一株用于果酒全过程绿色生产的东方伊萨酵母及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010525940.8 (22)申请日 2020.06.10 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 19724 2020.04.24 (71)申请人 南京万拓生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市江北新区长芦 街道宁六路606号D栋1401室 (72)发明人 王友升 (74)专利代理机构 北京易捷胜知识产权代理事 务所(普通合伙) 11613 代理人 齐胜杰岑海梅 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12G 3/024(2019.。

2、01) A23B 7/155(2006.01) C12R 1/645(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一株用于果酒全过程绿色生产的东方伊萨 酵母及其应用 (57)摘要 本 发 明 涉 及 一 株 东 方 伊 萨 酵 母 (Issatchenkiaorientalis)， 其于2020年04月 24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心， 保藏号为CGMCCNo.19724， 命名 为IssatchenkiaorientalisWTB20042304。 该 菌株能有效利用柠檬酸和酒石酸， 对果酒中的柠 檬酸、 乳酸、 甲酸、 和琥珀酸都有。

3、降解能力， 对柠 檬酸的降解能力尤为显著； 能有效提高总酚、 总 黄酮和花青素等活性物含量， 提升果酒抗氧化水 平。 此外， 该菌株对灰葡萄孢菌具有一定的抑制 作用。 因而该菌株可应用于水果采后贮藏保鲜或 果酒降酸发酵， 是一株用于果酒全过程绿色生产 的优选菌株。 权利要求书1页 说明书15页 附图1页 CN 112111416 A 2020.12.22 CN 112111416 A 1.一株东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)， 其于2020年04月24日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No .19724， 命名为 Issa。

4、tchenkia orientalis WTB20042304。 2.根据权利要求1所述的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304在水果采后贮藏保 鲜或果酒降酸中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述水果为蓝莓， 所述果酒为蓝莓果酒。 4.一株鲜果保鲜方法， 其特征在于： 将东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304配成 菌悬液， 利用该菌悬液对鲜果进行喷洒或浸涂。 5.根据权利要求4所述的鲜果保鲜方法， 其特征在于： 将东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304活化， 用YPD液体培养基发酵培养， 离心得到菌体， 。

5、配制成浓度为1106CFU/mL 1108CFU/mL的菌悬液； 将水果放入菌悬液中， 浸泡30秒后取出， 风干； 放入保鲜盒中， 密 封后， 常温贮藏。 6.根据权利要求4或5所述的鲜果保鲜方法， 其特征在于： 所述鲜果为葡萄或蓝莓。 7.一株果酒降酸发酵方法， 是在向果汁中接种酿酒酵母之前， 先接种东方伊萨酵母 I.orientalis WTB20042304， 再进行发酵处理。 8.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法， 其特征在于： 所述果酒为蓝莓果酒， 所述 果汁为蓝莓果汁。 9.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法， 其特征在于： 新鲜蓝莓破碎后， 经成分调 整得到蓝莓果汁， 向所。

6、述蓝莓果汁中加入东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304， 2-4天 后加酿酒酵母， 再进行糖度调节、 初发酵、 过滤和后发酵工艺流程。 10.根据权利要求7所述的果酒降酸发酵方法， 其特征在于： 所述东方伊萨酵母 I.orientalis WTB20042304的加菌量为1106CFU/mL。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112111416 A 2 一株用于果酒全过程绿色生产的东方伊萨酵母及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株功能酵母菌， 尤其涉及一株用于果酒全过程绿色生产的东方伊萨 酵母及其应用。 背景技术 0002 果酒是酵母菌利用水果本身的糖分发酵成为酒。

7、精的酒， 含有水果的特定风味和营 养成分， 是人类最早学会酿造的酒。 可酿造果酒的水果五花八门， 以猕猴桃、 杨梅、 橙、 葡萄、 蓝莓、 红枣、 樱桃、 荔枝、 蜜桃、 柿子、 草莓等较为理想。 在果酒中， 最出名的要数葡萄酒， 近几 年又因蓝莓含有丰富的花青素可对抗自由基、 具有延缓衰老的功能而深受人们喜爱。 0003 果酒的酿制工艺为： 采摘鲜果分选破碎、 除梗果浆分离取汁澄清清 汁发酵倒桶贮酒过滤冷处理调配过滤成品。 原料品种是保证果酒产品质 量的重要因素之一， 它将直接影响果酒酿制后的感观特性。 其中， 从采摘的鲜果中选取的水 果要求水果成熟度达到全熟透、 果汁糖分含量高且无霉烂变质。

8、、 无病虫害。 而酿制后的成品 果酒中， 含酸量如果适当， 酒的滋味就醇厚、 协调、 适口。 反之适口性差、 酸味过重、 酒汁失光 浑浊， 降低消费者的购买欲。 果酒中的酸一部分是由原料带来的， 如葡萄中的酒石酸， 苹果 中的苹果酸， 杨梅中的柠檬酸等； 也有发酵过程中产生的(酵母菌代谢物)， 如醋酸， 丁酸， 乳 酸， 琥珀酸等。 L-苹果酸和酒石酸是葡萄酒中最突出的有机酸， 在葡萄酒酿造过程中起着至 关重要的作用， 包括葡萄酒的感官品质和物理， 生物化学和微生物稳定性。 果酒产品质量指 标中有一项就是要控制果酒中有机酸的总量。 0004 综上所述， 在果酒的酿制工艺中， 鲜果的防腐保藏和成。

9、品酒中有机酸总量的控制 是影响果酒成本和质量的两个重要环节。 0005 据分析， 新鲜果蔬品质劣变受诸多因素的影响， 但病害是最主要的原因。 其中， 真 菌性病害引起的腐烂变质是果实采后损失中最严重的因素， 不同水果的主要病害也不同， 葡萄主要由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起黑粉病， 苹果主要由扩展青霉 (Penicillium expansum)引起青霉病。 目前， 解决鲜果防腐的常见和主要的方法是物理防 治和化学药剂防治， 使用化学农药不但导致病原菌产生耐药性而降低杀菌效果， 同时因处 理不干净造成的化学药剂残留也会影响到人们的健康。 而物理防治方法(如低温储藏)需要 。

10、借助专门的设备、 且往往需要耗能， 同时也不利于保留鲜果中营养成分。 而对果酒中有机酸 总量的控制， 现有技术通常是在果酒中加入降酸剂(可食用的碱)、 阴离子交换树脂柱子降 酸、 低温冷冻降酸等， 前一株降酸方式因引入碱影响果酒的风味和口感， 后一株降酸方式只 能影响在生产的过程中对有机酸进行控制且成本高效率低， 灌装完成后无法对酒中有机酸 进行控制。 0006 生物降酸法， 是一株比较新的方法， 其利用微生物代谢途径将果酒中的有机酸分 解以达到降酸目的， 相比物理和化学降酸， 生物降酸， 不仅能够降低果酒的酸度， 更重要的 是可以增加果酒的稳定性,提升酒的品质， 副作用较小,目前研究较多的是。

11、苹果酸-乳酸发 酵(malolactic fermentation， MLF)， 是由乳酸菌进行发酵。 乳酸菌会产生苹果酸-乳酸酶， 说明书 1/15 页 3 CN 112111416 A 3 L-苹果酸在该酶的催化作用下变成L-乳酸和二氧化碳， 相对于苹果酸来说， 乳酸较为柔和， 因此达到降酸作用。 但乳酸也是有机酸， 因而该方法实际上并不能有效降低果酒中的有机 酸和改善果酒口感。 发明内容 0007 (一)要解决的技术问题 0008 为了解决现有技术的上述问题， 本发明提供一株用于果酒全过程绿色生产的东方 伊萨酵母及其应用。 该菌株不仅具有生防效果， 对水果采后病原真菌具有抑制作用， 可以。

12、代 替化学杀菌剂防治水果采后病害， 保持水果新鲜防止腐烂变质； 同时该菌株还有优异的降 低果酒中柠檬酸、 乳酸、 甲酸和乙酸等有机酸的功能， 可用于果酒的发酵降酸。 尤其是当果 酒为蓝莓果酒时， 所述菌株还能显著提高蓝莓果酒中花青素含量， 且几乎能够完全降解掉 蓝莓果酒中的柠檬酸。 0009 (二)技术方案 0010 为了达到上述目的， 本发明采用的主要技术方案包括： 0011 申请人采用WL营养琼脂培养基对自然发酵的蓝莓果酒中微生物进行筛选和纯化， 得到可有效利用柠檬酸、 酒石酸的且其降酸能力对酒精浓度不敏感的菌株， 通过鉴定， 确认 该菌株为东方伊萨酵母(I.orientalis)， 将其。

13、分类命名为I.orientalis WTB20042304， 并 于2020年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No.19724。 0012 基于本发明筛选的酵母菌株， 本发明还提供如下的技术方案： 0013 本发明还涉及上述东方伊萨酵母菌株I.orientalis WTB20042304在水果采后贮 藏保鲜或果酒降酸中的应用。 具体包括： 0014 方案一： 一株鲜果保鲜方法， 是将东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304配制 成菌悬液， 利用该菌悬液对鲜果进行喷洒或浸涂。 0015 具体方法为： 将东方伊萨酵母I.or。

14、ientalis WTB20042304活化， 用YPD液体培养基 发酵培养， 离心得到菌体， 将菌体用无菌水清洗去除培养基后配制成浓度为1106CFU/mL 1108CFU/mL的菌悬液； 将水果放入菌悬液中， 浸泡30秒后取出， 风干； 放入保鲜盒中， 密 封后， 放入常温贮藏。 0016 优选地， 所述鲜果为葡萄或蓝莓。 0017 优选地， 所述活化步骤为： 取固体培养基上的单菌落于YPD液体培养基， 于26、 200r/min条件下培养24h， 4000rpm离心5min收集菌体， 用无菌水洗3遍。 0018 方案二： 一株果酒降酸发酵方法， 是在向果汁中接种酿酒酵母之前， 先接种东方。

15、伊 萨酵母I.orientalis WTB20042304， 然后进行发酵处理。 0019 优选地， 所述果酒为蓝莓果酒， 所述果汁为蓝莓果汁。 0020 优选地， 所述方法为： 由新鲜蓝莓破碎后， 再经成分调整得到蓝莓果汁， 向所述蓝 莓果汁中加入东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304， 2-4天后加酿酒酵母， 经糖度调 节、 初发酵、 过滤、 后发酵制得。 延迟加入酿酒酵母目的是使先加入的东方伊萨酵母 I.orientalis WTB20042304能够大量成活， 同时可先行降解果汁中自带的有机酸， 如柠檬 酸、 苹果酸等。 糖后加入， 避免因东方伊萨酵母I.orie。

16、ntalis WTB20042304优先利用糖而失 说明书 2/15 页 4 CN 112111416 A 4 去降酸作用。 0021 优选地， 所述东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的加菌量为1106CFU/ mL。 0022 优选地， 所述酿酒酵母的加菌量为1106CFU/mL， 糖度调节的加糖量为120g/L， 发 酵在22-26的室温环境下进行发酵， 每天搅拌2次， 待发酵结束后过滤， 滤液为蓝莓果酒。 0023 所述东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304在使用前， 包括一个活化处理： 取 固体培养基上的单菌落于YPD液体培养基， 于26。

17、、 200r/min条件下培养24h， 4000rpm离心 5min收集菌体， 用无菌水洗3遍。 0024 (三)有益效果 0025 本发明的有益效果是： 0026 (1)本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304， 在柠檬酸(柠檬酸为 唯一碳源)筛选培养基上培养96h后培养基中柠檬酸的含量下降了92.39， 说明其能够利 用柠檬酸； 在酒石酸(酒石酸为唯一碳源)筛选培养基上培养96h后培养基中酒石酸的含量 下降了38.84， 说明其能够利用酒石酸。 将其加入到蓝莓果汁中进行发酵， 在发酵终点时 未检测到柠檬酸， 说明该菌株具有很强的柠檬酸降解能力。 此外， 若以。

18、仅加入了酿酒酵母的 蓝莓汁发酵液为对照， 同时加入酿酒酵母和东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的蓝 莓汁发酵液， 在发酵终点时乳酸的含量降低了36.17、 甲酸含量降低了24.39、 乙酸含量 降低了9 .20、 琥珀酸含量降低了13 .43。 由此说明， 本发明筛选的东方伊萨酵母 I.orientalis WTB20042304对果酒中的柠檬酸、 乳酸、 甲酸、 乙酸和琥珀酸都有降解能力， 其中尤其对柠檬酸的降解能力尤为显著。 0027 以本发明的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304为降酸酵母， 能对果酒中绝 大部分有机酸起到降解作用， 更重。

19、要的是可以增加果酒的稳定性(装瓶后还能起到稳定酸 度的作用)， 提升酒的品质。 0028 (2)本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304加入到蓝莓果汁发酵 液中， 若以仅加入了酿酒酵母的蓝莓汁发酵液为对照， 同时加入酿酒酵母和东方伊萨酵母 I.orientalis WTB20042304的蓝莓汁发酵液在发酵终点时， 蓝莓果酒中总酚增加了 7.08， 总黄酮增加了2.93， 花青素的含量增加了7.91。 酚类、 黄酮类和花青素是蓝莓 果酒中的重要活性物质， 具有抗氧化、 清除自由基、 抗变异和预防癌变的活性。 DPPH自由基 清除力提升了5.82， FRAP总抗氧。

20、化能力提升了9.58， ABTS自由基清除力提升了5.53， 总还原力提升了4.09， 果酒抗氧化能力的提升有效预防衰老和机体因衰老引起的病变。 因此， 本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304若应用到蓝莓果酒的酿造 中， 则能够大大提升蓝莓果酒的品质。 0029 (4)在发酵制备蓝莓果酒的过程中， 从发酵终点的糖含量可证明， 加入本发明东方 伊萨酵母I.orientalis WTB20042304后并不影响酿酒酵母对蓝莓酒的发酵进程。 因此加入 东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304后蓝莓汁能正常发酵， 发酵终点时酒精度为 11.73， 。

21、SSC为6.81 Bx。 若以仅加入了酿酒酵母的蓝莓汁发酵液为对照(发酵终点时pH 3.61)， 而加入本东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304和酿酒酵母后， 发酵终点的pH为 3.92， 进一步证明本发明的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304有明显的降酸效果。 0030 (5)以本发明的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304作为生防菌， 作为生防 说明书 3/15 页 5 CN 112111416 A 5 菌， 对预先接种了灰葡萄孢菌的葡萄， 对发病率进行统计， 结果为42.22； 在生防菌浓度相 同的情形下， 现有生防菌(。

22、已有菌株， 保藏编号为CGMCC No.14909)的发病率为71.11， 由 此说明， 本发明酵母菌株相比现有生防菌， 对灰葡萄孢菌具有更好的抑制作用。 0031 由此可知， 本发明的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304不仅能够在鲜果采 摘后防止鲜果腐烂变质保证其新鲜度， 同时还能够在后期使用果汁发酵酿酒时起到降酸作 用， 且其降酸作用不受酒精浓度影响， 也不影响酿酒酵母的正常发酵进程， 可对果酒中绝大 多种类的有机酸都能起降酸效果、 提升果酒口感和品相(酸度高酒汁呈浑浊)， 是一株可应 用于果酒制备工艺全程的优选菌株， 在鲜果保鲜储藏时所喷洒的生防菌悬液即使有部分残。

23、 留， 其在发酵过程中依然能发挥其降酸效果。 此外， 还能增加果酒中酚类、 黄酮类和花青素 等活性物质的含量， 提升抗氧化和总还原力进一步提升果酒品质。 附图说明 0032 图1为本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的形态学特征的照 片。 0033 图2为本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的总DNA的PCR电泳 检测图谱。 0034 图3为本发明筛选的东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的进化树分析。 具体实施方式 0035 为了更好的解释本发明， 以便于理解， 下面结合附图， 通过具体实施方式，。

24、 对本发 明作详细描述。 0036 一、 菌株的筛选和鉴定 0037 (一)菌株的分离 0038 分别在0d、 3d、 6d、 9d、 12d以及15d对自然发酵的蓝莓果酒进行取样， 将酒样液于WL 营养琼脂培养基进行稀释1000倍、 10000倍和100000倍样品铺板， 26恒温培养48h后获得 单菌落， 所有实验均做两个平行。 挑取单菌落在WL营养琼脂平板上进行分离纯化， 26恒温 培养48h， 根据酵母菌的形态特征挑取疑似菌落镜检， 通过在WL平板上划线分离， 得到纯化 菌种。 0039 (二)东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的生物学特性 0040 (1)形。

25、态学特征 0041 参见图1A、 图1B所示， A代表在WL营养琼脂 【真菌培养基， 75gWL营养琼脂培养基溶 于1000mL水中， 分装后， 121灭菌20min】 上26培养48h的菌落形态， 标尺1cm； B代表在40 倍镜下观察到的细胞形态(标尺10 m)。 据观察， 该菌落形状不规则， 白色， 平坦， 粗糙； 在显 微镜下观察， 细胞为椭圆形， 直径在8 m左右。 0042 (1)分子生物学鉴定 0043 采用SDS煮沸法提取该菌株总DNA， 以NL-1和NL-4为引物扩增26s rDNA D1/D2区 目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳分析(电泳条件： 180V,30min)， 结果如。

26、图2所示； 检测目的 片段大小正确， 样品进行DNA测序。 0044 同源性比对与进化树结果 说明书 4/15 页 6 CN 112111416 A 6 0045 将测序基因序列与Gene Bank内已知菌株的相应序列进行比对， 在straininfo找 到相应的模式菌株， 通过同源性比对结果构建系统发育进化树。 参见图3所示。 结果表明： 菌 株与I.orientalis(EU585754.1),在同一分枝上置信度达到100， 且亲缘性很近(距离为 0)从而确定该菌株鉴定为东方伊萨酵母(I.orientalis)。 0046 二、 东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304。

27、的降酸特性 0047 (一)以柠檬酸、 酒石酸为唯一碳源的培养基， 测试东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304的降酸能力 0048 (1)实验材料 0049 菌株： 东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(蓝莓果 酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(蓝莓果酒 发酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(蓝莓果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂果酒发 酵醪液)P.cactophila(保藏菌株编号为CGM。

28、CC No.14909) 0050 药品和试剂 0051 表1药品和试剂 0052 0053 实验仪器 0054 表2实验主要仪器 0055 0056 培养基 0057 柠檬酸培养基： 将1g柠檬酸， 1g酵母浸粉， 2g蛋白胨和0.1g磷酸二氢钾溶于100mL 说明书 5/15 页 7 CN 112111416 A 7 水中， 通过121高压灭菌20min灭菌， 备用。 0058 酒石酸培养基： 将1g酒石酸， 1g酵母浸粉， 2g蛋白胨和0.1g磷酸二氢钾溶于100mL 水中， 通过121高压灭菌20min灭菌， 备用。 0059 (2)实验方法 0060 将培养好东方伊萨酵母I.orie。

29、ntalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(蓝 莓果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(蓝莓 果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(蓝莓果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂果 酒发酵醪液)P.cactophila(保藏菌株编号为CGMCC No.14909)， 分别挑取单菌落到装有5ml YPD培养基的试管中， 在摇床上进行摇瓶16-24h， 以保证其纯度和活力， 取出， 去上清液， 加 水清洗后离心3次， 最后加入1ml水定容， 制成菌悬液。

30、。 将制备好的菌悬液梯度稀释10倍、 100 倍和1000倍， 选用1000倍用血球计数板在显微镜下进行细胞计数， 用公式算出菌悬液浓度， 再稀释至2106CFU/mL。 0061 在96孔板中分别加入100 L上述的加酸培养基(上述柠檬酸培养基、 酒石酸培养 基)以及100 L菌悬液， 每株菌做三个平行。 分别在0h、 24h、 48h、 72h扫描590nm下的吸光度， 并计算与0h吸光度的差值， 通过吸光度的差值来反映菌株生长状况， 进而判定这些菌株能 否利用相应有机酸进行生长。 0062 (3)单一降酸效果分析 0063 分别准备3份柠檬酸培养基和酒石酸培养基， 每瓶培养基各50mL，。

31、 灭菌备用。 将培 养好的3株菌分别挑取单菌落到装有5mLYPD培养基的试管中， 在摇床上进行摇瓶16-24h， 以 保证其纯度和活力， 取出， 去上清液， 加水离心3次， 最后加入1ml水定容， 制成菌悬液， 并进 行血球计数。 将3株菌分别加入到对应的三角瓶中， 使酵母菌的终浓度均为106CFU/mL， 放入 恒温摇床中摇瓶， 26， 200rpm， 分别在0h、 48h、 96h进行取样， 每次取24mL， 在取样时间点 分别测有机酸含量。 0064 采用液相色谱仪检测条件： 0065 色谱柱： Agilent 5 TC-C18(2504.6mm)， 以pH为2.4的磷酸氢二氨为流动相，。

32、 柱 温为45、 流速为0.8ml/min， 进样量为20 L的色谱条件下分别对含有柠檬酸、 酒石酸的培 养基以及加入3株降酸酵母后的有机酸培养基发酵48h和96h的样品离心并稀释20倍后用高 效液相色谱仪进行检测。 通过柠檬酸、 酒石酸标准品色谱图结果确定有机酸的保留时间， 并 与0h培养基中各有机酸色谱峰面积的对比， 检测各菌株的降酸效果。 测试前， 首先将0h柠檬 酸和0h酒石酸培养基的样品用超纯水稀释20倍， 上样检测， 然后分别对48h、 96h的培养基稀 释并检测。 0066 标准曲线的建立： 称取一定量的有机酸标准品放入容量瓶内， 用超纯水稀释配制 成10mg/ml的母液， 用流。

33、动相稀释成所需浓度， 浓度梯度分别为2.5mg/ml， 2mg/ml， 1mg/ml， 0.4mg/ml， 0.2mg/ml， 0.1mg/ml， 依次进样得到相应峰面积， 用最小二乘法得到相应线性回 归方程。 0067 (4)实验结果 0068 以柠檬酸和酒石酸为唯一碳为唯一碳源降酸效果， 如表3-表5： 0069 表3:相对于实验开始时在柠檬酸中的OD590增加值 说明书 6/15 页 8 CN 112111416 A 8 0070 0071 表4:相对于实验开始时在酒石酸中的OD590增加值 0072 0073 0074 表5:72h柠檬酸和酒石酸的含量 0075 0076 由表3可知，。

34、 向柠檬酸培养基(柠檬酸为唯一碳源)中加入由表3可知， 向柠檬酸培 养基(柠檬酸为唯一碳源)中加入I.orientalis WTB20042304菌株后， 在培养48h、 72h时吸 光度增加1.6以上。 高于其它菌株。 由表4可知， 向酒石酸培养基(酒石酸为唯一碳源)中加入 I.orientalis WTB20042304菌株后， 在培养48h、 72h时吸光度增加1.1以上。 高于其它菌株。 由表5可知， I.orientalis WTB20042304对柠檬酸的降解率达到92.39， 其它菌株均低于 90； 对酒石酸的降解率达到41.04， 其它菌株均低于40。 0077 综上， 菌株在。

35、利用柠檬酸和酒石酸的能力最强。 说明书 7/15 页 9 CN 112111416 A 9 0078 (二)东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304对蓝莓醪液中有机酸和活性物质 的影响 0079 (1)实验材料 0080 菌株： 东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304、 I.orientalis WTBD2(蓝莓果 酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(葡萄果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD3(蓝莓果酒 发酵醪液)、 I.orientalis WTBD4(蓝莓果酒发酵醪液)、 I.orientalis WTBD5(山楂。

36、果酒发 酵醪液)P.cactophila(保藏菌株编号为CGMCC No.14909) 0081 蓝莓： 由日照尚礼酒厂2019年1月6日提供， 品种为北陆 0082 药品和试剂 0083 表6药品和试剂 0084 0085 实验仪器 0086 表7实验主要仪器 说明书 8/15 页 10 CN 112111416 A 10 0087 0088 0089 (2)实验方法 0090 将蓝莓破碎， 然后分装到3个发酵罐中， 每个发酵罐中放3.5公斤蓝莓。 将活化好的 东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304和Pichia cactophila BY35(现有菌株、 保藏菌 株编。

37、号为CGMCC No.14909)分别加入2个发酵罐中， 加菌量为1106CFU/mL， 对照组中不加 任何降酸酵母。 在第3天时再加酿酒酵母， 浓度也为1106CFU/mL， 加糖120g/L。 将发酵罐放 在22的条件下进行发酵， 每天搅拌2次。 待发酵结束后过滤， 果酒滤液密封保存。 0091 (3)蓝莓果酒指标测定 0092 a、 理化指标测定 0093 pH值测定： 用pH计测定。 SSC测定： 用糖度计测定。 酒精度测定： 用酒精计测定。 总糖 测定： 苯酚硫酸法， 1mL样品+0.5mL5苯酚溶液+2.5mL浓硫酸， 混匀5min后， 取出冷却至室 温， 分光光度计490nm处测。

38、吸光值。 总酸测定： 根据国标法测定。 0094 b、 活性物质测定 0095 总酚含量的测定参考Singleton 【Singleton V.L.,Rossi J.A.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagentsJ .American Journal of Enology and Viticulture,1965,16:144-158. 】 的方法。 总黄酮含 量根据王友升等的方法 【朱昱燕,王友升,赵茜等.槐花中抗氧化及清除自由基活性物质的 提取条件研究J.食品工业科技,2。

39、009(12):130-132. 】 ， 以芦丁作标准曲线， 醪液中总酚含 量换算为每克样品中芦丁的含量。 花青素含量的测定参考许昆 【许昆.干型蓝莓酒的生产工 艺研究D.安徽大学,2014. 】 的方法。 0096 c、 蓝莓果酒降酸效果检测 0097 混合标准品的配制： 固体标准品各取10mg， 液体标准品母液各取100 L， 用流动相 定容至10ml， 混合均匀后， 与4冰箱中避光保存。 使用时用注射器取1ml过45 L微孔膜于液 相小瓶中在最优条件下检测。 0098 样品前处理： 首先将样品用超纯水稀释20倍， 上样检测， 然后分别对48h、 96h的培 养基稀释并检测。 0099 液。

40、相条件： 色谱柱： Agilent 5 TC-C18(2504.6mm)， 以pH为2.4的磷酸氢二氨为 流动相， 柱温为45、 流速为0.8ml/min， 进样量为20 L的色谱条件下分别对含有柠檬酸、 酒 石酸的培养基以及加入2株降酸酵母后的有机酸培养基发酵48h和96h的样品离心并稀释20 倍后用高效液相色谱仪进行检测。 通过柠檬酸、 酒石酸标准品色谱图结果确定有机酸的保 留时间， 并与0h培养基中各有机酸色谱峰面积的对比， 检测各菌株的降酸效果。 0100 (4)实验结果 0101 柠檬酸含量变化 0102 发酵开始时蓝莓汁中的柠檬酸含量较高， 为6.81g/L， 而在发酵终点时， 除。

41、对照组 说明书 9/15 页 11 CN 112111416 A 11 (不加降酸酵母)， 其余2组均未检测到柠檬酸。 0103 由此说明， I.orientalis WTB20042304酵母在蓝莓果酒中对柠檬酸有很强的降解 能力。 0104 乳酸含量变化 0105 发酵开始时的乳酸含量很少， 只有0.08g/L。 通过对比发酵终点与发酵开始时的乳 酸含量可以看出， 酿酒酵母在发酵过程中会产生乳酸， 因此对照组在发酵终点时乳酸含量 为0.94g/L。 具体结果如表8： 0106 表8 0107 0108 0109 此外， 加入本发明筛选的酵母菌株时， 发酵终点的乳酸的含量与对照组相比降低 了。

42、36.17， 明显优于现有酵母菌株的降乳酸能力， 也优于其他实验组菌株。 0110 甲酸含量变化 0111 发酵开始时的蓝莓汁中检测到的甲酸只有0.07g/L， 且酿酒酵母在发酵过程中会 产生较多甲酸， 在发酵终点时对照的甲酸含量为0.41g/L。 通过对比发酵终点与发酵开始时 的甲酸含量可以看出， 酿酒酵母在发酵过程中会产生甲酸。 具体结果如表9： 0112 表9 0113 说明书 10/15 页 12 CN 112111416 A 12 0114 P.cactophila BY35加入到蓝莓醪液中后， 反而增加了甲酸的含量， 推测可能是分 解其他有机酸而生成了部分甲酸。 而本发明筛选的I.。

43、orientalis WTB20042304有降解甲酸 的能力， 在发酵终点时甲酸含量为0 .31g/L， 相比对照组下降了24 .39， 其它实验组 I.orientalis对甲酸的降解均小于10。 0115 乙酸含量变化 0116 发酵开始时蓝莓汁中含有极少量的乙酸， 只有0.15g/L， 酿酒酵母在发酵过程中会 产生一定量乙酸， 发酵终点时对照组的乙酸含量达到14.79g/L。 明酿酒酵母在发酵过程中 很容易产生乙酸。 实验结果如表11。 0117 表10 0118 0119 加入本发明的I.orientalis WTB20042304后， 乙酸的含量相比于对照组降低了 9.20， I.。

44、orientalis WTBD5与I.orientalis WTB20042304对乙酸的降解能力相当， I.orientalis WTBD2相对于对照降低小于5， 其它菌株相对于都对照组乙酸积累高于对 照。 0120 琥珀酸含量变化 0121 发酵开始时蓝莓汁中含有极少量的琥珀酸， 只有0.05g/L， 酿酒酵母在发酵过程中 会产生琥珀酸， 发酵终点时对照组的琥珀酸含量为0.67g/L。 通过对比发酵终点与发酵开始 时的琥珀酸含量可以看出， 酿酒酵母在发酵过程中会产生琥珀酸。 具体结果如表10。 0122 表11 0123 说明书 11/15 页 13 CN 112111416 A 13 0。

45、124 0125 加入本发明的I.orientalis WTB20042304菌株相对于对照组， 琥珀酸降低了 13.43， 而其他菌株相对于对照组琥珀酸的积累均大于对照组。 0126 由此可知， I.orientalis WTB20042304在蓝莓果酒发酵中， 对柠檬酸、 乳酸、 甲酸、 乙酸和琥珀酸都有降解作用， 对柠檬酸的降解尤为显著。 0127 I.orientalis WTB20042304对蓝莓果酒中活性物质的影响 0128 对照组在发酵终点时总酚含量为1.13mg/g， 总黄酮含量为1.05mg/g， 花青素含量 为120.29mg/L。 0129 0130 相对于对照组， 加。

46、入菌株I.orientalis WTB20042304， 总酚含量升高10.37高于 其它菌株， 总黄酮含量升高2.93高于其它菌株， 花青素含量7.91高于其它菌株。 0131 表12 0132 说明书 12/15 页 14 CN 112111416 A 14 0133 0134 相对于对照组， 加入菌株I.orientalis WTB20042304各抗氧化指标都升高， 其中 DPPH升高了9.44， FRAP升高了9.58， ABTS升高了6.50， 总还原力升高了15.92。 其中 FRAP升高量略低于菌株I.orientalis WTBD4， 但其它抗氧化指标均高于I.orienta。

47、lis WTBD4。 0135 I.orientalis WTB20042304对蓝莓果酒中pH的影响 0136 加入降酸酵母后的蓝莓果酒均能正常发酵， 发酵终点时所有处理的酒精度为 11.73， SSC为6.87 Bx。 发酵终点时对照的pH为3.61。 加入东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304后， 发酵终点pH为3.92。 说明本发明的I.orientalis WTB20042304有明显的降 酸效果。 0137 (四)东方伊萨酵母I.orientalis WTB20042304对鲜果的生防效果 0138 (1)实验材料 0139 菌株： 酵母菌： 东方伊萨酵母I.。

48、orientalis19724 0140 病原菌： 灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)， 为本实验室保存 0141 水果： 葡萄， 购买于北京新发地 0142 实验主要仪器， 参见表2 0143 (2)实验方法 0144 步骤1： 配制酵母菌菌悬液， 作为生防菌菌悬液， 包括如下步骤： 0145 活化菌株： 在YPD平板上取1个单菌落接种到YPD液体培养基， 26摇床培养24h。 0146 收集菌体： 离心， 去除培养基， 加入1mL无菌水冲洗(用移液枪吹打或者震荡混 匀)， 12000r/min， 4， 2min离心。 此操作重复三次。 去水， 留下菌体后， 加入1mL无菌水混匀。

49、， 稀释到合适倍数。 0147 血球板计数： 先盖上载玻片， 在上室和下室分别加入10 L菌悬液， 首先用10倍镜 找到方格， 再换40倍镜计数。 计数后稀释成目标浓度悬浮液。 0148 步骤2： 配制霉菌菌悬液 0149 在灭菌的10mL离心管中加入2mL无菌水， 用灭菌的镊子夹取培养基表面的菌丝， 加 入离心管中， 用移液枪吹打混匀， 使孢子完全混入水中， 用滤布过滤后用血球计数板计数， 稀释成5104CFU/mL浓度孢子悬浮液。 0150 步骤3： 果实准备 说明书 13/15 页 15 CN 112111416 A 15 0151 将买回来的葡萄进行挑选， 将有碰伤和损坏的单独放， 将。

50、挑选出来的成熟度和大 小一致的好果用清水洗净， 再用次氯酸钠水溶液(0.5)处理5min， 然后摆放到经过清洗的 盒子里面， 每盒15个葡萄， 待葡萄表面水分晾干后， 用刺伤针开始刺伤， 每个果实刺伤1个 孔， 每次刺伤一盒将接种针灼烧。 待葡萄的汁液晾干后(大约4h)， 实验组加入20 L目的浓度 酵母菌悬液， 在4h后(基本上酵母菌悬液被完全吸收)加入20 L病原菌5104CFU/mL的孢子 悬浮液， 对照组也加入无菌水20 L， 装框时在框内放入俩团用水打湿的卫生纸球。 0152 步骤4： 对发病(腐烂)情况进行统计 0153 腐烂率的统计方法采用观察法， 计算公式为： 腐烂率()烂果数。