用于强化毛根的化妆品组合物.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010556154.4 (22)申请日 2020.06.17 (30)优先权数据 10-2019-0076570 2019.06.26 KR (71)申请人 科丝美诗株式会社 地址 韩国京畿道 (72)发明人 庆瑞娟姜秉夏吕炫周姜承贤 朴明三 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 薛琦 (51)Int.Cl. A61K 8/63(2006.01) A61K 8/42(2006.01) A61K 8/34(2006.01) A61K 8/67(2006。

2、.01) A61K 31/56(2006.01) A61Q 7/00(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61P 17/14(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61K 31/164(2006.01) A61K 31/045(2006.01) (54)发明名称 一种用于强化毛根的化妆品组合物 (57)摘要 本公开涉及一种用于促进发毛或养发的组 合 物 。 根 据一方 面的 包括1 8 - 甘草次 酸 (Glycyrrheticacid)、 D-泛醇(panthenol)以及 薄荷醇(Menthol)作为有效成分的组合物可以通 过增加人毛乳头细胞的。

3、增殖并有效地增进作为 诱导头发生长的生长因子的血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor:VEGF) 和成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor:FGF)的基因表达来促进生发和养发, 从 而, 可以广泛使用为用于强化毛根或防止脱发的 化妆品和药学组合物。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 112137910 A 2020.12.29 CN 112137910 A 1.一种用于促进生发或养发的化妆品组合物, 其包括18 -甘草次酸、 D-泛醇以及薄荷 醇作为有效成分。 2.如权利要求1所述的化妆品组合物, 。

4、其以1:0.5至3的浓度比包括D-泛醇和薄荷醇。 3.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其以1:5至60:5至60的浓度比包括18 -甘草次 酸、 D-泛醇, 以及薄荷醇。 4.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其进一步包括烟酰胺作为有效成分。 5.如权利要求4所述的化妆品组合物, 其以1:25至40: 25至40: 25至40的浓度比包括18 -甘草次酸、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺。 6.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其中, 所述18 -甘草次酸溶解于水、 具有一个至 四个碳素原子的低级醇或其混合溶剂中。 7.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其中, 相对于组合物总重量, 所述有效成。

5、分的含 量为0.001重量至30重量。 8.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其中, 所述组合物增殖人毛囊毛乳头细胞。 9.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其中, 所述组合物增加血管内皮生长因子以及成 纤维细胞生长因子7的表达。 10.如权利要求1所述的化妆品组合物, 其中, 所述化妆品组合物是洗发剂、 洁肤液、 护 发素、 护发剂、 发膜、 冲洗型护发素、 头皮膜、 护发液、 精华素、 乳液、 发乳、 发油、 喷雾、 发胶或 啫喱水。 11.一种用于强化毛根的化妆品组合物, 其包括18 -甘草次酸、 D-泛醇以及薄荷醇作为 有效成分。 12.一种用于预防或治疗脱发的药学组合物, 其包括18。

6、 -甘草次酸、 D-泛醇以及薄荷醇 作为有效成分。 13.一种用于促进生发或养发的皮肤外用剂组合物, 其包括18 -甘草次酸、 D-泛醇以及 薄荷醇作为有效成分。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112137910 A 2 一种用于强化毛根的化妆品组合物 0001 相关申请的交叉引用 0002 本申请要求于2019年06月26日提交的韩国专利申请No.10-2019-0076570的优先 权和权益, 其通过引用合并于此用于所有目的, 如同在此完全阐述一样。 技术领域 0003 本公开涉及一种用于促进发毛或强化毛根的化妆品组合物。 背景技术 0004 对于人体, 头发从位于头皮的毛囊中生长, 。

7、在一生期间持续地反复生长期 (Anagen)、 退行期(Catagen)、 休止期(Telogen)等周期并经过生成、 成长、 脱落(Paus et al.,J Invest Dermatol,113,第523-532页,1999年)。 在毛囊的退行期毛囊中止成长, 且发 生细胞死灭以及细胞核基质的重组, 因此, 处于毛囊的退行期及休止期状态的毛囊细胞越 增加, 就显示头发脱落并不再生长的脱发现象。 0005 头发区分为可以用肉眼看到的毛干部分和不能用肉眼看到的毛根部分, 在毛根部 分中, 将头发生长的根子称为毛球(Hair bulb), 将其下陷没的部分称为毛乳头(图1)。 毛乳 头时为头发。

8、的产生最关键的部分, 其具有血管和神经而传输营养和生长因子来促进头发的 生长。 毛乳头细胞的死灭和生长的减少导致头发数量的减少, 因此, 为了头发的维持和增加 需要增殖毛乳头细胞。 0006 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor:VEGF)为通过诱导血 管内皮细胞的生长来促进新血管产生的糖蛋白。 VEGF附着于存在于毛乳头中的血管内皮生 长因子受体-2(VEGFR-2)并激化VEGF-2/ERK途径来诱导毛乳头细胞的增殖(Exp Cell Res.2012 318(14):1633-40,2010)。 并且, 成纤维细胞生长因子(Fibrobl。

9、ast growth factor 7:FGF 7)为通过干预露出于毛囊外部和头皮表面的头发部分的生长来调节生发周 期的增殖因子(GENES&DEVELOPMENT.1996,10:165-175)。 因此, 在毛乳头细胞中的VEGF和 FGF7基因表达的增加可以有助于诱导头发生长。 0007 最近, 随着环境污染和城市压力的恶化, 具有脱毛症的现代人越来越增加, 因此, 对能够改善该问题的物质的关注也越来越增加。 因此, 本发明人的意图在于发明通过在毛 根部中担当头发生成之起初的生长因子表达来诱导头发的生长并强化毛根且有助于预防 脱发的物质。 0008 18 -甘草次酸(Glycyrrhet。

10、ic acid)为白色或乳白色的结晶性粉末, 且是可以通 过对包括在甘草的根中的甘草精进行水解来获得的物质, 通过优异的抗炎症作用在皮肤中 缓解刺激, 其有效性以过剩的皮脂分泌抑制出名。 同时, D-泛醇(Panthenol)被称为有渗透 性的保湿剂, 并且已知具有对皮肤和头发给调理效果且增加损伤头发的回复的效能。 薄荷 醇(Menthol)已以血行改善效能闻名, 已知烟酰胺(Niacinamide)对头发粗度的改善有效果 (British J.Dermatol.165.s3:24-30,2011.J Cosmet Dermatol.4(4):258-61,2005), 然 而, 混合18 -。

11、甘草次酸、 D-泛醇以及薄荷醇成分的用于促进生发或养发的组合物还未报告。 说明书 1/10 页 3 CN 112137910 A 3 0009 现有技术文献 0010 专利文献 0011 (专利文献1)韩国公开专利第10-2014-0022378号。 0012 (专利文献2)韩国公开专利第10-2015-0066811号。 发明内容 0013 技术问题 0014 一方面提供一种用于促进生发或养发的化妆品组合物, 其包括18 -甘草次酸 (Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0015 一方面提供用于强化毛根的化妆品组。

12、合物, 其包括18-甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0016 一方面提供 用于预防 或 治疗脱毛的 药学组 合物 , 其包括1 8-甘草次 酸 (Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0017 另一方面提供用于促进生发或养发的皮肤外用剂组合物, 其包括18-甘草次酸 (Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0018 技术方案 0019 一方面提供用。

13、于促进生发或养发的皮肤外用剂组合物, 其包括18 -甘草次酸 (Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0020 一方面提供用于强化毛根的化妆品组合物, 其包括另一方面提供用于促进发毛或 养毛的皮肤外用剂组合物, 其包括18-甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇 (Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0021 已知, 所述18 -甘草次酸为包括在甘草根提取物中的有效成分且为甘草亭的配糖 体, 且具有如类固醇急速具有的抗炎症作用。 已知, D-泛醇(Panthenol)。

14、作为具有渗透性的 保湿剂, 赋予皮肤和头发的调养效果且促进损伤头发的回复, 且已知薄荷醇具有改善头皮 中的血行的效果。 已确认, 由于根据一方面的组合物通过包括18 -甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分使发生的人毛乳头细胞 (Human Follicular Dermal Papilla Cells:HFDPC)的细胞增殖功能显著增加且作为促进 头发生长的生长因子的VEGF和FGF7的表达显著增加, 由此确认表达有效的生发或养发促进 功能。 0022 根据一方面的组合物可以例如以1:0.5至3的浓度比、 1。

15、:0.7至2的浓度比或1:1的 浓度比包括D-泛醇(Panthenol)和/或薄荷醇(Menthol)。 并且, 所述组合物可以例如以1:5 至25: 5至25的浓度比、 1: 6至23: 6至23的浓度比、 1: 7至20: 7至20的浓度比、 1: 7.5至20: 7.5 至20的浓度比, 或1:10至20: 10至20的浓度比包括18- 甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D- 泛醇(Panthenol)和/或薄荷醇(Menthol)。 0023 根据一方面的组合物可以进一步包括烟酰胺作为有效成分, 因此, 所述组合物可 以以例如1:10至60:10至60的浓度比、 1:2。

16、0至50:20至50的浓度比, 或1:25至40:25至40:25 至40的浓度比包括18 -甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol), 薄荷醇 (Menthol)以及烟酰胺。 0024 可以使用来自甘草根提取物的18 -甘草次酸作为包括在根据一方面的组合物中 说明书 2/10 页 4 CN 112137910 A 4 的18 -甘草次酸, 来自甘草根提取物的18 -甘草次酸的收得方法不受特别限制, 且可以使 用上市的18 -甘草次酸。 具体地, 所述18 -甘草次酸可以溶解于水、 具有一个至四个碳素原 子的低级醇或其混合溶解中来使用, 在一具体实施例中。

17、, 将溶解于99乙醇的5重量的18 -甘草次酸溶解物包括作为所述组合物。 0025 相对于组合物的总重量, 根据一方面的组合物的含量例如可以时0.001至30重量 或0.001至10重量。 当在所述组合物中作为有效成分的18 -甘草次酸(Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及薄荷醇的含量少于0.001重量时难以达到生发或养发促进 效果, 在其含量超过30重量可能难以制备且其使用感也降低。 0026 所述用于促进生发或养发的组合物对改善由外源性因素或内源性因素引起的脱 发有效。 所述外源性因素是指各种外部因素, 例如紫外线, 内源性因素是指由于时间的经过 产生的。

18、因素, 包括由于端粒的毛乳头细胞的死灭和随着细胞功能降低的氧化压力等。 0027 在本说明书中, 术语 “促进养发” 是指通过促进头发的生成和生长来最终增加整个 头发中的生长期头发的比例, 且指抑制由于成长期头发比例的减少引起的脱发, 即具有与 “改善脱发” 、“预防脱发” 以及 “治疗脱发” 相同的意味, 在本说明书中可以自由地混用。 0028 根据一方面的用于促进生发或养发的组合物可以有效地增殖人毛乳头细胞 (Human Follicular Dermal Papilla Cells:HFDPC), 且可以增加血管内皮生长因子 (Vascular endothelial growth fa。

19、ctor:VEGF)以及成纤维细胞生长因子7(Fibroblast growth factor7:FGF7)的基因表达, 通过促进营养被传递到毛乳头细胞且诱导毛根部细胞 的生长, 从而可以强化毛根且有效地促进养毛和张茂, 因此有促进头发的生长且预防或改 善脱发的效果。 0029 除了由本说明书公开的有效成分之外, 所述化妆品组合物可以进一步包括功能性 添加物和包括在普通化妆品组合物的成分, 进一步可以常用的辅助剂和载体, 例如, 常用的 抗氧化剂、 稳定化剂、 溶解剂、 维生素、 颜料、 香料等。 例如, 所述化妆品组合物可以进一步包 括甘油、 丁二醇、 聚氧乙烯、 硬化蓖麻油、 醋酸生育酚、。

20、 柠檬酸、 鲨烷、 柠檬酸钠、 尿囊素等辅 助成分, 可以包括己二醇、 纯净水等作为溶剂。 并且, 可以包括选自水溶性维生素、 油溶性维 生素、 高分子肽、 高分子多糖、 鞘脂及海藻精中的成分作为所述功能性添加物。 此外, 所包括 的配合成分还有油脂成分、 保湿剂、 收敛剂、 表面活性剂、 有机和无机颜料、 有机粉体、 紫外 线吸收剂、 防腐剂、 杀菌剂、 抗氧化剂、 植物提取物、 pH调节剂、 醇、 色素、 香料、 血行促进剂、 冷感剂、 制汗剂、 纯净水等。 0030 根据一方面的化妆品组合物例如可以包括养发素、 润发精、 亮发素、 润发露、 营养 润发露、 洗发水、 冲洗型护发素、 护发。

21、剂、 发乳、 营养发乳、 头发保湿霜、 头发按摩霜、 发蜡、 头 发喷雾剂、 发膜、 营养发膜、 发皂、 洗发泡沫、 发油、 头发干燥剂、 头发保存处理剂、 染发剂、 发 波剂、 头发脱色剂、 发胶、 发釉、 护发霜、 粘发剂、 头发保湿剂、 摩丝或发胶, 具体可以是洗发 剂、 洁肤液、 护发素、 护发剂、 发膜、 冲洗型护发素、 头皮膜、 护发液、 精华素、 乳液、 发乳、 发 油、 喷雾、 发胶或啫喱水剂型。 0031 所述化妆品组合物在其剂型上不受特别的限制, 且可以根据目的合理选择。 例如, 可以被制成选自润肤液、 柔肤水、 爽肤水、 收敛剂、 乳液、 牛奶润肤露、 保湿乳液、 营养液。

22、、 按 摩霜、 营养霜、 保湿霜、 手霜、 粉底、 精华素、 面膜、 香皂、 洁面泡沫、 洁面乳、 洁面霜、 身体乳液 及身体清洁液中的至少一个的制成, 但不限于此。 说明书 3/10 页 5 CN 112137910 A 5 0032 在根据一方面的组合物剂型为糨糊、 霜或凝胶时, 可以使用动物纤维、 植物纤维、 蜡、 石蜡、 淀粉、 黄嗜胶、 纤维素衍生物、 聚乙二醇、 硅、 皂粘土、 二氧化硅、 滑石粉或氧化锌等 作为载体成分。 0033 在根据一方面的组合物剂型为粉末或喷雾剂时, 可以使用乳糖、 滑石粉、 二氧化 硅、 氢氧化铝、 硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体成分, 尤其是所述组合物为喷。

23、雾剂时, 可以进 一步包括含氯氟烃、 丙烷/丁烷或二甲醚的促进体。 0034 在根据一方面的组合物剂型为溶液或乳浊液时, 使用溶剂、 溶剂化剂或乳浊化剂, 例如, 水、 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 苄醇、 苄甲酸苄酯、 丙二醇、 1,3-丁基乙二醇 油、 甘油脂肪酸酯、 聚乙二醇或脂肪酸山梨醇酯。 0035 根据一方面的组合物剂型为悬浮液时, 可以使用水、 乙醇或丙二醇等液相稀释剂、 乙氧基化异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨醇酑酯等悬浮剂、 微小结晶性纤维 素、 偏铝酸、 皂粘土、 琼脂或黄嗜胶等。 0036 当根据一方面的组合物的剂型为包括表面活性剂的清洁剂时, 可以。

24、使用脂肪醇硫 酸盐、 脂肪醇醚硫酸盐、 磺基琥珀酸单酯、 羟乙磺酸盐、 咪唑啉衍生物、 牛黄酸甲酯、 肌胺酸 盐、 脂肪酸胺醚硫酸盐、 烷基酰胺甜菜碱、 脂族醇、 脂肪酸甘油酯、 脂肪酸二乙醇酰胺、 植物 油、 羊毛脂衍生物或乙氧基化脂肪酸甘油酯作为载体成分。 0037 一方面提供 用于预防 或 治疗脱毛的 药学组 合物 , 其包括1 8-甘草次 酸 (Glycyrrhetic acid)、 D-泛醇(Panthenol)及/或薄荷醇(Menthol)作为有效成分。 0038 在本说明书中, 术语 “脱发(Alopecia)” 是指头发从头皮脱落的现象或头发变得稀 少或变细的状态,“预防或改善。

25、脱发” 是指预防和抑制如上所述的脱发,“促进养毛或促进发 毛” 是指不仅促进生成新头发还使已有的头发健康地成长。 所述脱毛可以是选自局限性脱 发(Alopecia Areata)、 雄源遗传性脱发(Androgenetic Alopecia)、 休止期脱发(Telogen Effluvium)、 外伤性脱发、 拔毛癖(Trichotillomania)、 压迫性脱发(Pressure Alopecia)、 生长期脱发、 秕糠性脱发、 梅毒性脱发(Alopecia Syphlltiac)、 脂溢性脱发(Alopecia Seborrhecia)、 症候性脱发、 瘢痕性脱发及先天性脱发中的一个以上。

26、。 0039 除了由本说明书公开的有效成分之外, 所述药学组合物可以进一步包括防腐剂、 稳定化剂、 水和剂或乳化促进剂、 用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等药学辅助剂和其他有 用于治疗的物质, 且可以根据通常的方法将所述药学组合物制备成各种经口施药剂或非经 口施药剂。 0040 并且, 所述组合物可以进一步包括烟酰胺作为有效成分。 0041 所述经口施药剂例如有片剂、 丸剂、 硬质和软质胶囊剂、 液剂、 悬浮剂、 乳化剂、 粉 剂、 散剂、 细粒剂、 颗粒剂和丸等, 除了有效成分之外, 这些剂型还可以包括表面活性剂、 稀 释剂(例如:乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇、 山梨醇、 纤维素和甘氨酸)。

27、和润滑剂(例如:二氧化 硅、 滑石粉、 脂肪酸酯和其镁盐或钙盐以及聚乙二醇)。 片剂还可以包括诸如硅酸镁铝、 淀粉 糨糊、 明胶、 西黄嗜胶、 羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮等结合剂, 并且, 可以根据情况包 括淀粉、 琼脂、 褐藻酸盐或其钠盐等的崩解剂、 吸收剂、 着色剂、 香味剂和甜味剂等药学添加 剂。 可以通过使用通常的混合、 制粒或涂层方法制造所述药片。 0042 并且, 所述非经口施药形式可以采用经皮施药型剂型, 例如可以是注射剂、 滴定 剂、 软膏、 乳液、 凝胶、 霜、 喷雾剂、 悬浮剂、 乳剂、 坐剂、 贴片等剂型, 但不限于此。 说明书 4/10 页 6 CN 1121379。

28、10 A 6 0043 可以通过肠胃外、 直肠、 局部、 头皮、 皮下等给予所述药学组合物。 根据一方面的组 合物的根据一实施例的药学组合物例如可以局部施药于头皮。 0044 所述有效成分的施药量确定属于本领域普通技术人员的水平, 药物的一日施药容 量根据待施药的对象的进行程度、 发病时期、 年龄、 健康状态、 并发症等各种因素不同, 然 而, 以成年人为准, 根据一方面将所述组合物1 g/kg至200mg/kg或根据另一方面将50 g/kg 至50mg/kg分成一天一次至三次来施药, 且所述施药量不以任何方法限制本发明的范围。 0045 所述药学组合物可以时皮肤外用剂, 其作为可以包括在皮肤。

29、外部被涂布的任何物 质的总称, 且可以包括各种剂型的医药品。 0046 另一方面提供包括所述组合物的用于生发或养发的皮肤外用剂组合物。 0047 并且, 所述组合物可以进一步包括烟酰胺作为有效成分。 0048 所述皮肤外用剂可以为乳膏、 凝胶、 软膏、 皮肤乳化剂、 皮肤悬浮剂、 经皮传递性贴 片、 含药绷带、 乳液或其组合。 所述皮肤外用剂可以根据需要与通常用于化妆品或医药品等 皮肤外用剂的成分混合, 例如, 水性成分、 油性成分、 粉末成分、 醇类、 保湿剂、 增稠剂、 紫外 线吸收剂、 美白剂、 防腐剂、 抗氧化剂、 表面活性剂、 香料、 着色剂、 各种皮肤营养剂或其组 合。 所述皮肤外。

30、用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、 乙二胺四乙酸三钠、 柠檬酸钠、 多聚 磷酸钠、 偏磷酸钠、 葡萄糖酸等的金属螯合剂、 咖啡因、 单宁、 戊脉安、 甘草提取物、 光甘草 定、 大蓟果实的热水提取物、 各种生药、 生育酚乙酸酯、 甘草酸、 氨甲环酸及其衍生物或其盐 等药剂、 维生素C、 抗坏血酸磷酸酯镁、 抗坏血酸葡糖苷、 熊果苷、 曲酸、 葡萄糖、 果糖、 海藻糖 等的糖类。 附图说明 0049 图1为图示毛发的结构以及毛乳头(Papilla)细胞的图。 0050 图2为图示确认分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇和其混合物的示 例的繁殖功能上升的实验结果的图。 0051 图3。

31、为示出在分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇和其混合物的实例 中的毛乳头细胞的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor:VEGF) 基因表达增加实验的结果的图。 0052 图4为示出在分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇和其混合物的示例 中的毛乳头细胞的成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor7:FGF7)基因表达增 加实验的结果的图。 0053 图5为示出在分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺和其混合物 的示例中确认增殖功能上升的实验结果的图。 0054 图6为。

32、示出在分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺和其混合物 的示例中的毛乳头细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因表达增加实验的结果的图。 0055 图7为示出在分别处理18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺和其混合物 的示例中的毛乳头细胞的成纤维细胞生长因子7(FGF7)基因表达增加实验的结果的图。 具体实施方式 0056 以下, 通过实施例进一步详细描述本公开。 然而, 这些实施例的目的仅在于示例性 说明书 5/10 页 7 CN 112137910 A 7 地描述本公开, 本公开的范围并不受限于这些实施例。 0057 实施例1.18- 甘草次酸溶液的制。

33、备 0058 将从丸善购买的18-甘草次酸的5重量溶解于99乙醇, 并将其适用于从 Promocell公司购买的人毛乳头细胞(Human Follicular Dermal Papilla Cells:HFDPC) 的增殖效能评价和VEGF、 FGF7生长因子基因表达增加效能评价实验。 0059 实施例2.对18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇混合溶液的HFDPC增殖功能上 升效能的评价 0060 在将实施例1的18 -甘草次酸溶液中包括的D-泛醇和薄荷醇处理为不同的比例 时, 以如下的条件执行四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)分析以评价哪种比例的原 料混合物显著地诱导毛乳头细胞地。

34、增殖。 首先, 将HFDPC以2104个细胞/孔分株于96孔板, 并在37、 5二氧化碳条件的培养箱中培养24小时。 然后, 将什么都不包括的培养基、 0.5ppm的18 -甘草次酸( -GA)、 20ppm的D-泛醇、 20ppm的薄荷醇、 10ppm的D-泛醇和10ppm的 薄荷醇(浓度比1:1)的混合物, 以及分别根据不同比例混合的18 -甘草次酸、 D-泛醇和薄荷 醇以包括混合溶液(syn1、 2、 3、 4和5)的培养基替代, 然后进一步培养24小时。 经过24小时 后, 除去每孔中的培养基并经过使用杜氏磷酸盐缓冲食盐水(Dulbeccos phosphate buffered sa。

35、line:DPBS)的一次洗涤过程, 并用每孔500 l的0.5mg/mL的包括MTT四唑氮盐 (Sigma-aldrich,St.Louis,USA)的培养基来替代, 在37度下反应4个小时。 然后, 使用 Victor3在570nm测量吸光度。 将所使用的混合溶液的组成表示在表1中, 知名为头发发育促 进剂的米诺地尔(Minoxidil:MXD)10ppm设置为阳性对照组, 对于细胞的存活率, 将处理什 么都不包括的培养基的示例设置为阴性对照组, 将用相对于其平均吸光度值的百分率表示 的HFDPC增殖功能的测量结果表示在图2中。 0061 表1 0062 0063 如由图2可以确认, 与未。

36、进行溶液处理的阴性对照组相比, 在对18 -甘草次酸、 D- 说明书 6/10 页 8 CN 112137910 A 8 泛醇的单一成分进行处理的组和对D-泛醇和薄荷醇混合物(原始原料混合物)的组中在一 定程度上促进了细胞增殖。 尤其是, 确认在对以不同比例混合的Syn1、 Syn2、 Syn3、 Syn4以及 Syn5进行处理的组中出现了比阳性对照组更加显著的HFDPC细胞增殖功能促进效果。 综上, 在对所述18 -甘草次酸、 D-泛醇和薄荷醇的混合溶液进行处理的组中可以确认优异的细胞 增殖效果, 特别是考虑到所述混合组(Syn1、 2、 3、 4和5)是对少于18 -甘草次酸及D-泛醇的 。

37、个别处理组的处理容量20ppm的溶液含量进行处理的情况, 可以确认在最佳浓度比的混合 溶液中出现的优异的上升效果。 0064 实施例3.对18- 甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇混合溶液的HFDPC生长因子 (VEGF以及FGF7)表达增加效能的评价 0065 进行了定量实时聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction:qRT-PRC)来评价在对实施例1中制造的18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇和 其混合物进行处理时是否能够诱导作为诱导头发生长的生长因子的VEGF和FGF7的表达。 将 HFDPC以3105个细胞/孔分。

38、株于6孔板, 并在细胞培养条件下培养24小时。 经过24小时后, 废弃培养基并用PBS洗涤, 使用未包括培养基补充物的培养基使细胞变成饥饿状态, 第二 天, 将什么都不包括的配给和0.5ppm的18 -甘草次酸( -GA)、 20ppm的D-泛醇、 20ppm的薄荷 醇、 10ppm的D-泛醇和10ppm的薄荷醇(浓度比1:1)的混合物, 以及以不同比例混合的18 -甘 草次酸、 D-泛醇和薄荷醇以包括混合溶液(Syn1、 2、 3、 4和5)的培养基替代, 进一步培养24小 时。 然后, 使用RNeasy小型试剂盒(凯杰)来从细胞分离出RNA, 并使用纳米纳米微滴 (nanodrop)在26。

39、0nm定量RNA, 且分别使用2 g的RNA在增幅器(C1000Thermal Cycler,Bio- Rad,美国)中合成cDNA。 使用在经合成的cDNA中添加作为靶蛋白的VEGF、 FGF7引物作为和氰 蓝燃料的核苷酸胶体燃料(SYBR Green supermix,Applied Biosystems,美国)的混合物来 在实时荧光定量(real-time PCR)仪实施定量实时聚合酶链反应来最终评价VEGF、 FGF7基 因的表达程度。 引物的序列和反应条件如以下的表3所示, 通过对 -actin基因的补正来最 终分析基因的表达量。 将VEGF基因表达程度显示在图3中, 并将FGF7基。

40、因的表达成都显示在 图4中。 将所使用的混合溶液的组成显示在表2中, 将被视为头发发育促进剂的米诺地尔 (Minoxidil:MXD)10ppm设置成阳性对照组, 并将处理什么都不包括的培养基的实例设置为 阴性对照组。 0066 表2 0067 0068 如由图3和4可以确认, 与未进行溶液处理的阴性对照组相比, 在对18 -甘草次酸 说明书 7/10 页 9 CN 112137910 A 9 和D-泛醇的单一成分进行处理的组和对D-泛醇和薄荷醇混合物(原始原料混合物)进行处 理的组中在一定程度上促进了生长因子的增殖。 尤其是, 已经确认在对以不同比例混合的 Syn1、 Syn2、 Syn3、。

41、 Syn4以及Syn5进行处理的组中出现了比在阳性对照组中更加显著的VEGF 和FGF7基因表达促进效果。 尤其, 如图3所示, 可以确认对Syn1、 Syn2、 Syn3、 Syn4和Syn5进行 处理的组中的VEGF表达量增加到阴性对照组的VEGF表达量的约2.5倍, 如图4所示, 可以确 认对Syn1、 Syn2、 Syn3、 Syn4和Syn5进行处理的组中的FGF7表达量增加到在阴性对照组的 FGF-7表达量的平均4倍以上。 0069 综上, 在对所述18 -甘草次酸、 D-泛醇和薄荷醇的混合溶液进行处理的组中可以 确认作为诱导优异的头发生长的生长因子即VEGF和FGF7的表达诱导功。

42、能, 尤其确认, 所述 混合组(Syn1、 2、 3、 4和5)即使是对少于18 -甘草次酸和D-泛醇的个别处理组的处理容量即 20ppm的溶液含量的示例但其中的头发生长因子增加到平均2倍以上, 从而确认通过18 -甘 草次酸、 D-泛醇和薄荷醇的混合物发生的显著增效作用的出现。 0070 实施例4.进一步添加烟酰胺时混合溶液的HFDPC增殖能力上升效能的评价 0071 进行了实验来确认在进一步附加烟酰胺时是否可以进一步提高毛乳头细胞的增 殖的实验。 在将实施例1的18 -甘草次酸溶液中包括的D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺分别处理 为不同的比例时, 以如下的条件执行MTT分析以评价哪种比例的原料。

43、混合物显著地诱导毛 乳头细胞地增殖。 首先, 将HFDPC以2104个数量分株于96孔板, 并在37、 5二氧化碳条 件的培养箱中培养24小时。 然后, 用分别包括0.5ppm的18 -甘草次酸( -GA)、 20ppm的D-泛 醇、 20ppm的薄荷醇、 20ppm的烟酰胺、 6.7ppm的D-泛醇、 6.7ppm的薄荷醇以及6.7ppm的烟酰 胺(浓度比1:1:1)的混合物、 以及以不同比列混合的18 -甘草次酸、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟 酰胺的混合溶液(Syn6)的培养基替代什么都不包括的培养基后进一步培养24小时。 经过24 小时后, 除去每孔中的培养基并经过使用杜氏磷酸盐缓冲食盐水。

44、(Dulbeccos phosphate buffered saline:DPBS)的一次洗涤过程, 并用每孔500 l的0.5mg/mL的包括MTT四唑氮盐 (Sigma-aldrich,St.Louis,USA)的培养基来替代, 在37度下反应4个小时。 然后, 使用 Victor3在570nm测量吸光度。 将所使用地混合溶液的组成表示在表3中, 知名为头发发育促 进剂的米诺地尔(Minoxidil:MXD)10ppm设置为阳性对照组, 对于细胞的存活率, 将处理什 么都不包括的培养基的示例设置为阴性对照组, 将用相对于其平均吸光度值的百分率表示 的HFDPC的增殖功能的测量结果表示在图5。

45、中。 0072 表3 0073 说明书 8/10 页 10 CN 112137910 A 10 0074 0075 如由图5可以确认, 与未进行溶液处理的阴性对照组相比, 在对18 -甘草次酸和D- 泛醇的单一成分进行粗粒的组和对D-泛醇、 薄荷醇和烟酰胺混合物(原始原料混合物)进行 处理的组中在一定程度上促进了细胞增殖。 尤其, 已确认在对以特定比例混合的Syn6进行 处理的组中出现其程度类似于阳性对照组的HFDPC细胞增殖功能促进效果。 综上, 在对所述 18 -甘草次酸、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺的混合溶液进行处理的组中可以确认优异的细 胞增殖效果,特别时考虑到混合组(Syn6)是对。

46、少于18 -甘草次酸及D-泛醇的个别处理组的 处理容量即200ppm的溶液含量进行处理的情况, 可以确认在最佳浓度比的混合溶液中出现 的优异的上升效果。 0076 实施例5.对进一步添加烟酰胺时混合溶液的HFDPC生长因子(VEGF和FGF7)表达增 加功能的评价 0077 进行了实验来确认在进医院不附加烟酰胺时是否可以进一步提高毛乳头细胞的 增殖。 进行了定量实时聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction:qRT-PCR)来评价在对实施例1中制造的18 -甘草次酸溶液、 D-泛醇以及薄荷醇和 其混合物进行处理时是否能够诱导作。

47、为诱导头发生长的生长因子的VEGF和FGF7的表达。 将 HFDPC以3105个细胞/孔分株于6孔板, 并在细胞培养条件下培养24小时。 经过24小时后, 废弃培养基并用PBS洗涤后, 使用未包括培养基补充物的培养基使细胞变成饥饿状态, 在第 二天, 将什么都不包括的培养基和0.5ppm的18 -甘草次酸( -GA)、 20ppm的D-泛醇、 20ppm的 薄荷醇、 20ppm的烟酰胺、 6.7ppm的D-泛醇、 6.7ppm的薄荷醇和6.7ppm的烟酰胺(浓度比1:1: 1)的混合物, 以及以特定比例混合的18 -甘草次酸、 D-泛醇、 薄荷醇以及烟酰胺的混合溶液 (syn6)的培养基替代,。

48、 进一步培养24小时。 然后, 使用RNeasy小型试剂盒(凯杰)来从细胞分 离出RNA, 并使用纳米微滴(nanodrop)在260nm定量RNA, 且分别使用2 g的RNA在增幅器 (C1000Thermal Cycler,Bio-Rad,美国)中合成cDNA。 使用在经合成的cDNA中添加作为靶蛋 白的VEGF、 FGF7引物作为和氰蓝燃料的核苷酸胶体燃料(SYBR Green supermix,Applied Biosystems,美国)的混合物来在实时荧光定量(real-time PCR)仪实施定量实时聚合酶链 反应来最终评价VEGF、 FGF7基因的表达程度。 引物的序列和反应条件。

49、如所述表3所示, 通过 对 -actin基因的补正来最终分析基因表达量。 将VEGF基因表达程度显示在图6中, 并将 FGF7基因的表达程度显示在图7中。 将所使用的混合溶液的组成显示在2中, 将被视为头发 发育促进剂的米诺地尔(Minoxidil:MXD)10ppm设置成阳性对照组, 并将处理什么都不包括 的培养基的示例设置为阴性对照组。 0078 如由图6和7可以确认, 与未进行溶液处理的阴性对照组相比, 在对18 -甘草次酸、 D-泛醇和薄荷醇的单一成分进行处理的组和对原始原料混合物进行处理的组中在一定程 度上促进了生长因子的增殖。 尤其, 已确认, 对以特定浓度比例混合的Syn6进行处。

50、理的组 中, 与阳性对照组相比, 出现了显著优异的VEGF和FGF7基因表达促进效果。 0079 综上, 在对所述18 -甘草次酸、 D-泛醇和薄荷醇的混合溶液进行处理的组中可以 说明书 9/10 页 11 CN 112137910 A 11 确认作为诱导优异的头发生长的生长因子即VEGF和FGF7的表达诱导功能, 尤其确认, 所述 混合组(Syn6)即使是对少于18 -甘草次酸和D-泛醇的个别处理组的处理容量即20ppm的溶 液含量进行处理的示例但其中的头发生长因子增加到平均5倍以上, 还可以确认所述混合 组(Syn6)即使是对少于18 -甘草次酸和薄荷醇的个别处理组的处理容量集20ppm的。

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