检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010845192.1 (22)申请日 2020.08.20 (71)申请人 新兴县国研科技有限公司 地址 527400 广东省云浮市新兴县新城镇 东堤北路5号温氏集团研究院 申请人 温氏食品集团股份有限公司 (72)发明人 刘伟余国莲曾道平杜云平 杨金易周庆丰陈丽 (74)专利代理机构 广州容大知识产权代理事务 所(普通合伙) 44326 代理人 刘新年 (51)Int.Cl. C12Q 1/18(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04。

2、(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其 检测方法 (57)摘要 本发明涉及食品安全检测技术领域， 具体涉 及一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检 测方法。 所述试剂盒包括检测培养基、 大肠杆菌 冻干菌粉、 96微孔板、 薄膜贴和对照液。 所述试剂 盒用于畜禽生肉的喹诺酮类药物残留的检测。 本 发明提供的检测试剂盒样品的前处理方法简单， 大大减少了检测人员的工作量， 节省人力物力； 检测试剂盒可以检测多种喹诺酮类药物， 并显著 的提高了检测灵敏度。 权利要求书2页 说明书6页 CN 112111549 A 2020.12。

3、.22 CN 112111549 A 1.一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括检测培养基、 大 肠杆菌冻干菌粉、 96微孔板、 薄膜贴和对照液。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述检测培养基组成成分为： 葡萄糖4 8g， 蛋白胨610g， 牛肉浸粉36g， 磷酸氢二钾1015g， 氯化钠38g， 亮黑100200mg， 甲 苯胺蓝1020mg， 氨苄西林0.51mg， 溴莫普林50200ug， 蒸馏水1000mL； 所述培养基的pH 为7.47.8。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 检测培养基的制备方法为将检测培养基 组成成分完全溶。

4、解后， 用0.22 m的滤膜过滤， 分装到灭菌过的塑料瓶中， 4保存。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述大肠杆菌冻干菌粉的制备方法为： 步骤1： 菌株复苏： 在无菌环境下用接种环从甘油管中挑取大肠杆菌种子液划线至营养 琼脂平板上， 在3037培养1424h； 步骤2： 菌株繁殖： 在无菌环境下用接种环从平板上挑取单菌落接种至装有50mL营养肉 汤液体培养基的三角瓶中， 在3037、 150200rpm/min条件下培养1220h； 步骤3： 活菌计数： 采用梯度稀释法用无菌生理盐水逐渐将菌液稀释并取100uL涂布于 营养琼脂平板上， 在3037培养1424h， 计算活菌数，。

5、 活菌数为1095109cfu/mL； 将菌 液放于4保存； 步骤4： 菌株冻干： 吸取菌液与10脱脂乳载体充分混匀， 分装到灭菌过的西林瓶中， 每 瓶2mL， 放于-80冰箱中冷冻， 待菌液完全结冰后放入冷冻干燥机中， 低温冷冻干燥。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 步骤4中菌液与10脱脂乳载体混合具 体方式为先使用无菌生理盐水将菌液稀释100倍， 再取稀释后的菌液1mL与100mL 10脱脂 乳载体混合。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述对照液包括阴性对照液和阳性对照 液； 所述阴性对照液是pH为5.0的无菌柠檬酸缓冲液； 所述阳性对照液为环丙沙星标准液。

6、； 阳性对照液制备方法为称取10mg环丙沙星， 用甲醇溶解并定容至1mg/mL， 装于无菌棕色瓶 中， 负20保存。 7.权利要求16任意一项所述的试剂盒的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤S1： 样品制备： 取非冷冻的瘦肉510g， 切成小块， 把碎块放入离心管中； 将离心管 放入水浴锅中， 保持瘦肉样品在水位线以下， 水浴510min， 水浴温度为95； 然后将离心 管以20004000rpm/min离心36min， 收集上清液备用。 步骤S2： 检测方法： 将检测培养基加入到大肠杆菌冻干菌粉中充分混匀， 得到混合液； 吸取200uL混合液于96微孔板不同的微孔中， 吸取步骤S。

7、1中上清液50uL加入到装有混合液 的微孔中， 作为样品检测组； 取50uL的阴性对照液加入装有混合液的微孔中， 作为阴性对照 组； 将阳性对照液用阴性对照液稀释浓度至50ppb， 取50uL稀释后的阳性对照液， 加入装有 混合液的微孔中， 作为阳性对照组； 用薄膜贴密封后在37培养箱中培养至阴性样品变色， 培养时间为1418h。 步骤S3： 结果判定： 当阴性对照组中的颜色为黄色且阳性对照微孔中颜色为黑色时， 表 明样品培养结束； 当阴性对照微孔中的颜色为黑色， 应继续培养； 培养结束后， 样品检测组 微孔中的颜色为黄色时， 表明该检测样品为阴性， 样品微孔中的颜色为黑色时， 表明该检测 样。

8、品为阳性。 权利要求书 1/2 页 2 CN 112111549 A 2 8.根据权利要求7所述的试剂盒的检测方法， 其特征在于， 所述样品为畜禽生肉。 9.权利要求16任意一项所述的试剂盒在检测畜禽生肉的喹诺酮类药物残留上的应 用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112111549 A 3 一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及其检测方法 技术领域 0001 本发明涉及食品安全检测技术领域， 具体涉及一种检测喹诺酮类药物残留的试剂 盒及其检测方法。 背景技术 0002 喹诺酮类药物是一种合成抗菌药物， 因其抗菌活性强、 抗菌谱广、 药物动力学特征 好， 广泛应用于动物疾病防治。 但由于对该类。

9、药物的滥用， 导致其在动物性食品中的残留超 标， 人们长期食用喹诺酮类药物残留超标的食品， 会引起如过敏反应、 人体肠道菌群受干扰 以及对该类药物产生耐药性等问题， 影响人类的健康。 喹诺酮类药物残留问题已引起了广 泛关注。 目前， 畜禽肉中检测抗生素残留方法主要有色谱法、 免疫分析法、 ELISA检测法和微 生物检测法等。 其中色谱法较为常用， 可以进行定性定量检测， 检测结果灵敏准确， 但设备 投入大， 人员技能要求高， 适合大型综合性实验室进行仲裁判定和确证； 免疫分析法虽灵敏 度高， 但是检测成本昂贵， 只能检测单一抗生素， 不易于推广； ELISA检测法灵敏度高， 只能 检测单一抗生。

10、素， 且操作繁琐， 亦不易于推广。 0003 微生物检测法是一种传统经典的测定方法， 其利用抗生素对微生物的生理机能、 代谢的抑制作用， 与阴性对照进行对比， 可以反应出待测样本中是否存在抗生素残留。 微生 物检测法敏感性强、 成本低廉、 操作简单， 可作为一种抗生素初筛方法应用在农产品安全监 管环节。 因此， 提供一种灵敏度高、 快速检测畜禽产品中喹诺酮类药物残留的试剂盒具有重 要意义。 发明内容 0004 有鉴于此， 有必要针对上述的问题， 提供一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒及 其检测方法。 0005 为实现上述目的， 本发明采取以下的技术方案： 0006 一种检测喹诺酮类药物残留的试剂。

11、盒， 所述试剂盒包括检测培养基、 大肠杆菌冻 干菌粉、 96微孔板、 薄膜贴和对照液。 0007 进一步地， 在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中， 所述检测培养基组成成分 为： 葡萄糖48g， 蛋白胨610g， 牛肉浸粉36g， 磷酸氢二钾1015g， 氯化钠38g， 亮黑 100200mg， 甲苯胺蓝1020mg， 氨苄西林0.51mg， 溴莫普林50200ug， 蒸馏水1000mL； 所述培养基的pH为7.47.8。 0008 进一步地， 在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中， 检测培养基的制备方法为 将检测培养基组成成分完全溶解后， 用0.22 m的滤膜过滤， 分装到灭菌过的塑料瓶中，。

12、 4 保存。 0009 进一步地， 在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中， 所述大肠杆菌冻干菌粉的 制备方法为： 0010 步骤1： 菌株复苏： 在无菌环境下用接种环从甘油管中挑取大肠杆菌种子液划线至 说明书 1/6 页 4 CN 112111549 A 4 营养琼脂平板上， 在3037培养1424h； 0011 步骤2： 菌株繁殖： 在无菌环境下用接种环从平板上挑取单菌落接种至装有50mL营 养肉汤液体培养基的三角瓶中， 在3037、 150200rpm/min条件下培养1220h； 0012 步骤3： 活菌计数： 采用梯度稀释法用无菌生理盐水逐渐将菌液稀释并取100uL涂 布于营养琼脂平板。

13、上， 在3037培养1424h， 计算活菌数， 活菌数为1095109cfu/mL； 将菌液放于4保存； 0013 步骤4： 菌株冻干： 吸取菌液与10脱脂乳载体充分混匀， 分装到灭菌过的西林瓶 中， 每瓶2mL， 放于-80冰箱中冷冻， 待菌液完全结冰后放入冷冻干燥机中， 低温冷冻干燥。 0014 进一步地， 在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中， 步骤4中菌液与10脱脂乳 载体混合具体方式为先使用无菌生理盐水将菌液稀释100倍， 再取稀释后的菌液1mL与 100mL 10脱脂乳载体混合。 0015 进一步地， 在上述检测喹诺酮类药物残留的试剂盒中， 所述对照液包括阴性对照 液和阳性对照液；。

14、 所述阴性对照液是pH为5.0的无菌柠檬酸缓冲液； 所述阳性对照液为环丙 沙星标准液； 阳性对照液制备方法为称取10mg环丙沙星， 用甲醇溶解并定容至1mg/mL， 装于 无菌棕色瓶中， 负20保存。 0016 一种喹诺酮类药物残留的检测方法， 采用上述试剂盒， 包括以下步骤： 0017 步骤S1： 样品制备： 取非冷冻的瘦肉510g， 切成小块， 把碎块放入离心管中； 将离 心管放入水浴锅中， 保持瘦肉样品在水位线以下， 水浴510min， 水浴温度为95； 然后将 离心管以20004000rpm/min离心36min， 收集上清液备用。 0018 步骤S2： 检测方法： 将检测培养基加入到。

15、大肠杆菌冻干菌粉中充分混匀， 得到混合 液； 吸取200uL混合液于96微孔板不同的微孔中， 吸取步骤S1中上清液50uL加入到装有混合 液的微孔中， 作为样品检测组； 取50uL的阴性对照液加入装有混合液的微孔中， 作为阴性对 照组； 将阳性对照液用阴性对照液稀释浓度至50ppb， 取50uL稀释后的阳性对照液， 加入装 有混合液的微孔中， 作为阳性对照组； 用薄膜贴密封后在37培养箱中培养至阴性样品变 色， 培养时间为1418h。 0019 步骤S3： 结果判定： 当阴性对照组中的颜色为黄色且阳性对照微孔中颜色为黑色 时， 表明样品培养结束； 当阴性对照微孔中的颜色为黑色， 应继续培养； 。

16、培养结束后， 样品检 测组微孔中的颜色为黄色时， 表明该检测样品为阴性， 样品微孔中的颜色为黑色时， 表明该 检测样品为阳性。 0020 在上述喹诺酮类药物残留的检测方法中， 所述样品为畜禽生肉。 0021 检测喹诺酮类药物残留的试剂盒在检测畜禽生肉的喹诺酮类药物残留上的应用。 0022 本发明的有益效果为： 0023 本发明提供的检测喹诺酮类药物残留的试剂盒， 样品的处理方法简单， 大大减少 了检测人员的工作量， 节省人力物力。 本发明提供的检测试剂盒可以检测多种喹诺酮类药 物。 本发明提供的检测喹诺酮类药物残留的试剂盒的检测培养基中包含氨苄西林和溴莫普 林， 可以显著提高试剂盒的灵敏度， 。

17、检测环丙沙星、 恩诺沙星、 达氟沙星标准样品的灵敏度 均可达到25ppb， 在检测鸡肉中喹诺酮类药物残留也具有较高的灵敏度， 其中检测环丙沙 星、 恩诺沙星、 达氟沙星、 培氟沙星均的灵敏度可达到50ppb。 说明书 2/6 页 5 CN 112111549 A 5 具体实施方式 0024 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合本发明实施例， 对本发 明的技术方案作进一步清楚、 完整地描述。 需要说明的是， 所描述的实施例仅仅是本发明一 部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本。

18、发明保护的范围。 0025 本发明所采用的原料和试剂： 0026 大肠杆菌种子液， 本实验室分离保藏； 0027 10脱脂乳载体， 购自上海生工， 编号A600669-0250； 0028 氨苄西林， 购自阿拉丁， CAS号： 7177-48-2； 0029 溴莫普林， 购自吉至生化， CAS号： 56518-41-3； 0030 薄膜贴， 购自上海生工， 编号F600418-0001； 0031 微孔板， 购自美国康宁公司。 0032 在本发明的描述中， 需要说明的是， 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或 制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买。

19、获得 的常规产品。 0033 实施例1、 检测喹诺酮类药物残留的试剂盒 0034 一种检测喹诺酮类药物残留的试剂盒， 所述试剂盒包括检测培养基、 大肠杆菌冻 干菌粉、 96微孔板、 薄膜贴和对照液。 0035 所述检测培养基组成成分为： 葡萄糖5g， 蛋白胨10g， 牛肉浸粉4g， 磷酸氢二钾10g， 氯化钠5g， 亮黑200mg， 甲苯胺蓝10mg， 氨苄西林0.5mg， 溴莫普林100ug， 蒸馏水1000mL； 所述 培养基的pH为7.6； 所述检测培养基的制备方法为将检测培养基组成成分完全溶解后， 用 0.22 m的滤膜过滤， 分装到灭菌过的塑料瓶中， 每瓶6mL， 4保存。 0036。

20、 所述大肠杆菌冻干菌粉的制备方法为： 0037 步骤1： 菌株复苏： 在无菌环境下用接种环从甘油管中挑取大肠杆菌种子液划线至 营养琼脂平板上， 在37培养16h； 0038 步骤2： 菌株繁殖： 在无菌环境下用接种环从平板上挑取单菌落接种至装有50mL营 养肉汤液体培养基的三角瓶中， 在37、 200rpm/min条件下培养12h； 0039 步骤3： 活菌计数： 采用梯度稀释法用无菌生理盐水逐渐将菌液稀释并取100uL涂 布于营养琼脂平板上， 在37培养16h， 计算活菌数， 活菌数为1095109cfu/mL； 将菌液放 于4保存； 0040 步骤4： 菌株冻干： 先将菌液稀释100倍后，。

21、 吸取1mL稀释后的菌液与100mL10脱脂 乳载体充分混匀； 分装到灭菌过的西林瓶中， 每瓶2mL， 放于-80冰箱中冷冻6h， 待菌液完 全结冰后放入冷冻干燥机中， 低温冷冻干燥； 冷冻干燥机的主干燥隔板参数为-204 5h、 -1545h、 -1034h、 -534h、 034h、 523h、 1023h； 待干燥程序结束 后将西林瓶压盖和封口， 并放于4保存。 0041 所述对照液包括阴性对照液和阳性对照液； 所述阴性对照液是pH为5.0的无菌柠 檬酸缓冲液； 阴性对照液配制方法为称取一水柠檬酸和二水柠檬酸钠各8.6g和17.35g， 用 纯水溶解并定容至1L； 所述阳性对照液为环丙沙。

22、星标准液； 阳性对照液制备方法为称取 10mg环丙沙星， 用甲醇溶解并定容至1mg/mL， 装于无菌棕色瓶中， 负20保存。 说明书 3/6 页 6 CN 112111549 A 6 0042 所述薄膜贴为上海生工Sealing Film。 0043 所述微孔板为Corning 96微孔板。 0044 实施例2、 喹诺酮类药物残留的检测方法 0045 包括以下步骤： 0046 步骤S1： 样品制备： 取非冷冻的瘦肉10g， 切成小块， 把碎块放入离心管中； 将离心 管放入水浴锅中， 保持瘦肉样品在水位线以下， 水浴10min， 水浴温度为95； 然后将离心管 以3000rpm/min离心5mi。

23、n， 收集上清液备用。 0047 步骤S2： 检测方法： 将检测培养基加入到大肠杆菌冻干菌粉中充分混匀， 得到混合 液； 吸取200uL混合液于96微孔板不同的微孔中， 吸取步骤S1中上清液50uL加入到装有混合 液的微孔中， 作为样品检测组； 取50uL的阴性对照液加入装有混合液的微孔中， 作为阴性对 照组； 将阳性对照液用阴性对照液稀释浓度至50ppb， 取50uL稀释后的阳性对照液， 加入装 有混合液的微孔中， 作为阳性对照组； 用薄膜贴密封后在37培养箱中培养至阴性样品变 色， 培养时间为16h。 0048 步骤S3： 结果判定： 当阴性对照组中的颜色为黄色且阳性对照微孔中颜色为黑色 。

24、时， 表明样品培养结束； 当阴性对照微孔中的颜色为黑色， 应继续培养； 培养结束后， 样品检 测组微孔中的颜色为黄色时， 表明该检测样品为阴性， 样品微孔中的颜色为黑色时， 表明该 检测样品为阳性。 0049 对比例1、 检测喹诺酮类药物残留的试剂盒， 检测培养基中不包括溴莫普林和氨苄 西林， 其余成分与实施例1中的试剂盒相同。 0050 测试数据 0051 一、 测试不同喹诺酮类药物标准品的检测限 0052 采用实施例1制备的试剂盒， 按照实施例2的检测方法， 其中样品的制备即为不同 喹诺酮类药物标准品溶液的制备， 对不同喹诺酮类药物标准品进行检测， 检测结果如表1所 示。 0053 表1.。

25、不同喹诺酮类药物标准品的检测限 说明书 4/6 页 7 CN 112111549 A 7 0054 0055 表中+表示检测阳性， -表示检测阴性 0056 由表1可看出， 实施例1制备的试剂盒可以有效的检测不同的喹诺酮类药物， 检测 环丙沙星、 恩诺沙星、 达氟沙星的灵敏度可达到25ppb。 0057 二、 检测鸡肉中添加不同喹诺酮类药物的检测限 0058 采用实施例1制备的试剂盒， 实施例2的检测方法检测鸡肉中添加不同喹诺酮类药 物的检测限， 检测结果如表2所示。 采用对比例1制备的试剂盒， 实施例2的检测方法检测鸡 肉中添加不同喹诺酮类药物的检测限， 检测结果如表3所示。 0059 对比。

26、表2和表3的数据可知， 检测同一种喹诺酮类药物时， 检测培养基包含组分溴 莫普林和氨苄西林时， 可以与检测培养基的其他成分共同作用， 提高检测喹诺酮类药物的 灵敏度。 0060 表2.实施例1试剂盒检测鸡肉中添加不同喹诺酮类药物的检测限 说明书 5/6 页 8 CN 112111549 A 8 0061 0062 表中+表示检测阳性， -表示检测阴性 0063 表3.对比例1试剂盒检测鸡肉中添加不同喹诺酮类药物的检测限 0064 0065 表中+表示检测阳性， -表示检测阴性 0066 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 6/6 页 9 CN 112111549 A 9 。