用于临床诊断的复合质控品及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011316538.5 (22)申请日 2020.11.23 (71)申请人 南京佰抗生物科技有限公司 地址 210000 江苏省南京市栖霞区仙林街 道仙林大学城纬地路9号C6幢房屋 903、 905室 (72)发明人 芮兵 (74)专利代理机构 连云港联创专利代理事务所 (特殊普通合伙) 32330 代理人 刘刚 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/70(2006.01) G01N 33/531(2006.01) G01N 33。

2、/543(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/72(2006.01) G01N 33/74(2006.01) (54)发明名称 一种用于临床诊断的复合质控品及其制备 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于铁蛋白纳米颗粒载 体连接的多个诊断标志物特异性表位多肽分子 的复合质控品及其制备方法, 通过抗体检测及表 位分析技术我们可以将绝大多数的诊断标志物 蛋白的优势表位定位出来, 然后通过连接酯链接 到铁蛋白分子上, 形成 “FerLinkerEpitope Peptide” 复合物, 将合成的该复合物基因序列通 过特定的载体转入原核大肠杆菌重组表达, 这样 。

3、含有多个诊断标志物优势表位多肽分子的复合 抗原 (质控品) 就可以同时被多个诊断试剂检测 出来。 本发明的质控品检测效率高, 成本低, 稳定 性极佳, 可在28条件下长期稳定保存。 权利要求书1页 说明书7页 序列表8页 附图1页 CN 112094355 A 2020.12.18 CN 112094355 A 1.一种用于临床诊断的复合质控品, 其特征在于, 包括铁蛋白和与铁蛋白通过连接酯 链接的若干个诊断标志物特异性表位多肽分子; 所述诊断标志物特异性表位多肽分子为以下任意一种或多种: PCT的诊断标志物特异性表位多肽MKASEL、 IL6的诊断标志物特异性表位多肽QNRFESSEEQ、 。

4、Myo的诊断标志物特异性表位多肽ATKHKIPVK、 CRP的诊断标志物特异性表位多肽APLTKPL、 PGI的诊断标志物特异性表位多肽GSFLYYA、 PGII的诊断标志物特异性表位多肽GTNFVY、 BNP的诊断标志物特异性表位多肽CFGRKMDRI、 或SAA的诊断标志物特异性表位多肽为ANYIGSDKY; 所述的连接酯为谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丝氨酸。 2.权利要求1所述的用于临床诊断的复合质控品的制备方法, 其特征在于, 包括以下步 骤: S1、 将诊断标志物蛋白的优势表位定位出来; S2、 将S1中获取的诊断标志物蛋白的优势表位通过连接酯链接到铁蛋白分子上, 形成 复合物序列; S。

5、3、 将该复合物序列合成出来并在体外进行原核大肠杆菌重组表达, 即得含有多个诊 断标志物优势表位多肽分子的复合抗原。 权利要求书 1/1 页 2 CN 112094355 A 2 一种用于临床诊断的复合质控品及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及免疫诊断试剂的质控品技术领域, 具体为一种用于临床诊断的复合质 控品及其制备方法。 背景技术 0002 在我国, 体外诊断试剂是指: 可单独使用或与仪器、 器具、 设备或系统组合使用,在 疾病的预防、 诊断、 治疗监测、 预后观察、 健康状态评价以及遗传性疾病的预测过程中,用于 对人体样本(各种体液、 细胞、 组织样本等)进行体外检测的试剂、 试。

6、剂盒、 校准品(物)、 质控 品(物)等。 0003 质控品是体外诊断试剂的重要而必不可少的组成部分, 主要用于对体外诊断试剂 进行质量控制。 在实际的临床应用过程中, 检验人员使用体外诊断试剂检测病人的样本 (血 清, 尿液等) , 在此之前, 需要对试剂进行质量验证以确保检测结果的准确性。 0004 质控品是指经过一系列严格的量值溯源体系, 有确定的靶值及允许的偏差范围的 一类质量稳定的生物化学制品。 体外诊断试剂在使用之前需要先测试配套的质控品, 若结 果显示在允许的偏差范围内则判定试剂质量合格, 可用于检测病人样本并报告正确的结 果; 若结果显示超出了允许的偏差范围则判定试剂盒质量不合。

7、格, 不可用于检测病人样本, 否则会导致错误的诊断结果。 0005 在免疫诊断试剂产品中, 质控品通常是用抗原 (靶蛋白) 按照一定的流程配置的, 并对其进行赋值和稳定性的验证。 传统的质控品多为单一项目的质控品, 且多使用靶蛋白 分子序列全长作为配置质控品的原料, 这样的制备方法效率低下, 成本高, 且通常稳定性较 差 (需要制成冻干品以提高稳定性) 。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是克服现有技术中免疫诊断试剂的质控品为单一项目 的质控品, 制备效率低的缺陷, 提供一种复合质控品。 0007 为了解决上述技术问题, 本发明提供了如下的技术方案: 一种基于铁蛋白纳米颗粒载体连接的。

8、多个诊断标志物特异性表位多肽分子的复合质 控品及其制备方法, 其基本原理如下: 通过抗体检测及表位分析技术我们可以将绝大多数 的诊断标志物蛋白的优势表位 (一个表位通常是由57个氨基酸组成的多肽) 定位出来, 然 后通过连接酯 (Linker) 链接到铁蛋白 (Fer) 分子上, 形成 “Fer-Linker-Epitope Peptide” 复合物, 并合成的该复合物基因序列通过特定的载体转入原核大肠杆菌重组表达, 这样含 有多个诊断标志物优势表位多肽分子的复合抗原 (质控品) 就可以同时被多个诊断试剂检 测出来。 0008 本发明的质控品检测效率高, 成本低, 稳定性极佳, 可在28条件下。

9、长期稳定保 存。 0009 通常, 这里的Linker是指GGG3 (谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-丝氨酸) , Peptide是指经 说明书 1/7 页 3 CN 112094355 A 3 过表位分析鉴定方法测出的一段57个氨基酸多肽, 如PCT (降钙素原) 蛋白序列如下, 其序 列如SEQ ID NO.13所示: APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRS-KR-CGNLSTCMLGT YTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP-GKKR-DMSSDLERDHRPHVSMPQNAN 鉴定的优势表位为: MKASEL。 0。

10、010 该方法制备的复合质控品相比于传统的单一品种质控品有如下优势: 一、 产品使用更加高效便捷: 复合质控品含有多个诊断标志物的优势表位, 可以实现一 个质控品多个项目同时检测的高效率, 在制备和使用两个过程中都避免了重复操作。 0011 二、 成本更低: 一方面使用的原料仅为一个片段分子而非蛋白全长, 节约了表达全 长蛋白的成本; 另一方面省去了冻干及重复制备的成本, 极大降低了平均到单个质控品的 制备成本。 0012 三、 稳定性极佳: 由于铁蛋白分子量大, 结构稳定 (常被用着疫苗的连接载体) , 整 个复合质控品分子展现了极佳的液体稳定性, 可在28度条件下长期稳定保存。 附图说明 。

11、0013 附图用来提供对本发明的进一步理解, 并且构成说明书的一部分, 与本发明的实 施例一起用于解释本发明, 并不构成对本发明的限制。 在附图中: 图1是 “Fer-Linker-Epitope Peptide” 复合物的模型图。 具体实施方式 0014 以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明, 应当理解, 此处所描述的优选实 施例仅用于说明和解释本发明, 并不用于限定本发明。 实施例 0015 一种用于临床诊断的复合质控品, 包括铁蛋白和与铁蛋白通过连接酯链接的若干 个诊断标志物特异性表位多肽分子。 0016 铁蛋白是由24个单体自组装形成的球形聚体, 是分子结构非常稳定纳米颗粒蛋 白,。

12、 其中C、 N terminal和loop zone均可以用于插入外源基因片段, 可将外源多肽或蛋白稳 定的展示在球形颗粒的表面, 基于上述原理, 铁蛋白载体作为纳米颗粒疫苗载体, 药物呈 递, 活体成像等领域被广泛关注。 本研究中我们利用分子生物学方法将多诊断标志物的优 势表位序列在基因层面上串联到铁蛋白上, 利用原核大肠杆菌表达系统表达出含有多诊断 标志位优势表位的铁蛋白复合质控品。 0017 具体制备方法: 铁蛋白载体氨基酸序列, 其序列如SEQ ID NO.1所示。 0018 MLSKDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAK。

13、KLIIFLNENNVPVQ LTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGN ENHGLYLADQYVKGIAKSRKS 多诊断标志物预测的优势表位如下: PCT: MKASEL, 其序列如SEQ ID NO.2所示; 说明书 2/7 页 4 CN 112094355 A 4 IL6: QNRFESSEEQ, 其序列如SEQ ID NO.3所示; Myo: ATKHKIPVK, 其序列如SEQ ID NO.4所示。 0019 CRP: APLTKPL, 其序列如SEQ ID NO.5所示。

14、。 0020 PGI: GSFLYYA, 其序列如SEQ ID NO.6所示。 0021 PGII; GTNFVY, 其序列如SEQ ID NO.7所示。 0022 BNP: CFGRKMDRI, 其序列如SEQ ID NO.8所示。 0023 SAA: ANYIGSDKY, 其序列如SEQ ID NO.9所示。 0024 将各诊断标志物优势表位序列串联插入到铁蛋白的序列中, 插入后的序列如SEQ ID NO.10所示: MHHHHHHGSMKASELGGGGSLSKDIIKLLNEQVNKEMNSSNLYMSMSSWCYTHGSQNRFESSEEGSSLDGAGL FLFDHAAEEYEHA。

15、KKLIIFLNENNGSATKHKIPVKGSAPLTKPLGSFLYYAVPVQLGSGTNFVYGSTSISAPEHKFE GLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSGSGTNFVYGSCFGRKMDRIGSANYIGSDKYGSKDHATFNFLQWYVAE QHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS 将上述序列用密码子优化软件在大肠杆菌表达系统中优化, 优化后序列如SEQ ID NO.11所示: CATATGCACCATCATCATCACCATGGTAGCATGAAAGCAAGCGAATTAGGTGGTGGTGGTAGCCTG。

16、AGCAAAG ATATTATCAAACTGCTGAATGAACAGGTGAACAAAGAAATGAATAGCAGCAACCTGTATATGAGCATGAGCAGCTGG TGTTATACCCATGGTAGTCAGAATCGTTTTGAAAGCAGTGAAGAGGGTAGCAGCCTGGATGGTGCAGGTCTGTTTCT GTTTGATCATGCAGCCGAAGAATATGAGCACGCAAAAAAACTGATCATCTTCCTGAATGAAAATAATGGCAGCGCCA CCAAACATAAAATTCCGGTTAAAGGTAGCGCACCGCTGACCAAACCGCTGGGTAGCTT。

17、TCTGTATTATGCAGTTCCG GTTCAGTTAGGTAGCGGCACCAATTTTGTTTATGGTAGCACCAGCATTAGTGCACCGGAACATAAATTTGAAGGTCT GACCCAGATTTTCCAGAAAGCCTATGAACATGAACAGCATATTAGCGAGAGCATCAACAACATTGTGGATCATGCAA TTAAAAGCGGTTCAGGTACGAACTTTGTGTATGGTTCATGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTGGTAGCGCCAAT TATATCGGCAGCGATAAATATGGCAGCAAAGATCATGCCACCTTTA。

18、ACTTTCTGCAGTGGTATGTTGCAGAACAGCA TGAAGAAGAAGTGCTGTTTAAAGACATCCTGGATAAAATTGAACTGATCGGCAATGAAAACCATGGTCTGTATCTGG CAGATCAGTATGTGAAAGGTATTGCCAAAAGCCGCAAAAGCTAACTCGAG 双下划线分别为NdeI和XhoI酶切位点; 将上述核苷酸序列送基因合成公司进行基因合成并用NdeI&XhoI酶切位点克隆至pET- 30a(+)表达载体中,完成表达质粒的构建。 0025 将构建好的质粒转化到BL21 (DE3) 感受态中进行诱导表达; 当菌液OD600nm达到。

19、0.6 时, 加入终浓度为0.1mM的IPTG, 16诱导表达24h, 12000g, 离心5min; 用lysis buffer (50mM NaH2PO4,300mM NaCl, 10mM imidazole, pH8.0) 重悬菌体, 超声破碎菌体后, 12000g,离心30min, 上清用0.45um滤器过滤; Lysis buffer平衡Ni NTA Beads 6FF后上样, Wash buffer (50mM NaH2PO4,300mM NaCl, 60mM imidazole, pH8.0) 洗涤20倍柱体积, Elution buffer (50mM NaH2PO4,300m。

20、M NaCl, 250mM imidazole, pH8.0) 洗脱目的蛋白, 将 蛋白透析至PBS缓冲液中保存即得该复合质控品蛋白。 0026 将制备好的8种复合质控品进行靶值测定与稳定性验证 (全部使用进口品牌且在 国内已注册、 临床使用的体外诊断试剂盒验证) , 数据如下: 表1实施例获得的质控品稳定性数据 说明书 3/7 页 5 CN 112094355 A 5 表1显示了实施例所得的质控品的稳定性数据, 由表1可见本发明的质控品37高温放 置30天测试靶值结果无明显变化, 稳定性极佳, 在冷藏28条件下, 放置380天靶值仍然 在允许的偏差范围内。 0027 备注: 表1展示了8个诊。

21、断项目的复合质控品, 但本发明包括但不限于这8项的复合 质控品, 本发明的质控项目包含目前临床上运用的所有免疫诊断试剂盒质控品 (以国家食 品药品监督管理局网站能够查询到的免疫诊断项目为准) 。 0028 质控品均一性验证 随机抽取同一生产批次的10瓶质控品, 每包装单元测试1次, 按下面的公式计算测试结 果的平均值和标准差S1; 另用上述质控品中的1瓶连续测试10次数, 计算测试结果的平均值 和标准差S2; 按下列各公式计算瓶间重复性CV%。 0029公式 1 公式 2 公式 3 公式 4 当S1S2时, 令CV瓶间=0 式中:-平均值; S-标准差; n-测量次数; xi-指定参数第i 次。

22、测量值。 0030 结果如下: 表2 PCT质控品的均一性验证 说明书 4/7 页 6 CN 112094355 A 6 表3 IL6质控品的均一性验证 表4Myo质控品的均一性验证 表5 BNP质控品的均一性验证 表6 PGI质控品的均一性验证 说明书 5/7 页 7 CN 112094355 A 7 表7 PGII质控品的均一性验证 表8 SAA质控品的均一性验证 表9 CRP质控品的均一性验证 说明书 6/7 页 8 CN 112094355 A 8 上述数据表明本发明中的复合质控品具有良好的瓶间重复性, 各测试项目重复性CV小 于1%。 0030 最后应说明的是: 以上所述仅为本发明的。

23、优选实施例而已, 并不用于限制本发明, 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明, 对于本领域的技术人员来说, 其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改, 或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内, 所作的任何修改、 等同替换、 改进等, 均应包含在本发明的 保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 112094355 A 9 序列表 南京佰抗生物科技有限公司 一种用于临床诊断的复合质控品及其制备方法 2020-11-19 13 SIPOSequenceListing 1.0 1 167 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 1 M。

24、et Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys 1 5 10 15 Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr 20 25 30 Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala 35 40 45 Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn 50 55 60 Asn Val 。

25、Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe 65 70 75 80 Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His 85 90 95 Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys 100 105 110 Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His 115 120 125 Glu Glu。

26、 Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile 130 135 140 Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly 145 150 155 160 Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser 165 2 6 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 2 序列表 1/8 页 10 CN 112094355 A 10 Met Lys Ala Ser Glu Leu 1 5 3 10 PRT 人工序列(Artificial。

27、 Sequence) 3 Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln 1 5 10 4 9 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 4 Ala Thr Lys His Lys Ile Pro Val Lys 1 5 5 7 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 5 Ala Pro Leu Thr Lys Pro Leu 1 5 6 7 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 6 Gly Ser Phe Leu Tyr Tyr Ala 1 5 7 6 PRT 人工序列(Artificial Sequ。

28、ence) 7 Gly Thr Asn Phe Val Tyr 1 5 8 9 序列表 2/8 页 11 CN 112094355 A 11 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 8 Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile 1 5 9 9 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 9 Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp Lys Tyr 1 5 10 268 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 10 Met His His His His His His Gly Ser Met L。

29、ys Ala Ser Glu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln 20 25 30 Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser 35 40 45 Trp Cys Tyr Thr His Gly Ser Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu 50 55 60 Gly Ser Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe 。

30、Asp His Ala Ala 65 70 75 80 Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn 85 90 95 Asn Gly Ser Ala Thr Lys His Lys Ile Pro Val Lys Gly Ser Ala Pro 100 105 110 Leu Thr Lys Pro Leu Gly Ser Phe Leu Tyr Tyr Ala Val Pro Val Gln 115 120 125 Leu Gly Ser Gly Thr Asn Phe Val Tyr Gly Ser Thr。

31、 Ser Ile Ser Ala 130 135 140 Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr 145 150 155 160 Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His 165 170 175 序列表 3/8 页 12 CN 112094355 A 12 Ala Ile Lys Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Val Tyr Gly Ser Cys Phe 180 185 190 Gly Arg 。

32、Lys Met Asp Arg Ile Gly Ser Ala Asn Tyr Ile Gly Ser Asp 195 200 205 Lys Tyr Gly Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr 210 215 220 Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp 225 230 235 240 Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp 245 250 255 。

33、Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser 260 265 11 816 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 11 Cys Ala Thr Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys 1 5 10 15 Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Thr 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Thr T。

34、hr Ala 35 40 45 Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Cys Cys 50 55 60 Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr 65 70 75 80 Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala 85 90 95 Cys Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Ala Al。

35、a 100 105 110 Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr 115 120 125 Gly Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys 130 135 140 Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Cys 145 150 155 160 Ala Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Th。

36、r Cys Gly 165 170 175 序列表 4/8 页 13 CN 112094355 A 13 Thr Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Thr Gly Ala Ala 180 185 190 Gly Ala Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly 195 200 205 Ala Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Thr 210 215 220 Thr Cys Thr Gly Thr。

37、 Thr Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala 225 230 235 240 Gly Cys Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys 245 250 255 Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr 260 265 270 Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Thr。

38、 Ala Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Cys Cys 305 310 315 320 Gly Gly Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Cys Ala 325 330 335 Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Cys Gly Cys 340 345 350 Thr。

39、 Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Ala 355 360 365 Thr Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr 370 375 380 Cys Ala Gly Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala 385 390 395 400 Cys Cys Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly 405 410。

40、 415 Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr 420 425 430 Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ala Ala Thr 435 440 445 Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala 450 455 460 Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys 465。

41、 470 475 480 Thr Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys 序列表 5/8 页 14 CN 112094355 A 14 485 490 495 Ala Thr Ala Thr Thr Ala Gly Cys Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr 500 505 510 Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr 515 520 525 Cys Ala Thr Gly Cys Ala Ala 。

42、Thr Thr Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly 530 535 540 Gly Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Ala Cys Gly Ala Ala Cys Thr Thr 545 550 555 560 Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Thr 565 570 575 Thr Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly 580 585 590 Ala Thr Cys Gly Thr 。

43、Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Gly Cys Gly Cys 595 600 605 Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys 610 615 620 Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala 625 630 635 640 Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr 645 650 655 Thr Ala Ala 。

44、Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly 660 665 670 Thr Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys 675 680 685 Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr 690 695 700 Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly 705 710 715 720 Gly 。

45、Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala 725 730 735 Thr Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala 740 745 750 Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala 755 760 765 Gly Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Ala Gly 770 775 780 。

46、Gly Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Cys Gly 785 790 795 800 序列表 6/8 页 15 CN 112094355 A 15 Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Cys Gly Ala Gly 805 810 815 12 171 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 12 Xaa Xaa Xaa Xaa Met Leu Ser Lys Asp Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu 1 5 10 15。

47、 Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser 20 25 30 Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe 35 40 45 Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe 50 55 60 Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro 65 70 75 80 Glu 。

48、His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu 85 90 95 His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala 100 105 110 Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val 115 120 125 Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys 130 135 140 Ile。

49、 Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln 145 150 155 160 Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser 165 170 13 116 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 13 Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val G。

50、ln Asp 20 25 30 Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu 序列表 7/8 页 16 CN 112094355 A 16 35 40 45 Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser 50 55 60 Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr 65 70 75 80 Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val。

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