聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸及其在DNA测序和SNPs检测中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010195201.7 (22)申请日 2020.03.19 (71)申请人 北京师范大学 地址 100875 北京市海淀区新街口外大街 19号 (72)发明人 欧阳津孙菲菲那娜 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 白凤莹 (51)Int.Cl. C07H 19/207(2006.01) C07H 19/10(2006.01) C07H 1/00(2006.01) C09K 11/06(2006.01) C12Q 1/6858(2018。

2、.01) C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸及其在DNA 测序和SNPs检测中的应用 (57)摘要 本发明公开了聚集诱导荧光分子修饰的核 苷酸及其在DNA测序和SNPs检测中的应用。 本发 明首先公开了一种化合物， 该化合物为名称为 dNTPs-HCAP的聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP为dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP- HCAP或dGTP-HCA。 进一步公开了上述化合物在检 测单核苷酸多态性和/或DNA测序中的应用。 本发 明利用具有双重荧光信号的聚集诱导荧光分子 合成了dNTPs-HCAP。

3、， 并将其引入到扩增反应体系 中， 通过扩增反应前后加入虾碱性磷酸酶并检测 加入虾碱性磷酸酶前后的荧光信号变化， 可用于 检测单核苷酸多态性和小片段DNA测序， 具有重 要的应用价值和意义。 权利要求书2页 说明书15页 序列表1页 附图11页 CN 112110968 A 2020.12.22 CN 112110968 A 1.一种化合物， 其特征在于： 所述化合物为名称为dNTPs-HCAP的聚集诱导荧光分子修 饰的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP为dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP或dGTP-HCAP； 其中， 所述 dATP-HCAP的结构式如式 所示， 。

4、所述dTTP-HCAP的结构式如式所示， 所述dCTP-HCAP的结 构式如式所示， 所述dGTP-HCAP的结构式如式所示： 2.权利要求1所述的化合物的制备方法， 其特征在于： 所述制备方法包括将dNTPs的 位磷酸根与名称为HCAP的2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰基)磷酸的磷酸根进行共价连 接， 得到权利要求1所述的化合物； 其中， 所述dNTPs为dATP、 dTTP、 dCTP或dGTP， 对应所述 dNTPs-HCAP分别为dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP、 dGTP-HCAP。 3.一种dNTPs的修饰物， 其特征在于： 所述修饰物为权利要。

5、求1中所述dNTPs-HCAP中任 两种、 任三种或任四种。 4.权利要求1所述的化合物或权利要求3中所述的修饰物在检测单核苷酸多态性和/或 DNA测序中的应用。 权利要求书 1/2 页 2 CN 112110968 A 2 5.用于DNA测序的成套试剂， 其特征在于： 所述成套试剂包括权利要求1所述的化合物 或权利要求3中所述的修饰物和虾碱性磷酸酶。 6.权利要求5所述的成套试剂在DNA测序中的应用。 7.用于检测单核苷酸多态性的成套试剂， 其特征在于： 所述成套试剂包括权利要求1所 述的化合物或权利要求3中所述的修饰物、 锁式探针和虾碱性磷酸酶。 8.权利要求7所述的成套试剂在检测单核苷酸。

6、多态性中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于： 所述检测单核苷酸多态性是利用锁式探 针-滚坏扩增反应检测单核苷酸多态性。 10.一种试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权利要求1所述的化合物， 或权利要求3 中所述的修饰物， 或权利要求5所述的成套试剂， 或权利要求7所述的成套试剂。 权利要求书 2/2 页 3 CN 112110968 A 3 聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸及其在DNA测序和SNPs检测 中的应用 技术领域 0001 本发明涉及基因测序领域， 具体涉及聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸及其在DNA 测序和SNPs检测中的应用。 背景技术 0002 DNA测序技术在生。

7、物医疗领域具有重要意义。 其中， 边合成边测序法是一种快速、 高效的检测方法， 例如454测序仪采用的焦磷酸测序法， 在四种酶的联合作用下， 能进行边 合成边测序。 为简化测序程序， 先后出现了以美国PacBio公司的单分子实时测序法为代表 的一些其他的边合成边测序法。 在DNA合成过程中， 使用的核苷酸通常分为两种， 一种为普 通的天然核苷酸， 另一种为人工修饰的核苷酸， 如用荧光分子、 核苷酸或聚合物等修饰的核 苷酸可以用于DNA测序或一些靶标生物分子的检测。 在DNA测序中， 天然核苷酸使用时需要 引入额外的反应来产生检测信号， 操作步骤较繁琐， 为使其更简化， 有科学家提出将荧光标 记。

8、的核苷酸引入到DNA测序中， 该反应在DNA聚合酶和磷酸酶的作用下能产生实时荧光， 从 而可进行更快速、 灵敏度更高的测序。 因此， 荧光分子修饰的核苷酸在DNA测序方法研究中 具有重要意义。 0003 随着荧光材料的发展， 唐本忠等人发现了一种聚集诱导荧光分子， 不同于普通荧 光分子的聚集淬灭现象， 该种分子在溶液状态下不发光或发出弱荧光， 但在聚集态时发出 很强荧光(Hong,Yuning,Jacky WY Lam,and Ben Zhong Tang.Aggregation-induced emission:phenomenon,mechanism and applications.Ch。

9、emical Communications 29 (2009):4332-4353.)。 聚集诱导荧光分子在生物成像及检测中具有独特的潜力和优势， 但 迄今为止还没有将聚集诱导荧光分子应用于基于DNA扩增反应的单碱基核苷酸多态性检测 和小片段DNA序列的检测。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题为如何准确地检测单核苷酸多态性和小片段DNA序 列。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了一种化合物。 0006 本发明所提供的化合物为名称为dNTPs-HCAP的聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸， 所述dNTPs-HCAP为dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCA。

10、P或dGTP-HCAP； 其中， 所述dATP-HCAP的 结构式如式 所示， 所述dTTP-HCAP的结构式如式所示， 所述dCTP-HCAP的结构式如式所 示， 所述dGTP-HCAP的结构式如式所示： 说明书 1/15 页 4 CN 112110968 A 4 0007 0008 本发明进一步提供了上述化合物的制备方法。 0009 本发明所提供的上述化合物的制备方法包括将dNTPs的位磷酸根与名称为HCAP 的2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰基)磷酸的磷酸根进行共价连接， 得到上述化合物； 其 中， 所述dNTPs为dATP、 dTTP、 dCTP和dGTP， 对应所述dNTPs。

11、-HCAP为dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP和dGTP-HCAP。 0010 上述化合物中全部、 任三种、 任两种的dNTPs的修饰物也在本发明的保护范围之 内。 0011 上述化合物或dNTPs的修饰物在检测单核苷酸多态性(SNPs)和/或DNA测序中的应 用也在本发明的保护范围之内。 0012 上述应用中， 所述检测单核苷酸多态性为检测是否存在单核苷酸多态性和/或检 测单核苷酸多态性的碱基突变的类型。 0013 为解决上述技术问题， 本发明进一步提供了用于DNA测序的成套试剂。 0014 本发明所提供的用于DNA测序的成套试剂包括上述化合物(dNTPs-HCA。

12、P)或dNTPs 说明书 2/15 页 5 CN 112110968 A 5 的修饰物和虾碱性磷酸酶(rSAP)。 0015 上述用于DNA测序的成套试剂， 可以只由上述化合物或dNTPs的修饰物和虾碱性磷 酸酶组成， 也可以包括其他组分。 0016 上述用于DNA测序的成套试剂的制备方法包括将dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP- HCAP、 dGTP-HCAP和虾碱性磷酸酶分别进行单独包装的步骤。 0017 本发明所提供DNA测序的方法， 包括向扩增反应体系中加入上述化合物和虾碱性 磷酸酶的步骤。 0018 在本发明具体的实施方式中， 所述DNA测序包括如下步骤： 在待测D。

13、NA一端加上接 头得到待测模板， 将与接头序列互补的引物修饰到磁珠上并与待测模板杂交后加入到扩增 反应体系中， 在扩增反应体系中逐次加入dNTPs-HCAP中一种检测550nm处和640nm处荧光信 号(分别计为Fa1和Fb1)， 扩增反应完成后加入虾碱性磷酸酶检测550nm处和640nm处荧光信 号(分别计为Fa2和Fb2)， 根据550nm处和640nm处荧光信号变化(分别计为550nm和 640nm， 550nmFa2-Fa1， 640nmFb2-Fb1)确定待测DNA的待测碱基的信息； 0019 所述待测DNA的待测碱基的信息的判断方法如下： 构建四种参照DNA， 所述参照DNA 的待。

14、测第一位碱基分别为A、 G、 C、 T， 且第二位与第一位碱基不相同； 在四种参照DNA一端加 上上述接头得到四种参照模板， 将与接头序列互补的引物修饰到磁珠上并与四种参照模板 分别杂交后加入到四个扩增反应体系中， 在每个扩增反应体系中逐次加入dNTPs-HCAP中一 种， 分别测定与参照DNA的待测第一位碱基互补配对时550nm和640nm荧光信号变化和 不互补配对时550nm和640nm空白荧光信号变化， 最终得到互补配对时A-H、 G-H、 C-H、 T- H的550nm和640nm的荧光信号变化和不互补配对时A-H、 G-H、 C-H、 T-H的550nm和 640nm的空白荧光信号变。

15、化范围； 0020 若加入dNTPs-HCAP中一种检测到的550nm和640nm荧光信号变化在所述空白 荧光信号变化范围内， 则说明加入的dNTPs-HCAP对应的dNTPs的碱基与待测DNA上待测碱基 不互补配对； 若检测到的550nm和640nm荧光信号变化不在所述空白荧光信号变化范围 内且接近上述相应碱基互补配对时的550nm和640nm荧光信号变化， 则说明加入的 dNTPs-HCAP对应的dNTPs的碱基与待测DNA上待测碱基互补配对； 若检测到550nm和 640nm荧光信号变化不在所述空白荧光信号变化范围内且接近上述相应碱基互补配对时的 550nm和640nm荧光信号变化的N倍。

16、(N为大于等于1的自然数)， 则说明加入的dNTPs- HCAP对应的dNTPs的碱基与待测DNA上待测碱基及待测碱基的下N-1位互补配对， 从而确定 待测碱基的信息， 以此类推， 确定待测DNA中所有待测碱基的信息， 完成待测DNA的测序。 0021 为解决上述技术问题， 本发明还提供了用于检测单核苷酸多态性的成套试剂。 0022 上述成套试剂中， 所述检测单核苷酸多态性为检测是否存在单核苷酸多态性和/ 或检测单核苷酸多态性的碱基突变的类型。 0023 本发明所提供的用于检测单核苷酸多态性的成套试剂， 包括上述化合物或dNTPs 的修饰物、 虾碱性磷酸酶和锁式探针。 0024 上述用于检测单。

17、核苷酸多态性的成套试剂， 可以只由上述化合物(dNTPs-HCAP)或 dNTPs的修饰物、 虾碱性磷酸酶(rSAP)和锁式探针组成， 也可以包括其他组分。 0025 上述用于所述检测单核苷酸多态性的成套试剂的制备方法包括将dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP、 dGTP-HCAP、 rSAP和锁式探针分别进行单独包装的步骤。 说明书 3/15 页 6 CN 112110968 A 6 0026 本发明进一步提供了上述用于检测单核苷酸多态性的成套试剂在检测单核苷酸 多态性中的应用。 0027 上述应用中， 所述检测单核苷酸多态性具体为利用滚环扩增反应检测单核苷酸多 态。

18、性； 更具体的为利用锁式探针-滚环扩增反应检测单核苷酸多态性。 0028 上述应用中， 所述检测单核苷酸多态性为检测是否存在单核苷酸多态性和/或检 测单核苷酸多态性的碱基突变的类型。 0029 本发明进一步还提供了一种试剂盒， 所述试剂盒包括上述化合物， 或dNTPs的修饰 物或上述用于DNA测序的成套试剂或上述用于检测单核苷酸多态性的成套试剂。 0030 上述试剂盒为用于检测单核苷酸多态性和/或用于DNA测序的试剂盒。 0031 上述试剂盒中， 所述检测单核苷酸多态性为检测是否存在单核苷酸多态性和/或 检测单核苷酸多态性的碱基突变的类型。 0032 在本发明中， 检测是否存在单核苷酸多态性的。

19、方法包括如下步骤： 0033 根据野生型靶标分子设计一条锁式探针， 所述锁式探针从3 端起第一位核苷酸与 野生型靶标分子的单核苷酸多态性位点互补， 从3 端起第二位开始后的一段序列与野生型 靶标分子的单核苷酸多态性位点的下游序列反向互补配对， 所述锁式探针的5 端的一段序 列与野生型靶标分子的单核苷酸多态性位点的上游序列互补配对； 根据锁式探针设计一条 与锁式探针特异性结合的引物； 0034 分别利用野生型靶标分子和突变型靶标分子诱导锁式探针进行成环反应后加入 到滚环扩增反应体系中， 将滚环扩增反应体系中dNTPs中一种替换为相应的dNTPs-HCAP检 测640nm处荧光信号(计为F1)， 。

20、利用引物进行滚环扩增反应， 完成后加入虾碱性磷酸酶检测 640nm处荧光信号(计为F2)， 根据640nm处荧光信号变化(计为640nm， 640nmF2-F1)确 定是否存在单核苷酸多态性， 所述是否存在单核苷酸多态性的判断方法如下： 如果野生型 靶标分子滚环扩增反应前后在640nm处有荧光信号变化， 而突变型靶标分子滚环扩增反应 前后在640nm处无荧光信号变化， 那么说明发生单碱基突变， 即存在SNPs； 如果野生型靶标 分子和突变型靶标分子滚环扩增反应前后在640nm处均有荧光信号变化， 那么说明没有发 生单碱基突变， 即不存在SNPs。 0035 本发明中检测单核苷酸多态性的碱基突变。

21、的类型， 需要完成上述检测是否存在单 核苷酸多态性后， 另外设计三种锁式探针， 三种锁式探针上相应位置碱基与上述检测是否 存在单核苷酸多态性中的锁式探针的碱基互不相同， 根据上述检测是否存在单核苷酸多态 性的方法先利用突变型靶标分子诱导锁式探针进行成环反应进行滚环扩增反应， 如果滚环 扩增反应前后在640nm处有荧光信号变化则说明突变型靶标分子的突变碱基与该锁式探针 上碱基互补配对， 确定单核苷酸多态性的碱基突变的类型； 如果滚环扩增反应前后在640nm 处无荧光信号变化， 则说明突变型靶标分子的突变碱基与该锁式探针上碱基不互补配对。 0036 本发明利用具有双重荧光信号的聚集诱导荧光分子合成。

22、了聚集诱导荧光分子标 记的核苷酸(dNTPs-HCAP)， 并将其引入到扩增反应体系中， 通过扩增反应前后加入虾碱性 磷酸酶并检测加入虾碱性磷酸酶前后的荧光信号变化， 可用于检测单核苷酸多态性和小片 段DNA测序。 另外， 双重荧光信号的检测使得边合成边测序方法更准确、 简便， 具有重要的应 用价值和意义。 说明书 4/15 页 7 CN 112110968 A 7 附图说明 0037 图1为HCA的1H NMR图。 0038 图2为HCA的13C NMR图。 0039 图3为HCA质谱图。 0040 图4为HCAPE的1H NMR图。 0041 图5为HCAPE的13C NMR图。 0042。

23、 图6为HCAPE的31P NMR图。 0043 图7为HCAPE质谱图。 0044 图8为HCAP的1H NMR图。 0045 图9为HCAP的13C NMR图。 0046 图10为HCAP的31P NMR图。 0047 图11为HCAP质谱图。 0048 图12为HCAP水溶液在虾碱性磷酸酶作用前(HCAP)后(HCA)的荧光激发光谱(Ex)和 荧光发射光谱(Em)。 0049 图13为dNTPs-HCAP的质谱图； 其中， A： dATP-HCAP(A-H)质谱图； B： dTTP-HCAP(T-H) 质谱图； C： dCTP-HCAP(C-H)质谱图； D： dGTP-HCAP(G-H。

24、)质谱图。 0050 图14为紫外-可见吸收光谱； 其中， A： dATP、 HCAP、 A-H； B： dGTP、 HCAP、 G-H； C： dCTP、 HCAP、 C-H； D： dTTP、 HCAP、 T-H。 0051 图15为荧光发射光谱图； 其中， A： rSAP作用前； B： rSAP作用后。 0052 图16为dNTP-HCAP用于RCA反应监测SNPs； 其中， A： 反应机理图； B： DNA聚合酶筛选； C： 一种或四种混合dNTPs-HCAP用于RCA反应中； D： RCA反应过程琼脂糖凝胶电泳分析； E、 四 种dNTP-HCAP分别用于检测WT和MT的结果； F、。

25、 dATP-HCAP用于检测四种不同浓度的WT和MT时 640nm荧光信号。 0053 图17为dNTPs-HCAP对小片段DNA的测序的机理及程序。 0054 图18为dNTPs-HCAP用于小片段DNA的测序； 其中， A： 测序片段及引物序列； B： 测序 过程中550nm和640nm荧光信号变化。 正置柱状图为640nm， 倒置柱状图为550nm。 具体实施方式 0055 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术 人员进行进一步改进的指南， 并不以任何方式构成对本发明的限。

26、制。 0056 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材 料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0057 本发明下述实施例中用到的溶液的组分及配比： 0058 缓冲液1： 10mM Tris-HCl,1mM MnCl2,40mM NH4Cl,100mM KCl,pH 7.5， 溶剂为水。 0059 缓冲液2： 100mM phosphate buffer,100mM NaCl,pH 7.3， 溶剂为水。 0060 洗涤液1： 10mM Tris-HCl,1mM MnCl2,40mM NH4Cl,100mM KCl,0.05Tween 20,。

27、pH 7.5， 溶剂为水。 0061 洗涤液2： 100mM phosphate buffer,100mM NaCl,0.05Tween 20,pH 7.3， 溶剂 说明书 5/15 页 8 CN 112110968 A 8 为水。 0062 本发明下述实施例中琼脂糖凝胶电泳方法如下： 0063 称取1.25g琼脂糖溶于25mL TAE(2mol/L三羟甲基氨基甲烷-醋酸； 100mmol/L乙二 胺四乙酸钠)电泳液中， 微波炉加热3min后， 加入2.5 L10000 x SYBR gold DNA染料， 混匀后 加入凝胶模具中， 制备5琼脂糖凝胶。 样品溶液中加入上样缓冲液混匀， 加入到凝。

28、胶孔中， 设置电压120V， 时间50min， 进行凝胶电泳。 0064 实施例1 聚集诱导荧光分子HCAP的合成 0065 一、 4-二甲氨基-2 -羟基查尔酮(4-Dimethylamino-2 -hydroxychalcone， HCA)合 成 0066 称取4-二甲氨基苯甲醛(12mmol,1.79g)与2-羟基苯乙酮(13.2mmol,1.80g)于 100mL圆底烧瓶中， 加入30mL乙醇搅拌使其溶解。 称取KOH(2.8g,50mmol)溶于2mL水中， 然后 加入到圆底烧瓶中， 室温搅拌24小时。 反应结束后， 用稀盐酸调节反应体系pH至7.0， 抽滤并 用乙醇洗涤3次沉淀物，。

29、 将滤饼烘干。 烘干后的滤饼溶解于二氯甲烷中， 抽滤并用二氯甲烷 洗涤3次， 收集滤液， 减压旋蒸得到的产物采用质子核磁共振谱(1H NMR)、 质子核磁共振谱 (13C NMR)、 高分辨质谱进行鉴定， 1H NMR图如图1、13C NMR图如图2和质谱图如图3所示。1H NMR(400MHz， CDCl3)数据为： (TMS， ppm)7.94-7.88(m， 2H)， 7.59-7.53(d， 2H)， 7.49-7.41 (m， 2H)， 7.02-6.97(m， 1H)， 6.94-6.88(t， 1H)， 6.72-6.66(d， 2H)， 符合HCA分子的H原子信 息。 13C 。

30、NMR(100MHz， CDCl3)数据为： 193.55， 163.54， 152.38， 146.61， 135.73， 130.94， 129.45， 122.47， 120.47， 118.66， 118.56， 114.38， 111.93， 39.98， 符合HCA分子中C原子信 息。 质谱数据： HCA的分子式为C17H17NO2(M)， 计算分子量为267.1293(M)， 测定分子量为 268.2500(M+H)， 符合HCA分子的分子量。 因此确定了得到的产物为HCA， 结构式如下： 0067 0068 二、 2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰基)磷酸二乙酯(2-(3。

31、-(4-(Dimethylamino) phenyl)acryloyl)phenyl Diethyl Phosphate， HCAPE)合成 0069 称取HCA(1mmol,267mg)和NaH(2mmol,80mg)于100mL两口瓶中， 加入20mL超干四氢 呋喃(THF)使其充分溶解， 氮气保护条件下逐滴加入氯磷酸二乙酯(POCl(OEt)2)(2.0mmol, 0.3mL)， 室温搅拌2小时。 反应结束后加入2mL水猝灭反应。 将反应产物减压旋干， 粗产物用 乙酸乙酯和水萃取3次， 收集上层有机相并用无水硫酸镁干燥， 减压旋蒸得到粗产物。 粗产 物进行柱层析薄层色谱分离， 展开剂为石。

32、油醚与乙酸乙酯(5:1)， 收集产物点， 减压旋蒸得 到的橙黄色油状产物采用核磁共振氢谱(1H NMR)、 核磁共振碳谱(13C NMR)、 核磁共振磷谱 (31P NMR)、 高分辨质谱进行鉴定， 1H NMR图如图4、13C NMR图如图5、31P NMR图如图6和质谱 图如图7所示， 1H NMR(400MHz， DMSO-D6)数据为： (TMS， ppm)7.59-7.43(m,6H)， 7.36-7.30 (t， 1H)， 7.13-7.06(d， 1H)， 6.72-6.66(d， 2H)， 4.13-4.04(m， 4H)， 2.98-2.93(s， 6H)， 1.19- 1.。

33、14(m， 6H)， 除去其中未除干净的二氯甲烷的H原子， 其它均符合HCAPE分子的H原子信息符 合HCAPE分子的H原子信息。 13C NMR(100MHz， DMSO-D6)数据为： 191.28， 152.57， 148.10， 146.38， 133.09， 132.43， 131.08， 130.23， 125.62， 121.94， 121.23， 120.88， 112.24， 64.99， 16.26， 除去其中未除干净的二氯甲烷的C原子， 其它均符合HCAPE分子的C原子信息。 31P NMR 说明书 6/15 页 9 CN 112110968 A 9 (162MHz,DM。

34、SO-D6)数据为： -6.26。 质谱数据： HCAPE的分子式为C17H17NO2(M)， 计算分子量为 403.1582(M)， 测定分子量为404.1667(M+H)， 符合HCAPE分子的分子量。 因此确定了得到的 产物为HCAPE， 结构式如下： 0070 0071 三、 2-(3-(4-(二甲氨基)苯基)丙烯酰基)磷酸(2-(3-(4-(Dimethylamino) phenyl)acryloyl)phenyl Phosphate， HCAP)合成 0072 称取HCAPE(0.5mmol,201mg)于100mL两口瓶中， 加入25mL超干二氯甲烷(DCM)使其 充分溶解， 在。

35、0、 氮气保护条件下， 逐滴加入三甲基碘硅烷(TMS-I)(2mmol,0.28mL)。 室温 搅拌3小时。 反应结束后， 加入2mL甲醇搅拌0.5小时终止反应。 产物减压旋蒸， 得到粗产物。 粗产物进行柱层析薄层色谱分离， 展开剂为甲醇与乙酸乙酯(10:1)， 收集产物点， 减压旋蒸 得到的橙黄色油状产物采用核磁共振氢谱(1H NMR)、 核磁共振碳谱(13C NMR)、 核磁共振磷 谱(31P NMR)、 高分辨质谱进行鉴定， 1H NMR图如图8、13C NMR图如图9、31P NMR图如图10和质 谱图如图11所示， 1H NMR(400MHz， CDCl3)数据为： (TMS,ppm。

36、)7.75-7.66(d,2H)， 7.61-7.50 (m,4H)， 7.38-7.25(m， 2H)， 7.18-7.07(d,2H)， 除去其中未除干净的甲醇的H原子， 其余均符 合HCAP分子的H原子信息。 13C NMR(100MHz,DMSO-D6)数据为： 190.99， 149.50， 143.82， 132.39， 130.55， 129.83， 124.21， 120.83， 114.80， 41.70， 除去其中未除干净的甲醇的C原 子， 其余均符合HCAP分子的C原子信息。 31P NMR(162MHz,DMSO-D6)数据为： -6.00。 质谱数据： HCAP的分子。

37、式为C17H18NO5(M)， 计算分子量为347.0923(M)， 测定分子量为346.8333(M-H)， 符 合HCAP分子的分子量。 因此确定了得到的产物为HCAP， 结构式如下: 0073 0074 HCAP水溶液加入虾碱性磷酸酶(rSAP)， 在rSAP作用下HCAP与rSAP反应得到了HCA， 检测加入rSAP前后的荧光激发和荧光发射光谱如图12， 结果显示rSAP作用后， HCAP绿色荧 光降低(550nm)， 红色荧光增强(640nm)。 0075 实施例2： 聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸(dNTPs-HCAP)的合成 0076 本实施例中聚集诱导荧光分子修饰的核苷酸(dNT。

38、Ps-HCAP)包括聚集诱导荧光分 子修饰核苷酸dATP-HCAP(A-H)、 dTTP-HCAP(T-H)、 dCTP-HCAP(C-H)和dGTP-HCAP(G-H)， 合成 步骤相同， 以dATP-HCAP(A-H)为例进行详细说明： 0077 dATP(12.5 mol,125 L)用BioRad AG-50w-XB离子交换柱酸化， 然后向该溶液中加 入等物质的量三正丁胺(12.5umol,3.0 L)室温搅拌5分钟。 减压旋蒸除去其中的水， 再用 2mL超干N,N-二甲基甲酰胺(DMF)旋干两次， 然后溶于0.5mL DMF中。 在氮气保护下， 向该DMF 溶液中加入溶于0.5mL 。

39、DMF的1,1 -羧基二咪唑(63 mol,10.1mg)， 室温搅拌12小时。 反应结 束后加入3.2 L无水甲醇反应0.5小时。 将合成的HCAP溶于DMF溶剂中配成100mmol溶液， 并 加入等物质的量三正丁胺使其成盐。 取该染料溶液0.25mL加入到上述反应体系中， 并同时 说明书 7/15 页 10 CN 112110968 A 10 加入溶于0.5ml DMF的无水溴化镁(136 mol,25mg)， 室温搅拌30小时， 整个反应均在氮气保 护下进行。 反应结束后， 减压旋干， 并将产物溶于2mL水中得到粗产物。 将粗产物用Hi-Trap Q-HP(5mL)阳离子交换柱纯化， 纯。

40、化时先用去离子水再用50mmol/L哌嗪-1,4-二乙磺酸/ (1mol/L氯化钠)缓冲液冲柱。 收集产物， 加入虾碱性磷酸酶(10U,10 L)37搅拌0.5小时， 水解未反应的HCAP和dATP。 反应结束后， 用0.22 m水相滤头过滤， 滤液用高效液相色谱分离 并收集连接产物。 洗脱剂为A(50mmol/L醋酸三乙胺,pH 7.0)和B(乙腈)， 洗脱梯度为： 0- 6min： A(85)， B(15)； 6-20min： A(8580.8)， B(1519.2)； 10-15min： A (80.8)， B(19.2)。 收集得到的连接产物减压旋干后利用质谱检测， 结果如图13中A所。

41、 示， ESI-MS(A-H,m/z):calcd.for C27H32N6O16P4:820.0825(M),found 819.0000(M-H)， 确定 得到的产物为dATP-HCAP， 结构式如式 所示， -20备用。 dATP-HCAP进行紫外-可见吸收光 谱检测， 结果如图14中A所示， 最大紫外-可见吸收峰为262nm和427nm。 0078 0079 dTTP-HCAP的合成步骤同dATP-HCAP， 区别在于将dATP分别替换为dTTP。 收集得到 的连接产物减压旋干后利用质谱检测， 结果如图13中B所示， ESI-MS(T-H,m/z):calcd.for C27H33N3。

42、O18P4:811.0710(M),found 809.8333(M-H)， 确定得到的产物为dTTP-HCAP， 结构式如 式所示， -20备用。 dTTP-HCAP进行紫外-可见吸收光谱检测， 结果如图14中B所示， 最大 紫外-可见吸收峰为267nm和427nm。 0080 0081 dCTP-HCAP的合成步骤同dATP-HCAP， 区别在于将dATP分别替换为dCTP。 收集得到 的连接产物减压旋干后利用质谱检测， 结果如图13中C所示， ESI-MS(C-H,m/z):calcd.for C26H32N4O17P4:796.0713(M),found 795.4167(M-H),8。

43、17.4167(M-2H+Na),839.4167(M-3H+ 2Na),851.4167(M-3H+3Na)， 确定得到的产物为dCTP-HCAP， 结构式如式所示， -20备用。 dCTP-HCAP进行紫外-可见吸收光谱检测， 结果如图14中C所示， 最大紫外-可见吸收峰为 266nm和427nm。 0082 说明书 8/15 页 11 CN 112110968 A 11 0083 dGTP-HCAP的合成步骤同dATP-HCAP， 区别在于将dATP分别替换为dGTP。 收集得到 的连接产物减压旋干后利用质谱检测， 结果如图13中D所示， ESI-MS(G-H,m/z):calcd.fo。

44、r C27H32N6O17P4:836.0774(M),found 835.2500(M-H)， 确定得到的产物为dGTP-HCAP， 结构式如 式所示， -20备用。 dGTP-HCAP进行紫外-可见吸收光谱检测， 结果如图14中D所示， 最大 紫外-可见吸收峰为255nm和427nm。 0084 0085 dATP-HCAP、 dTTP-HCAP、 dCTP-HCAP和dGTP-HCAP及HCAP在rSAP作用前后荧光如图 15所示， dNTPs-HCAP在rSAP作用下550nm和640nm均无荧光变化， 而HCAP在rSAP作用下发生 聚集， 550nm黄绿色荧光减弱且出现640nm红。

45、色荧光。 0086 实施例3 dNTPs-HCAP用于滚环扩增反应检测SNPs 0087 dNTPs-HCAP用于滚环扩增反应检测SNPs原理如图16中A所示， 当野生型靶标分子 与锁式探针Lock完全互补配对时， Lock可以被T4连接酶环化成圆环形DNA。 然后引物 primer2开始进行滚环扩增反应。 在扩增反应中， dNTPs-HCAP上的HCAP分子在DNA聚合酶作 用下脱落， 在虾碱性磷酸酶的作用下磷酸根被水解形成HCA， 发出640nm红色荧光。 而突变型 靶标分子不能与Lock完全互补配对， 因此在T4连接酶作用下不能环化， 所以不能进行后续 的滚环扩增反应， 因此无640nm。

46、红色荧光出现。 因此， 根据640nm处荧光信号变化(640nm) 可以判断靶标分子是否发生单碱基突变。 0088 基于上述原理和下述滚环扩增反应体系的筛选， dNTPs-HCAP用于滚环扩增反应检 测是否存在SNPs的方法包括如下步骤： 0089 1)根据野生型靶标分子， 设计一条具有6090碱基长的锁式探针Lock， 所述锁式 探针Lock从3 端起第一位核苷酸与野生型靶标分子的单核苷酸多态性位点互补， 从3 端起 第二位开始后的一段序列与野生型靶标分子的单核苷酸多态性位点的下游序列反向互补 配对， 所述锁式探针Lock的5 端的一段序列与野生型靶标分子的单核苷酸多态性位点的上 游序列互补。

47、配对， GC含量为25.860.6。 用NUPACK软件预测Lock的二级结构， 改变A、 T、 C、 G四种核苷酸的组成， 使该链没有二级结构从而可以顺利进行RCA反应。 0090 2)根据锁式探针Lock的序列设计引物(primer)， 引物(primer)能与锁式探针Lock 特异性结合， 以实现扩增反应。 0091 3)100nM锁式探针Lock分别与野生型靶标分子(WT)和突变型靶标分子(MT)混合均 匀95加热5分钟然后缓慢降至室温， 得到的产物分别命名为Lock/WT和Lock/MT。 0092 4)在50 L反应体系中加入DNA连接缓冲液、 100nM Lock/WT或Lock。

48、/MT和10U T4DNA 连接酶， 37孵育60分钟后再65加热10分钟使T4DNA连接酶失活， 分别得到Lock/WT环化 反应后的体系和Lock/MT环化反应后的体系。 0093 5)在Lock/WT环化反应后的体系和Lock/MT环化反应后的体系分别加入100nM引物 (primer)， 37孵育1小时， 得到Lock/WT/primer和Lock/MT/primer。 0094 6)在Lock/WT/primer和Lock/MT/primer中分别加入200 M dATP-HCAP、 dTTP、 dCTP 说明书 9/15 页 12 CN 112110968 A 12 和dGTP、 。

49、0.2U/ L Bst DNA聚合酶和5 L 10 x缓冲液1， 加入去离子水至总体积为50 L， 混匀 后检测640nm处荧光信号(记为F1)， 65加热60分钟后加入1U rSAP混匀后检测640nm处荧 光信号(记为F2)， 激发波长为427nm。 检测640nm处荧光信号变化记为640nm(640nm F2-F1)。 根据640nm处荧光信号变化(计为640nm， 640nmF2-F1)确定是否存在单核苷 酸多态性， 所述是否存在单核苷酸多态性的判断方法如下： 0095 如果野生型靶标分子滚环扩增反应前后在640nm处有荧光信号变化(640nm)， 而 突变型靶标分子滚环扩增反应前后在。

50、640nm处无荧光信号变化， 那么说明发生单碱基突变， 即存在SNPs。 0096 dNTPs-HCAP用于滚环扩增反应检测是单核苷酸多态性的碱基突变的类型包括： 需 要完成上述检测是否存在单核苷酸多态性后， 另外设计三种锁式探针， 三种锁式探针上相 应位置碱基与上述检测是否存在单核苷酸多态性中的锁式探针的碱基互不相同， 根据上述 检测是否存在单核苷酸多态性的方法先利用突变型靶标分子诱导锁式探针进行成环反应 进行滚环扩增反应， 如果滚环扩增反应前后在640nm处有荧光信号变化则说明突变型靶标 分子的突变碱基与该锁式探针上碱基互补配对， 确定单核苷酸多态性的碱基突变的类型； 如果滚环扩增反应前后。