAMP扩增时， 阳性反应溶液变为黄绿色， 紫外灯下可以观察到荧光， 在含量较低的 模版中， 反应溶液没。
25、有出现颜色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不发荧光， 反应结果为阴性。 在 25 L的反应体系中， LAMP体系所能检测的最低灵敏度为100pg/ L。 0037 实施列4感病大豆植株LAMP检测试验 0038 取9株接种大豆拟茎点种腐病菌7天后的大豆茎基部组织1-2cm， 使用碱裂解法快 速提取DNA， 每毫克组织加入10l 0 .5M NaOH， 充分研磨后转移至 1 .5ml的EP管中， 12000rpm离心5min， 取2 l直接用于LAMP反应。 取 16.5 L实施列1所述的检测溶液， 加6.5 L 灭菌超纯水至反应总体积25 L， 反应62， 60min。 反应结束后加入0.25 L。
26、 SYBR Green I作 为显色反应指示剂进行结果观察， 接种大豆拟茎点种腐病菌7天后的大豆茎基部组织的DNA 作为模版发生LAMP扩增， 反应溶液变为黄绿色， 紫外灯下可以观察到荧光， 而以健康植株提 取的DNA作为模版， 反应溶液没有出现颜色变化， 仍为橙色， 紫外灯下不发荧光， 反应结果为 阴性。 说明书 4/4 页 6 CN 107245517 A 6 SEQ ID NO.1 TGCGCCTGATGCTAACGGACCGTTTTCGGCCTGCAGGATAAGGATGGCGATGGTTAGTGCGGTCACCGCTTCC TCCCCTCTTTCTCAGCTACGCACGCGTCATACTCGATCCGCCGCGACGGTCTGCGCGTGCAGCTACTCCGACCGACC GACCATCAAATCTATCACGAGTAGTATGCTAAGGCTGGCGTGTAGGACAAATCACCACCAAGGAGCTCGGCACAGTC ATGCGGTCCCTTGGTCAAAACCCTTCCGAGTCCGAGCTGCAGGACATGATCAACGAGGTCGACGCCGACAACAACGG CACCATTGACTTCCCTGGTGAGTCTAGATCCTCGTACACTGGATATTC 序列表 1/1 页 7 CN 107245517 A 7 。