含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010485398.8 (22)申请日 2020.06.03 (71)申请人 上海舜纳生物科技有限公司 地址 201507 上海市金山区亭卫公路3688 号5幢632室 申请人 上海大学 (72)发明人 陈怀文高洁尹川张莹莹 杨冬梅谢方圆刘俊杰于永生 贺智明姜普 (51)Int.Cl. A61K 9/127(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61K 39/39(200。

2、6.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体 及其制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种含化药阿霉素及免疫佐 剂组合的药物脂质体, 该纳米脂质体高效率负载 阿霉素以及免疫抗原, 可在体稳定长循环, 在降 低阿霉素毒副作用的同时, 将免疫抗原递送到肿 瘤微环境, 可针对肿瘤发挥化疗免疫联合治疗 作用, 达到抑制肿瘤生长及转移的目的。 权利要求书2页 说明书8页 附图5页 CN 112137958 A 2020.12.29 CN 112137958 A 1. 一种共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂及其制备, 其特征在于每 100。

3、0ml制剂的原料配方为: 阿霉素或盐酸阿霉素500mg5000mg 免疫佐剂50mg2500mg 中性磷脂240mg30000mg PEG化磷脂 (DSPE-PEG) 10mg10000mg 正电荷磷脂2mg20000mg 胆固醇10mg15000mg 维生素E 0.25mg480mg 碱20mg35000mg 糖28g200g 缓冲剂1g100g 注射用水定容至1000ml 其中, 阿霉素或盐酸阿霉素和免疫佐剂的重量比例为0.1 1-2 1, 阿霉素或盐酸阿霉素 和磷脂的重量比例为0.1 1-2 1, 正电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.05 5-2 5, 胆固醇 和中性磷脂的摩尔比例为0.。

4、1 1-1 1。 2.根据权利要求1中脂质体中包含中性磷脂, 中性磷脂选自氢化大豆卵磷脂、 蛋黄卵磷 脂、 氢化蛋黄卵 磷脂、 双硬脂酸卵磷脂、 大豆卵磷脂、 双软脂酸卵磷脂或双肉豆寇酸卵磷 脂。 3.根据权利要求1中脂质体中包含免疫佐剂, 免疫佐剂选自免疫佐剂CpG、 PolyIC、 PolyICLC、 MPL、 MPL-TDM、 脂多糖中的至少一种。 4.根据权利要求1中脂质体包含正电荷磷脂, 正电荷磷脂选自DOTAP, DOTMA, DOSPA, DODMA, Dlin-MC3-DMA, Dlin-KC2-DMA或c12-200。 5.根据权利要求1所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质。

5、体注射剂, 其特征在于 维生素E和磷脂的摩尔比例为0.1 5-1 5。 6.根据权利要求1所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂, 其特征在于 碱包括碳酸钙、 碳酸钠、 碳酸氢钠、 氢氧化钠或磷酸钾。 7.根据权利要求1所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂, 其特征在于 糖为乳糖、 麦芽糖、 蔗糖、 葡萄糖或海藻糖。 8.根据权利要求1所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂, 其特征在于 缓冲剂可以是左氨酸、 组氨酸或缓血酸胺。 9.根据权利要求1所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂, 其特征在于 其剂型可以是注射液、 冻干粉。 10.权利要求1所述的共载阿。

6、霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂的制备方法, 其特 征在于包含下列步骤: 步骤一: 制备空白脂质体: 根据配方选用中性磷脂、 正电荷磷脂、 胆固醇和维生素E按照 一定质量比例加入于一体积质量浓度4-10%的乙醇溶液中, 升温至60溶解均匀以形成溶 解脂质的乙醇溶液, 备用; 另配制浓度250mM的硫酸铵注射用水溶液并升温至55-65, 并加 热条件下将上述溶解脂质的乙醇溶液高速注入其中, 所形成乳液用高射流挤出设备或物理 权利要求书 1/2 页 2 CN 112137958 A 2 挤压过相应孔径的微孔膜来制得粒径范围在50-200nm空白脂质体, 再以3-20的糖水溶液 置换空白脂质体的溶。

7、剂体系; 步骤二: 制备共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体: 将盐酸阿霉素或阿霉素以及免 疫佐剂按一定比例溶于注射用水或浓度为3-20的糖水溶液, 加热到40-70后与步骤一 所制得的空白脂质体混合均匀, 并在40-70下保温一段时间, 制得共载阿霉素与免疫佐剂 的脂质体; 步骤三: 调节制剂脂质体溶剂体系: 采用0.2-10缓冲剂调节含抗氧化剂、 碱、 糖等稳 定剂的注射用水至PH5-7, 利用渗析过滤法置换共载阿霉素与免疫佐剂的脂质体的外溶液, 使共载脂质体分散在与人体生理环境类似的等渗溶液中; 步骤四: 定容、 除菌、 分装、 保存: 用注射用水定容后, 将阿霉素或盐酸阿霉素脂质体悬 浮。

8、液用微孔膜过滤除菌, 分装即得成品, 成品可在2-8下保存或冻干保存至使用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112137958 A 3 一种含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体及其制备方法 技术领域 0001 在本发明涉及一种用于肿瘤化疗免疫组合治疗的药物脂质体制剂, 具体为是一种 阿霉素与免疫佐剂共载的纳米脂质体及其制备。 背景技术 0002 肿瘤临床治疗包括手术、 化药治疗 (化疗) 、 放射治疗 (放疗) 、 靶向治疗和免疫治 疗。 在一般情况下, 化疗是肿瘤治疗不可或缺的手段。 0003 化药治疗通常采用全身给药, 不仅仅是杀伤肿瘤细胞; 对于人体正常细胞也具有 明确的毒副作用, 如恶。

9、心、 脱发、 造血毒性、 造血祖细胞从骨髓动员到外周血的减少、 贫血、 骨髓抑制、 全血细胞减少、 血小板减少、 中性粒细胞减少、 淋巴细胞减少、 白细胞减少。 这些 副作用常常限制了化疗药物的施用剂量和用药频率。 0004 阿霉素 (英文名称 adriamycin, 又称多柔比星) 是一种常见的抗肿瘤化药, 其抗瘤 谱较广, 适用于急性白血病 (淋巴细胞性和粒细胞性) 、 恶性淋巴瘤、 乳腺癌、 支气管肺癌 (未 分化小细胞性和非小细胞性) 、 卵巢癌、 软组织肉瘤、 成骨肉瘤、 横纹肌肉瘤、 尤文肉瘤、 母细 胞瘤、 神经母细胞瘤、 膀胱癌、 甲状腺癌、 前列腺癌、 头颈部鳞癌、 睾丸癌、。

10、 胃癌、 肝癌等。 但其 临床毒副作用亦十分明显, 除骨髓抑制, 胃肠道毒性以及脱发外, 还可引起严重的 心脏毒 性, 表现为各种心率失常, 累积量大时可发生不可逆的心肌损伤乃至充 血性心力衰竭。 0005 脂质体是靶向给药系统的一种先进剂型, 一直是药物开发的热点剂型, 它可以将 药物选择性地运送到靶点部位, 发挥治疗作用, 同时又不影响正常细胞、 组织或器官的功 能, 从而达到提高疗效、 减少毒副作用的目的。 美国FDA于1995年批准了第一个PEG化长循环 阿霉素脂质体药物(Doxil ), 有效降低阿霉素的心脏毒性。 尽管脂质体技术有效降低阿霉 素的毒副作用, 但Doxil 在肿瘤化疗。

11、中依然会产生耐药、 抗肿瘤效力不足等问题, 导致仅 通过单一药物或制剂难以抑制肿瘤细胞生长。 因此, 临床往往选用几种药物联合抑制肿瘤, 称之为联合化疗。 另外, 化疗也可以与其他治疗方式 (如手术、 放疗、 靶向治疗和免疫治疗) 一起联用, 形成针对肿瘤的综合治疗。 无论联合化疗或综合治疗, 均较单一治疗药物或治疗 形式产生更好的抗肿瘤效果、 更低的毒副作用, 即协同效应。 0006 以化药阿霉素联合免疫佐剂的共载脂质体针对肿瘤进行联合治疗可以产生明确 的抗肿瘤的协同效应, 有利于对肿瘤细胞的原位杀伤; 并产生更强的肿瘤特异性免疫反应, 进而抑制肿瘤生长及转移。 这方面的新技术开发对抗癌原研。

12、药研发具有重要的现实意义。 发明内容 0007 本发明为旨在提供一种化药阿霉素及免疫佐剂组合的药物脂质体, 其优点在于: 通过制备化药阿霉素与免疫佐剂共载的脂质体, 可开展针对肿瘤的化疗-免疫联合治疗实 现协同效应, 即在阿霉素有效杀伤肿瘤细胞同时, 免疫佐剂放大癌细胞死亡后其肿瘤相关 抗原的免疫原性, 引发更强的人体对肿瘤特异性免疫反应, 达到抑制肿瘤生长及转移的目 的。 说明书 1/8 页 4 CN 112137958 A 4 0008 此外, 本发明可控制含阳离子脂质的脂质体粒径位于50nm-200nm之间, 使其对免 疫佐剂的包裹效率超过90而不影响体内施用稳定性。 同时, 配方加入胆。

13、固醇和抗氧化剂 维生素E, 使得脂质体中阿霉素或免疫佐剂的稳定性大大提高。 另外, 由于阿霉素和免疫佐 剂共载脂质体在生产过程中关键步骤可由高效的微射流高压均粒机来完成, 而且该制剂也 可通过冻干制成冻干剂型来保存, 使该制剂的工业化生产成为可能。 0009 本发明的目的可以通过以下方法以实现: 一种共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体注射剂及其制备, 其特征在于每1000ml制 剂的原料配方为: 阿霉素或盐酸阿霉素500mg5000mg 免疫佐剂50mg5000mg 中性磷脂240mg30000mg PEG化磷脂 (DSPE-PEG) 50mg20000mg 正电荷磷脂2mg20000mg 胆。

14、固醇10mg15000mg 维生素E 0.25mg480mg 碱20mg35000mg 糖28g200g 缓冲剂1g100g 注射用水定容至1000ml 其中, 阿霉素或盐酸阿霉素和免疫佐剂的重量比例为0.1 1-100 1, 阿霉素或盐酸阿霉 素和磷脂的重量比例为0.1 1-2 1, 正电荷磷脂和中性磷脂的摩尔比例为0.05 5-2 5, 胆固 醇和中性磷脂的摩尔比例为0.1 1-1 1。 0010 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中中性磷脂可以是氢化大豆卵 磷脂、 蛋黄卵磷脂、 氢化蛋黄卵磷脂、 双硬脂酸卵磷脂、 大豆卵磷脂、 双软脂酸卵磷脂或双肉 豆寇酸卵磷脂; 优选地, 。

15、所述中性磷脂为氢化大豆卵磷脂。 0011 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中免疫佐剂可以是负电荷免疫 佐剂CpG、 PolyIC、 PolyICLC、 MPL、 MPL-TDM、 脂多糖中至少一种。 0012 优选地, 所述免疫佐剂为CpG和脂多糖质量1:1配比。 0013 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中正电荷磷脂可以是DOTAP, DOTMA, DOSPA, DODMA, Dlin-MC3-DMA, Dlin-KC2-DMA, c12-200。 0014 优选地, 所述正电荷磷脂为DOTAP。 0015 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中维生素E。

16、和磷脂的摩尔比例 为0.1 5-1 5。 0016 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中碱可以是碳酸钙、 碳酸钠、 碳 酸氢钠、 氢氧化钠或磷酸钾。 0017 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中糖可以是乳糖、 麦芽糖、 蔗 糖、 葡萄糖或海藻糖。 0018 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其中缓冲剂可以是左氨酸、 组氨 说明书 2/8 页 5 CN 112137958 A 5 酸或缓血酸胺。 0019 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体, 其剂型可以是注射液、 冻干粉。 0020 所述的共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体的制备方法, 包含下列步骤: 。

17、步骤一、 制备空白脂质体: 根据配方选用中性磷脂、 正电荷磷脂、 胆固醇和维生素E按照 一定质量比例加入于一体积质量浓度4-10%的乙醇溶液中, 升温至60溶解均匀以形成溶 解脂质的乙醇溶液, 备用; 另配制浓度250mM的硫酸铵注射用水溶液并升温至55-65, 并加 热条件下将上述溶解脂质的乙醇溶液高速注入其中, 所形成乳液用高射流挤出设备或物理 挤压过相应孔径的微孔膜来制得粒径范围在50-200nm空白脂质体。 再以3-20的糖水溶液 置换空白脂质体的溶剂体系。 0021 步骤二、 制备共载阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体: 将盐酸阿霉素或阿霉素以 及免疫佐剂按一定比例溶于注射用水或浓度为3。

18、-20的糖水溶液, 加热到40-70后与步 骤一所制得的空白脂质体混合均匀, 并在40-70下保温一段时间, 制得共载阿霉素与免疫 佐剂的脂质体。 0022 步骤三、 调节制剂脂质体溶剂体系: 采用0.2-10缓冲剂调节含抗氧化剂、 碱、 糖 等稳定剂的注射用水至PH5-7, 利用渗析过滤法置换共载阿霉素与免疫佐剂的脂质体的外 溶液, 使共载脂质体分散在与人体生理环境类似的等渗溶液中。 0023 步骤四、 定容、 除菌、 分装、 保存: 用注射用水定容后, 将阿霉素或盐酸阿霉素脂质 体悬浮液用微孔膜过滤除菌, 分装即得成品, 成品可在2-8下保存或冻干保存至使用。 附图说明 0024 图1是本。

19、发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/CpG&LPS-Lip的透射电镜照片。 0025 图2是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/CpG&LPS-Lip的粒径分布图。 0026 图3是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/PolyICLC-Lip的透射电镜照片。 0027 图4是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/PolyICLC-Lip的粒径分布图。 0028 图5是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/MPL-TDM-Lip的透射电镜照片。 0029 图6是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体ADR/MPL-TDM-Lip的粒径分布图。 0030 图7是本发明实例中阿霉素和免疫佐剂。

20、共载脂质体中化药阿霉素的体外释放曲 线。 0031 图8是本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体处理后肿瘤微环境中颗粒酶B的激活 状态。 0032 图9本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体治疗肝癌移植瘤动物模型的肿瘤生长曲 线。 0033 图10本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体治疗乳腺癌移植瘤动物模型的肿瘤生 长曲线。 0034 图11本发明阿霉素和免疫佐剂共载脂质体对体内组织器官的毒性作用评价。 具体实施方式 0035 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。 0036 实施例1: 制备阿霉素与CpG&脂多糖共载脂质体 (ADR/CpG&LPS-Lip) 说明书 3/8 页 6 CN 112137。

21、958 A 6 制剂处方 (50ml容量) : 盐酸阿霉素100mg CpG 10mg 脂多糖 10mg 双硬脂酸卵磷脂 (DSPC) 640mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)220mg DOTAP 140mg 胆固醇190mg 维生素E 2.4mg 柠檬酸1120mg 无水碳酸钠1600mg 蔗糖约4500mg 甘氨酸约50mg 注射用水定容至所需容量 制剂工艺如下: 根据配方选用DSPC、 DSPE-PEG2000、 DOTAP、 胆固醇和维生素E在4%乙醇溶液中混合均匀 升温至50; 另配制浓度250mM的硫酸铵溶解盐酸阿霉素、 CpG和脂多糖并。

22、升温至55-65, 并加热条件下将脂质溶液快速注入其中, 形成乳液, 用高射流挤出器制得粒径范围在50- 200nm空白脂质体。 再5的糖水溶液透析置换空白脂质体的溶剂体系。 另外将盐酸阿霉素 以及免疫佐剂溶于5的糖水溶液, 加热到50后与空白脂质体悬浮液混合均匀, 并在50 下保温3个小时, 制得共载阿霉素与免疫佐剂的脂质体, 继续并以1.0的甘氨酸, 碳酸氢铵 调节PH至6.0-7.0的外溶液置换为的脂质体分散液, 用含糖注射用水定容并调节至阿霉素 的浓度为2.0mg/ml, 将阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜 过滤除菌, 分装即得成品, 成品可在2-8下保存。

23、或冻干保存至使用。 以透射电子显微镜及 马尔文激光粒度仪检测产出脂质体制剂的外观形态与粒径。 透射电镜结果详见图1, 粒径结 果详见图2。 0037 实施例2: 制备阿霉素与PolyICLC共载脂质体 (ADR/PolyICLC-Lip) 制剂处方 (50ml容量) : 盐酸阿霉素100mg PolyICLC 20mg 氢化大豆卵磷脂 (HSPC) 760mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400 (DSPE-PEG3400) 220mg Dlin-MC3-DMA 220mg 胆固醇220mg 维生素E 2.0mg 琥珀酸600mg 氢氧化钠340mg 乳糖约2250mg 甘氨酸约70mg。

24、 说明书 4/8 页 7 CN 112137958 A 7 注射用水定容至所需容量 制剂工艺如下: 根据配方选用HSPC、 DSPE-PEG3400、 Dlin-MC3-DMA、 胆固醇和维生素E在4%乙醇溶液中 混合均匀升温至65; 另配制浓度250mM的硫酸铵溶解盐酸阿霉素和PolyICLC并升温至55- 65, 并加热条件下将脂质溶液快速注入其中, 形成乳液, 用高射流挤出器制得粒径范围在 15010nm空白脂质体。 再5的糖水溶液透析置换空白脂质体的溶剂体系。 另外将盐酸阿 霉素以及免疫佐剂溶于5的糖水溶液, 加热到50后与空白脂质体悬浮液混合均匀, 并在 50下保温3个小时, 制得共。

25、载阿霉素与免疫佐剂的脂质体, 继续并以1.0的甘氨酸, 氢氧 化钠调节PH至7.3的外溶液置换为的脂质体分散液, 用含糖注射用水定容并调节至阿霉素 的浓度为2.0mg/ml, 将阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微孔膜 过滤除菌, 分装即得成品, 成品可在2-8下保存或冻干保存至使用。 以透射电子显微镜及 马尔文激光粒度仪检测产出脂质体制剂的外观形态与粒径。 透射电镜结果详见图3, 粒径结 果详见图4。 0038 实施例3: 制备阿霉素与MPL-TDM共载脂质体 (ADR/MPL-TDM-Lip) 制剂处方 (50ml容量) : 盐酸阿霉素100mg MPL-TDM 35。

26、mg 双硬脂酸磷脂酰甘油 (DSPG) 160mg 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000 (DSPE-PEG5000) 220mg 蛋黄磷脂酰甘油 (EPG) 240mg c12-200 220mg 胆固醇220mg 维生素E 1.6mg 柠檬酸 1240mg 氢氧化钠520mg 蔗糖约2250mg 甘氨酸约50mg 注射用水定容至所需容量 制剂工艺如下: 根据配方选用DSPG、 EPG、 c12-200、 DSPE-PEG5000、 胆固醇和维生素E在4%乙醇溶液中混 合均匀升温至60; 另配制浓度250mM的硫酸铵溶解盐酸阿霉素和MPL-TDM并升温至60, 并加热条件下将脂质溶液快速。

27、注入其中, 形成乳液, 用微孔膜基础设备来制得粒径范围在 12010nm空白脂质体。 再5的糖水溶液透析置换空白脂质体的溶剂体系。 另外将盐酸阿 霉素以及免疫佐剂溶于5的糖水溶液, 加热到50后与空白脂质体悬浮液混合均匀, 并在 50下保温3个小时, 制得共载阿霉素与免疫佐剂的脂质体, 继续并以1.0的甘氨酸, 氢氧 化钠调节PH至7.00.5的外溶液置换为的脂质体分散液, 用含糖注射用水定容并调节至阿 霉素的浓度为2.0mg/ml, 将阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体悬浮液用0.22微米孔径的微 孔膜过滤除菌, 分装即得成品, 成品可在2-8下保存或冻干保存至使用。 以透射电子显微 镜及马尔文。

28、激光粒度仪检测产出脂质体制剂的外观形态与粒径。 透射电镜结果详见图5, 粒 说明书 5/8 页 8 CN 112137958 A 8 径结果详见图6。 0039 实施例4: 检测阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体的性质参数 采用激光粒径仪测实施例13所制备ADR/CpG-LPS-Lip、 ADR/PolyICLC-Lip、 ADR/MPL- TDM-Lip溶液的粒径以及zeta电位值; 通过高效液相色谱方法 (HPLC, 美国Agilent公司; 色 谱条件: 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 以十二烷基硫酸钠溶液-乙腈-甲醇为流动相; 检 测波长254nm; 参比试剂: 盐酸多柔比星对照品和盐酸表。

29、柔比星对照品, 流速1ml/min; 柱温 25) , 测定上述脂质体中阿霉素含量, 计算获得脂质体中阿霉素的包封率, 公式: 阿霉素的 包封量 = MADR包 封/MADR投 入100%, 结果详见表1。 0040 实施例5: 检测阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体的体外药物释放曲线 将实施例13所制备ADR/CpG&LPS-Lip、 ADR/PolyICLC-Lip、 ADR/MPL-TDM-Lip溶液个 2ml分别放置于300KD透析袋中, 并置于1000毫升PBS溶液 (PH=7.4) 的烧杯中进行恒温水浴 震摇 (温度37, 震摇速率110 rpm) , 并开始从零计时。 在设定时间点 。

30、(第0、 2、 5、 24、 36、 120、 240、 240小时) , 吸取透析袋中的溶液, 利用高效液相色谱方法检测阿霉素的含量 (检测参数 如实施例4) 。 计算药物阿霉素的体外释放速率。 结果如实施图7所示, 各种阿霉素脂质体的 药物释放10天累计释放超过90%。 0041 实施例6: 测定阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体提高肿瘤微环境中的肿瘤特异 性CD8+T细胞数量增加 利用HepG2肝癌以及7721乳腺癌细胞在C57BL6小鼠中建立肝癌或乳腺癌移植瘤动物模 型, 待肿瘤体积100立方毫米时, 随机 (如下) 分组, 分别在1、 8、 11、 15、 18、 22、 25天给药进行。

31、 治疗, 其中单次给药剂量阿霉素2mg/kg, 同种免疫佐剂剂量相同。 第26天时, 处死小鼠并取 出肿瘤进行流式细胞术分析, 通过SIINFEKL-Kb四聚体染色来检测肿瘤微环境中的肿瘤特 异性CD8+T细胞数量 (肿瘤抗原特异性T细胞: CD3+/ CD8+/SIINFEKL-H2Kb tetramer+) 。 肿 瘤微环境中的CD8+ T激活状态通过用颗粒酶B染色进行分析: 分组1: 生理盐水组 分组2: 阿霉素脂质体 分组3: 阿霉素脂质体+皮下注射CpG和LPS混合佐剂组 分组4: 阿霉素脂质体+皮下注射PolyICLC组 分组5: 阿霉素脂质体+皮下注射MPL-TDM组 分组6: 。

32、ADR/CpG&LPS-Lip组 分组7: ADR/PolyICLC-Lip组 分组8: ADR/MPL-TDM-Lip组 通过SIINFEKLH2Kb四聚体同源抗原流式检测, 肿瘤特异性T细胞在生理盐水组别处于 低水平状态, 与用生理盐水处理的对照组中分离得到的CD8+ T细胞 (设定为1) 相比, 各治疗 说明书 6/8 页 9 CN 112137958 A 9 组别中小鼠肿瘤微环境中提取的CD8+ T细胞如下表2, 可见阿霉素与免疫佐剂组合药物脂 质体显著增加肿瘤微环境CD8+ T细胞数量。 0042 实施例7: 检测阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体引发肿瘤微环境中CD8+T细胞处于激 活。

33、状态 利用SiHa宫颈癌细胞在C57BL6小鼠中建立肝癌或乳腺癌移植瘤动物模型, 待肿瘤体积 150立方毫米左右时, 随机 (如下) 分组, 分别在8、 11、 15、 18、 22、 25天给药进行治疗, 其中单 次给药剂量统一为阿霉素2mg/kg, 同种免疫佐剂剂量相同。 第26天时, 处死小鼠并取出肿瘤 进行福尔马林固定。 经组织切片后, 采用颗粒酶B染色方法分析肿瘤微环境中的CD8+ T激活 状态: 分组1: 生理盐水组 分组2: 阿霉素脂质体 分组3: 阿霉素脂质体+皮下注射CpG和LPS混合佐剂组 分组4: 阿霉素脂质体+皮下注射PolyICLC和MPL-TDM混合佐剂组 分组5:。

34、 ADR/CpG&LPS-Lip组 分组6: ADR/PolyICLC-Lip组 分组7: ADR/MPL-TDM-Lip组 通过对各组别处理后SiHa宫颈癌组织切片后的颗粒酶B染色 (图8) 比较, 结果显示: 相 比于皮下单独佐剂免疫组, 阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体能够所引发CD8+ T细胞处于 更为强烈激活状态 (染色密集且颜色更深) 。 0043 实施例9: 测定阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体对7721乳腺癌细胞移植瘤小鼠 模型的治疗效果 利用HepG2肝癌以及7721乳腺癌细胞在C57BL6小鼠中建立乳腺癌移植瘤动物模型, 待 肿瘤体积150立方毫米时, 每5只随机 (如下) 分。

35、组, 分别在8、 11、 15、 18、 22、 25天给药进行治 疗, 其中单次给药剂量阿霉素为2mg/kg, 同种免疫佐剂剂量相同。 然后在不同时间点用游标 卡尺测定肿瘤体积, 肿瘤体积的计算公式: 肿瘤体积 = (长宽2) /2。 绘制肿瘤生长曲线, 肿 说明书 7/8 页 10 CN 112137958 A 10 瘤生长曲线结果如图9、 10所示阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体显示出良好的抗肿瘤活 性, 有效提升肿瘤微环境的CD8+ T细胞数量与激活状态, 在动物体内实现肿瘤抑制效果: 分组1: 生理盐水组 分组2: 阿霉素脂质体 分组3: 阿霉素脂质体+皮下注射CpG和LPS混合佐剂组。

36、 分组4: 阿霉素脂质体+皮下注射PolyICLC和MPL-TDM混合佐剂组 分组5: ADR/CpG&LPS-Lip组 分组6: ADR/PolyICLC-Lip组 分组7: ADR/MPL-TDM-Lip组。 0044 实施例8: 阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体的体内器官毒性 取雄性健康SD大鼠15只, 随机分为三组, 每组5只, 分别尾静脉注射1ml的ADR/CpG&LPS- Lip组 (阿霉素剂量为1mg/ml) , 每隔一天注射一次, 连续注射第三次后, 处死大鼠, 取心肝肾 等主要脏器, 以福尔马林固定后, 切片及HE染色, 观察阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体对 动物的重要器官是否。

37、具有毒副作用, 具体HE结果如图11所示, 未见动物的主要脏器出现毒 性损伤。 0045 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上, 然其并非用以限定本发明, 任何本领域技 术人员, 在不脱离本发明的精神和范围内, 当可作些许的修改和完善, 因此本发明的保护范 围当以权利要求书所界定的为准。 说明书 8/8 页 11 CN 112137958 A 11 图1 图2 说明书附图 1/5 页 12 CN 112137958 A 12 图3 图4 说明书附图 2/5 页 13 CN 112137958 A 13 图5 图6 说明书附图 3/5 页 14 CN 112137958 A 14 图7 图8 图9 说明书附图 4/5 页 15 CN 112137958 A 15 图10 图11 说明书附图 5/5 页 16 CN 112137958 A 16 。

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内容关键字: 阿霉素 免疫佐剂 组合 药物 脂质体 及其 制备 方法
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