丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011101492.5 (22)申请日 2020.10.15 (71)申请人 中国中医科学院望京医院 （中国中 医科学院骨伤科研究所） 地址 100102 北京市朝阳区望京中环南路6 号 (72)发明人 展嘉文朱立国王尚全魏戌 冯敏山于杰银河尹逊路 陈明高春雨李玲慧刘广伟 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 苏士莹 (51)Int.Cl. A61K 31/192(2006.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 29/00(200。

2、6.01) A61P 19/04(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发 生和发展的药物中的应用 (57)摘要 本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关 节骨关节炎发生和发展的药物中的应用， 涉及生 物医药技术领域。 本发明所述丹参素可显著提高 软骨细胞数量， 软骨表面相对光滑， 并且降低腰 椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子 的表达； 抑制TNF诱导的软骨肉瘤细胞SW1353 凋亡， 并且缓解TNF刺激的原代成纤维样滑膜 细胞的炎症反应； 另外， 丹参素可通过上调腰椎 小关节内TRIP的表达， 促进RIP1蛋白的降解。

3、， 进 而抑制软骨细胞中TNFR1通路介导的软骨细胞凋 亡， 以及成纤维样滑膜细胞中NFB通路介导的 炎症反应， 从而发挥协同干预作用缓解腰椎小关 节骨关节炎(LFJOA)。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 112107569 A 2020.12.22 CN 112107569 A 1.丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应用。 2.根据权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述丹参素能够提高软骨细胞数量， 保持软 骨表面光滑， 降低腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子的表达量。 3.根据权利要求2所述应用， 其特征在于， 所述炎症因子包括IL-1 、 TNF。

4、- 和IL-6。 4.根据权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述丹参素能够抑制软骨细胞凋亡以及成纤 维样滑膜细胞炎症反应。 5.一种缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物， 其特征在于， 所述药物的有效成 分包括丹参素。 6.根据权利要求5所述药物， 其特征在于， 所述丹参素包括丹参素盐。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112107569 A 2 丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中 的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎 发生和发展的药物中的应用。 背景技术 0002 丹参(saliva miltiorrhi。

5、za)为唇形科鼠尾属植物丹参的干燥根茎。明理论载 言：“一味丹参， 功兼四物” ，本草纲目 云：“活血， 通心包络。 治通” ， 具有祛瘀止痛、 活血通 经等功效， 是中药学中应用较广、 价值较高的药物之一。 近年来， 随着对丹参化学成分及药 理作用与临床研究的广泛深入， 鉴定出丹参中包括脂溶性以及水溶性成分共约30余种， 其 中的脂溶性成分主要为丹参酮类， 水溶性成分为丹参酸类， 主要包括丹参素、 原儿茶醛和丹 参酸甲、 乙、 丙等。 丹参的脂溶性成分一直是研究热点， 被报道具有抗氧化、 抗菌、 抗肿瘤以 及类雌激素样作用等， 近年来发现丹参水溶性成分具有抗凝血、 抗缺血、 抗炎症、 抗菌以。

6、及 增强免疫力等作用， 尤其是水溶性含量最高的药效成分丹参素在多种生理过程中皆具有杰 出功效， 受到越来越多的重视。 0003 丹参素(Salvianic acidA， SAA)化学名称为D-(+)- -(3,4-二羟基苯基)乳酸即 D-(+)- -(3,4-Dihydroxyphenyl)lactic acid， 分子量及分子式分别为198.17和 C9H10O5， 是一种游离酸， 性质容易不稳定， 故研究中常将其制成钠盐即丹参素钠(Salvianic acidA sodium， SAAS)以提高其稳定性和纯度。 研究表明丹参素可通过TGF- -smad3通路抑 制肺动脉平滑肌细胞增殖进而预。

7、防大鼠缺氧性肺动脉高血压； 也有报道丹参素通过抑制 JAK2/STAT3通路而抑制肝纤维化， 以及通过激活Sirt1/FoxO1/Rab7信号通路改善心肌缺血 再灌注损伤。 这些研究说明丹参素可通过调节机体内不同的信号通路而影响众多生理进 程， 但是目前关于丹参素对于腰椎小关节骨关节炎(LFJOA)的作用以及机制并不清楚。 发明内容 0004 有鉴于此， 本发明的目的在于提供丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和 发展的药物中的应用， 腰椎小关节骨性关节炎及下腰痛患者提供安全且效果显著的治疗手 段 0005 为了实现上述发明目的， 本发明提供以下技术方案： 0006 本发明提供了丹参素在制备。

8、缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应 用。 0007 优选的， 所述丹参素能够提高软骨细胞数量， 保持软骨表面光滑， 降低腰椎小关节 内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子的表达量。 0008 优选的， 所述炎症因子包括IL-1 、 TNF- 和IL-6。 0009 优选的， 所述丹参素能够抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应。 0010 本发明还提供了一种缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物， 所述药物的有 说明书 1/6 页 3 CN 112107569 A 3 效成分包括丹参素。 0011 优选的， 所述丹参素包括丹参素盐。 0012 本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关节骨。

9、关节炎发生和发展的药物中的应 用。 本发明实施例通过在体实验观察到丹参素钠处理后可显著提高软骨细胞数量， 软骨表 面相对光滑， 并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子如IL-1 、 TNF- 、 IL-6等 表达显著降低； 离体细胞实验进一步证实丹参素钠能够抑制TNF- 诱导的软骨肉瘤细胞 SW1353凋亡， 并且能够缓解TNF- 刺激的原代成纤维样滑膜细胞的炎症反应。 因此丹参素能 够起到抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应的协同干预作用， 从而缓解 LFJOA的发生发展。 另外， 丹参素可通过上调腰椎小关节内TRIP的表达， 促进RIP1蛋白的降 解， 进而抑制软骨细胞中T。

10、NFR1通路介导的软骨细胞凋亡， 以及成纤维样滑膜细胞中NF- B 通路介导的炎症反应， 从而发挥协同干预作用缓解腰椎小关节骨关节炎(LFJOA)。 附图说明 0013 图1为番红固绿染色检测丹参素钠对在体LFJOA模型关节软骨的影响， 其中左侧图 为对照组， 中间图为退变组， 右侧图为丹参素钠干预组； 0014 图2为qPCR与ELISA法检测丹参素钠对在体LFJOA模型成纤维样滑膜细胞中炎症因 子的影响； 0015 图3为流式细胞检测丹参素钠抑制TNF- 诱导的软骨肉瘤细胞SW1353的凋亡； 0016 图4为qPCR与ELISA法检测丹参素钠对TNF- 诱导的原代成纤维样滑膜细胞中炎症 。

11、因子的影响； 0017 图5为丹参素钠对调控炎症反应关键性E3连接酶的表达影响。 具体实施方式 0018 本发明提供了丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物中的应 用。 0019 本发明所述丹参素能够提高软骨细胞数量， 保持软骨表面光滑， 降低腰椎小关节 内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子的表达量； 所述炎症因子优选包括IL-1 、 TNF- 和IL- 6。 0020 本发明所述丹参素能够抑制软骨细胞凋亡以及成纤维样滑膜细胞炎症反应， 更具 体的， 所述丹参素能够抑制TNF- 诱导的软骨肉瘤细胞SW1353凋亡， 并且能够缓解TNF- 刺 激的原代成纤维样滑膜细胞的炎症反应。 002。

12、1 在本发明中， 所述丹参素优选包括丹参素盐， 更优选包括丹参素钠。 0022 本发明还提供了一种缓解腰椎小关节骨关节炎发生和发展的药物， 所述药物的有 效成分包括丹参素。 本发明所述丹参素优选包括丹参素盐， 更优选包括丹参素钠。 本发明对 所述药物的剂型并没有特殊限定， 利用本领域的常规药物剂型即可。 本发明所述药物中优 选还包括药学上可接受的辅料。 0023 下面结合实施例对本发明提供的丹参素在制备缓解腰椎小关节骨关节炎发生和 发展的药物中的应用进行详细的说明， 但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 0024 实施例1 说明书 2/6 页 4 CN 112107569 A 4 00。

13、25 丹参素钠(SAAS)对在体腰椎小关节骨关节炎(LFJOA)模型软骨与滑膜组织的影响 0026 (1)在体LFJOA模型分组与造模 0027 分组： 30只标记好的SD大鼠随机分3组， 每组10只， 分别为： 对照组(Sham组)、 处理 组(CLG组)、 实验组(CLG+SAAS组) 0028 造模： 通过II型胶原酶诱导建立LFJOA大鼠模型。 将腹腔注射水合氯醛麻醉后的大 鼠固定于手术台上， 碘伏常规消毒。 手术时在背部正中切开3cm左右切口， 剥离右侧椎旁肌 肉， 显露右侧L3-L4,L4-L5,L5-L6三个小关节。 用带有33号针头容量为10 l的微量注射器分 别向处理组以及实。

14、验组的上述三个关节腔内注射6U的II型胶原酶。 逐层缝合肌肉和皮肤。 0029 其中对照组仅暴露三个小关节然后缝合， 术后大鼠返回饲养间并恢复自由饮食， 6 小时后处理组腹腔注射生理盐水； 实验组腹腔注射SAAS 60mg/kg， 每两天注射一次， SAAS腹 腔注射剂量为60mg/kg/2天； 处理组注射等剂量生理盐水。 0030 取材： 8周后， 使用小动物麻醉机(2异氟烷)进行麻醉， 直到身体全身变软， 用注 射器针头刺入从枕骨大孔刺入大鼠大脑将其处死。 处死后， 在无菌条件下取完整腰椎小关 节， 分离出软骨组织以及滑膜组织。 0031 (2)检测指标： 0032 软骨组织： 常规包埋切。

15、片后， 采用番红固绿、 甲苯胺蓝、 HE染色和免疫组化方法， 观察腰椎小关节内软骨组织变化。 采用经典的Mankin评分系统(表1)， 小关节软骨染色后切 片进行组织学评分。 0033 表1 Mankin评分标准 0034 0035 0036 滑膜组织： 说明书 3/6 页 5 CN 112107569 A 5 0037 炎症因子表达情况： qPCR法检测TNF- 、 IL-1 、 IL-6的mRNA表达： 收集各组滑膜组 织， 加入适量Trizol裂解液， 将样品置于冰上以30振幅超声， 工作3s后间歇暂停2s， 每个 样品累积超声约30s左右。 随后陆续以氯仿、 异丙醇、 酒精等试剂对总R。

16、NA进行提取， 并测定 RNA的浓度； 用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA， 然后以cDNA第1链作为模板行PCR扩增。 以 QuantiTeckTM SYBR GreenPCR试剂盒进行qPCR反应， qPCR反应条件： 94预变性5min， 94 变性20s， 58退火20s， 72延伸20s， 40个循环； 72延伸10min。 经2- CT法进行数据分析。 0038 Westernblot法检测滑膜组织内NF- B通路中的接头分子IKK 、 I B 、 p65等的蛋白 磷酸化变化情况。 0039 结果如图1和图2所示， 在体实验番红固绿染色观察到丹参素钠处理后可显著提高 软骨细胞数量。

17、， 软骨表面相对光滑(图1)， 并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症 因子如IL-1 、 TNF- 、 IL-6等表达显著降低(图2)。 0040 实施例2 0041 丹参素钠(SAAS)对软骨细胞凋亡TNFR1通路及成纤维样滑膜细胞炎症NF- B通路 的调控作用 0042 (1)体外细胞模型建立 0043 软骨瘤细胞SW1353凋亡模型 0044 人软骨肉瘤细胞SW1353细胞以10FBS血清+DMEM培养基于37、 5CO2培养箱中 培养， 50ng/ml TNF- 刺激12小时后经流式细胞术、 TUNEL染色术、 Caspase3/8激酶活性实验 以及WB检测凋亡相关关键蛋白的表达。

18、， 从而观察SW1353细胞凋亡情况。 0045 成纤维样滑膜细胞(FLSs)炎症模型 0046 1)成纤维样滑膜细胞的分离及培养： 0047 大鼠经麻醉处死后于超净台中暴露腰椎小关节处滑膜组织， 提出多余脂肪与结缔 组织后置于离心管中并用眼科剪将滑膜组织剪碎成糊状， Hanks液冲洗后加入2ml 0.25 胰蛋白酶并充分混匀后置于37、 5CO2培养箱中消化20分钟。 以含血清DMEM培养基终止 消化后， 1000转/分钟离心5分钟并弃掉上清。 再在离心管中加入1mg/ml胶原酶并充分混匀 后置于培养箱中消化1.5小时。 吹打混匀后过200目细胞筛网过滤， 1000转/分钟离心5分钟 后离心。

19、管底部可见白色细胞沉淀， 于其中加入10FBS+DMEM培养基础重悬并置于培养瓶中 培养。 4小时后细胞完全贴壁即可换液， 贴壁细胞即为成纤维样滑膜细胞。 0048 2)通过TNF- 诱导成纤维样滑膜细胞(FLSs)炎症模型： 0049 从正常未处理的大鼠腰椎小关节分离出滑膜组织并体外培养成纤维细胞， 培养条 件同上。 50ng/ml TNF- 刺激8小时后利用qPCR、 ELISA以及WB等检测FLS细胞炎症情况。 0050 分组 0051 1)软骨瘤细胞SW1353凋亡模型： 对照组(SW1353细胞)， TNF-刺激组(TNF- + SW1353细胞)， SAAS处理组(2.5、 5、 。

20、10 M SAAS+TNF- +SW1353细胞) 0052 2)成纤维样滑膜细胞(FLSs)炎症模型： 对照组(FLSs)， TNF-刺激组(TNF- + FLSs)， SAAS处理组(2.5、 5、 10 M SAAS+TNF- +FLSs) 0053 (2)检测指标： 0054 软骨细胞凋亡检测 0055 流式细胞术、 TUNEL试剂盒测定软骨细胞凋亡情况如图3所示。 说明书 4/6 页 6 CN 112107569 A 6 0056 成纤维样滑膜细胞炎症及NF- B信号通路检测 0057 qPCR与ELISA法检测FLSs细胞模型中， 各处理FLSs内炎症相关蛋白IL-1 、 IL-6。

21、、 MMP1表达情况如图4所示。 0058 综上可知， 在体实验番红固绿染色观察到丹参素钠处理后可显著提高软骨细胞数 量， 软骨表面相对光滑， 并且腰椎小关节内的成纤维样滑膜细胞中的炎症因子如IL-1 、 TNF- 、 IL-6等表达显著降低。 0059 实施例3 0060 体外细胞实验进行E3连接酶及靶点筛选， 明确丹参素钠(SAAS)对TRIP的调控作 用， 以及SAAS发挥协同作用的分子机制 0061 (1)E3连接酶及靶点筛选 0062 在SW1353细胞及原代FLS细胞培养基中， 加入10 M SAAS后， 经qPCR检测骨关节炎 及凋亡相关的E3连接酶如Cbl-b， TRIM22，。

22、 TRIM25， TRIM38， TRIM41， TRIM56以及TRIP的mRNA 表达变化情况。 同时在SW1353细胞以及FLS细胞培养基中， 加入SAAS梯度剂量(2.5， 5， 10 M) 后利用WB检测E3连接酶的蛋白表达变化情况。 筛选出特异性受SAAS调控表达的E3连接酶， 即TRIP。 0063 免疫共沉淀(co-IP) 0064 在SW1353细胞凋亡模型与FLSs细胞炎症模型中分别检测TRIP与目的靶点分子(如 RIP1)的结合情况。 将构建好的带有FLAG标签的TRIP分子与MYC标签的靶点分子， 经脂质体 转染入两种细胞。 24小时后收集细胞并经co-IP细胞裂解液裂。

23、解， 提取总蛋白后经BCA蛋白 测定试剂盒确定蛋白浓度并调齐， 之后每个样品预留50 l作为input以确定蛋白总量一致， 向剩余管体中加入FLAG抗体1l后于4冷柜中混匀1h,再向每管中加入Protein A/ GAgrouse珠子40 l， 继续于冷柜中混匀12小时。 再经离心后弃掉上清， TRIP-FLAG蛋白与目 的靶点蛋白此刻应结合于珠子表面， 经洗涤及重悬后， 再经离心得到珠子， 加入SDS上样缓 冲液煮沸后可进行WB检测以确定二者是否结合。 0065 泛素化实验 0066 转染时同时转染泛素质粒(HA标签)， 由于目的靶点分子带有MYC标签， 则可以通过 裂解细胞后加入MYC抗体。

24、， 再经免疫共沉淀， 待WB检测时以HA抗体或泛素抗体进行孵化并显 色， 得到泛素化结果。 0067 (2)SAAS对TRIP的调控作用 0068 在TNF-诱导的SW1353细胞凋亡模型与FLSs细胞炎症模型中， 通过qPCR和 Westernblot检测SAAS对于TRIP蛋白表达升高的调控， 明确调控发生在转录水平还是蛋白 修饰水平。 0069 结果如图5所示， 在SW1353细胞及原代成纤维样滑膜细胞中加入SAAS， SAAS可以特 异性显著提高TRIP蛋白表达， 且成剂量依赖趋势， 而对其余几种E3连接酶表达水平无明显 影响。 0070 综上可知， 丹参素通过上调腰椎小关节内TRIP。

25、的表达， 促进RIP1蛋白的降解， 进而 抑制软骨细胞中TNFR1通路介导的软骨细胞凋亡， 以及成纤维样滑膜细胞中NF- B通路介导 的炎症反应， 从而发挥协同干预作用缓解腰椎小关节骨关节炎(LFJOA)。 0071 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 说明书 5/6 页 7 CN 112107569 A 7 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 112107569 A 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 9 CN 112107569 A 9 图4 图5 说明书附图 2/2 页 10 CN 112107569 A 10 。