甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用.pdf

《甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用.pdf（15页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910962780.0 (22)申请日 2019.10.11 (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 管荣展黄成威杨茂李威岩 邵丹蕾贺建波 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 刘妍妍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及 其应用 (57)摘要 本发明为植物育种领。

2、域， 公开了甘蓝型油菜 半矮杆性状位点的分子标记及其应用， 具体涉及 油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478及其应 用。 在BC6、 BC5F2和BC5F3群体中， 甘蓝型油菜半矮 杆性状与这四个分子标记呈极显著相关， BC6、 BC5F2和BC5F3单株基因型和表型一致， 因此这四 个分子标记在今后的半矮杆油菜辅助选择育种 中具有巨大的应用前景。 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 110607389 A 2019.12.24 CN 110607389 A 1.甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记， 其。

3、特征在于， 所述分子标记为BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 位于甘蓝型油菜A05染色体上， 这四个紧密连锁的 分子标记的上游引物序列分别为Seq A05SD405-F、 Seq A05SD425-F、 Seq A05SD473-F和Seq A05SD478-F下游引物序列分别为Seq A05SD405-R、 Seq A05SD425-R、 Seq A05SD473-R和Seq A05SD478-R； 其中： Seq A05SD405-F的序列如SEQ ID NO.5所示； Seq A05SD405-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

4、； Seq A05SD425-F的序列如SEQ ID NO.7所示； Seq A05SD425-R的序列如SEQ ID NO.8所示； Seq A05SD473-F的序列如SEQ ID NO.9所示； Seq A05SD473-R的序列如SEQ ID NO.10所示； Seq A05SD478-F的序列如SEQ ID NO.11所示； Seq A05SD478-R的序列如SEQ ID NO.12所示。 2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记， 在含所述的甘蓝型油菜 半矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。 3.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记， 在选育半矮杆油。

5、菜品种 和种质中的应用。 4.根据权利要求1所述的甘蓝型半矮杆油菜选育方法， 其特征在于， 确定甘蓝型油菜是 否具备权利要求1所述的分子标记， 并根据检测出的分子标记做出相应的选择。 5.甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记引物对 ， 其特征在于 ， 所述分子标记为 BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 位于甘蓝型油菜A05染色体上， 这四个 紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为Seq A05SD405-F、 Seq A05SD425-F、 Seq A05SD473-F和Seq A05SD478-F， 下游引物序列分别为Seq A05SD40。

6、5-R、 Seq A05SD425-R、 Seq A05SD473-R和Seq A05SD478-R； 其中： Seq A05SD405-F的序列如SEQ ID NO.5所示； Seq A05SD405-R的序列如SEQ ID NO.6所示； Seq A05SD425-F的序列如SEQ ID NO.7所示； Seq A05SD425-R的序列如SEQ ID NO.8所示； Seq A05SD473-F的序列如SEQ ID NO.9所示； Seq A05SD473-R的序列如SEQ ID NO.10所示； Seq A05SD478-F的序列如SEQ ID NO.11所示； Seq A05SD47。

7、8-R的序列如SEQ ID NO.12所示。 6.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记引物对， 在含所述的甘蓝 型油菜半矮杆性状位点的品种和种质检测中的应用。 7.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记引物对， 在选育半矮杆油 菜品种和种质中的应用。 8.根据权利要求1或4所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记或引物对检测半矮杆 甘蓝型油菜的方法， 其特征在于， 利用权利要求4所述的引物对扩增油菜基因组DNA， 扩增产 物在40聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 检测是否获得亲本NJAU5737的扩增片段。 权利要求书 1/2 页 2 CN 110607389 A 2 9.根据权利。

8、要求1或4所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记或引物对选育半矮杆 甘蓝型油菜品种的方法， 其特征在于， 采用权利要求4所述的引物对扩增油菜基因组DNA， 扩 增产物在40聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 检测是否获得NJAU5737的扩增片段。 10.根据权利要求1所述的控制甘蓝型油菜半矮杆位点， 其特征在于， 所述控制甘蓝型 油菜半矮杆位点为BnUD1， 位于甘蓝型油菜A05染色体上BnaA05:11341200bp-11424391bp。 11.根据权利要求1所述的控制甘蓝型油菜半矮杆位点， 其特征在于， 紧密连锁标记 BnA05SD405位于甘蓝型油菜A05染色体上11371008bp-11371。

9、206bp， 其序列如SEQ ID NO.1 所示； 紧密连锁标记BnA05SD425位于甘蓝型油菜A05染色体上11349493bp-11349757bp， 其 序列如SEQ ID NO .2所示； 紧密连锁标记BnA05SD473位于甘蓝型油菜A05染色体上 11361654bp-11361868bp， 其序列如SEQ ID NO.3所示； 紧密连锁标记BnA05SD478位于甘蓝 型油菜A05染色体上11419494bp-11419733bp， 其序列如SEQ ID NO.4所示。 12.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记的筛选方法， 其特征在 于， 步骤如下： (1)遗。

10、传群体构建： 在自交多代的甘蓝型油菜品系中发现一株半矮杆突变体NJAU5737， 利用NJAU5737与常规优良品种中双11杂交， 得到杂种F1， F1与中双11回交多代， 得到BC5、 BC6， BC5连续自交分别得到BC5F2、 BC5F3， 对F1、 BC5、 BC6、 BC5F2和BC5F3进行表型调查； (2)甘蓝型油菜BC6、 BC5F2和BC5F3群体表型测定： 对上述BC6、 BC5F2和BC5F3群体中共2193 个单株进行表型观察以及农艺性状调查； (3)SNP芯片分析： 选择BC5群体中的8个半矮杆单株和回交亲本ZS11以及亲本NJAU5737 一起， 作SNP芯片分析，。

11、 分析回交得到的半矮杆与轮回亲本ZS11之间的遗传差异。 结果得到 BnUD1位点的三个候选区段， 分别位于A05、 C02、 C07染色体上。 (4)根据SNP分析得到的三个区段序列设计SSR引物， 利用BC6、 BC5F2群体， 控制甘蓝型油 菜半矮杆性状的BnUD1位点被定位于A05染色体上， 定位区间位于10139922-13976417bp的 区段内。 (5)利用油菜A05染色体10139922-13976417bp的SSR信息， 设计分子标记， 采用 JoinMap4.0作图软件构建连锁图谱， 将BnUD1位点精细定位于11341200-11424391bp的区段 内； (6)根据。

12、BC5F3群体表型数据和分子标记数据， 发现紧密连锁共显性分子标记 BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 而且其遗传带型清晰可见。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110607389 A 3 甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明为植物育种领域， 具体涉及油菜半矮杆位点及与半矮杆位点的紧密连锁分 子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478及其应用。 背景技术 0002 植物的株型结构是指植物在空间上的三维结构(Reinhardt&Kuhlemeier,。

13、2002)， 株高、 分枝高、 分枝夹角、 叶型等性状对株型结构的建立起着关键的作用(Yusen et al., 2018； Cai et al.,2016)。 株高是理想株型育种和作物产量最重要的目标之一， 降低株高可 以有效地提高作物的抗倒伏能力、 耐肥能力、 收获指数和经济系数， 从而提高作物品质和产 量(Hedden et al.,2003)。 20世纪50至70年代， 半矮秆小麦、 水稻品种的育成在世界范围内 掀起了以矮杆基因利用为主要标志的绿色革命(Winkler et al.,1994)。 因此， 矮杆/半矮 杆作物品种选育是作物育种的十分重要的内容。 0003 甘蓝型油菜(Br。

14、assica napus)是最重要的油料作物之一。 理想的油菜株型结构是 指有着半矮杆性状(植株高度为120-140厘米)、 较小的分支夹角(30 )和高密度的向上生 长的中等长度的角果(Fu et al.,2008)。 随着甘蓝型油菜杂交品种的推广和化肥的广泛应 用， 油菜的平均株高增加了20cm以上， 减少了油菜耐肥能力、 提高了倒伏风险(Foisset et al.,1995)， 油菜倒伏问题已经成为制约油菜产量、 品质提高和机械化收获的重要因素 (Barret et al.,1998)。 降低株高是克服甘蓝型油菜倒伏问题和提高产量的重要途径。 培 育矮杆油菜品种， 就需要恰当的油菜矮杆。

15、种质资源， 并且开发相应的分子标记， 作为育种手 段， 提高育种效率。 0004 油菜的株高调控机制比较复杂， 大多数是受多基因控制。 经过人工EMS诱变和自然 突变， 已获得多个矮杆突变体， 并进行了遗传研究。 如Fossit等(1995)利用EMS诱变甘蓝型 油菜品种Primor获得矮杆突变体bzh， 经遗传研究发现， 该突变体的矮杆基因受一对加性效 应基因控制。“矮源1号” 是江苏省农科院从澳大利亚太平洋种子公司引进的一个矮杆品种， 该品种在成熟期的株高仅为24cm左右， 经遗传研究发现， 其矮杆性状受一个显性基因控制 (浦惠明等， 1995)。 梅德圣等(2006)在育种中发现了矮杆突。

16、变体99CDAM， 经遗传研究发现， 该突变体的矮杆基因受3对隐性基因控制， 并存在细胞质母体效应。 向阳等(2016)在甘蓝型 油菜品系2301中发现矮杆突变体GRC1157， 株高在成熟期仅为80cm左右。 Zeng等(2011)利用 EMS诱变甘蓝型油菜育种材料T6得到矮杆突变体bnC.dwf， 该突变体的株高在成熟期仅为 95cm， 对外源赤霉素不敏感， 经遗传研究发现bnC.dwf的矮化性状受一个显性基因控制。 矮 杆突变体Bndwf1和Bndwf1/dcll均由EMS诱变甘蓝型油菜纯系NJ7982获得， wang等(2016)经 遗传研究发现两个新主效位点BnDWF1和BnDWF/。

17、DCL1， 均由1对显性基因控制， Bndwf1/dcll 的株高在成熟期仅为40cm左右， Bndwf1的株高在成熟期仅为80cm左右。 0005 尽管学者们也对油菜矮秆性状遗传和育种， 作了一些积极的探索， 但矮杆/半矮杆 油菜育种还没有取得突破， 还需要继续开发控制油菜矮杆/半矮杆性状的新主效位点及其 分子标记， 为油菜矮化育种提供基础。 开发油菜矮杆/半矮杆新主效位点的紧密连锁分子标 说明书 1/6 页 4 CN 110607389 A 4 记， 可以在油菜苗期筛选矮化基因型， 提高选择效率， 还可以在分离世代提高选择的准确 性。 因此， 油菜株高的主效位点的紧密连锁的分子标记开发和应。

18、用是油菜矮化育种的关键 技术。 0006 本发明发现了一个控制甘蓝型油菜半矮杆性状的新主效位点， 并且发展了其紧密 连锁的分子标记技术。 发明内容 0007 本发明的目的是提供位于甘蓝型油菜A05染色体上控制油菜半矮杆性状的新位 点。 0008 本发明的另一目的是提供甘蓝型油菜半矮杆性状新基因位点的分子标记 BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478引物对。 0009 本发明的又一个目的是提供甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478或其引物对在检测所述的半矮杆油菜及选。

19、育半矮杆 油菜品种中的应用。 0010 本发明的目的可通过如下技术方案实现： 0011 一个控制油菜半矮杆位点BnUD1， 所述BnUD1位点位于甘蓝型油菜A05染色体上 BnaA05:11341200bp-11424391bp。 所述的紧密连锁标记BnA05SD405位于甘蓝型油菜A05染 色体上11371008bp-11371206bp； 所述的紧密连锁标记BnA05SD425位于甘蓝型油菜A05染色 体上11349493bp-11349757bp； 所述的紧密连锁标记BnA05SD473位于甘蓝型油菜A05染色体 上11361654bp-11361868bp； 所述的紧密连锁标记BnA0。

20、5SD478位于甘蓝型油菜A05染色体上 11419494bp-11419733bp。 所述的紧密连锁标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和 BnA05SD478分别如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 0012 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为Seq A05SD405-F、 Seq A05SD425-F、 Seq A05SD473-F和Seq。

21、 A05SD478-F， 下游引物序列分别为 Seq A05SD405-R、 Seq A05SD425-R、 Seq A05SD473-R和Seq A05SD478-R， 其中 0013 Seq A05SD405-F的序列如SEQ ID NO.5所示； 0014 Seq A05SD405-R的序列如SEQ ID NO.6所示； 0015 Seq A05SD425-F的序列如SEQ ID NO.7所示； 0016 Seq A05SD425-R的序列如SEQ ID NO.8所示； 0017 Seq A05SD473-F的序列如SEQ ID NO.9所示； 0018 Seq A05SD473-R的序。

22、列如SEQ ID NO.10所示； 0019 Seq A05SD478-F的序列如SEQ ID NO.11所示； 0020 Seq A05SD478-R的序列如SEQ ID NO.12所示。 0021 其序列为： 0022 Seq A05SD405-F： ATGAGCTGCGGTTGTGAA(5 -3 ) 0023 Seq A05SD405-R： CATTAGGCGGTCCTGAGAT(5 -3 ) 0024 Seq A05SD425-F： GGCAATCCTCCCACAAGA(5 -3 ) 0025 Seq A05SD425-R： CGCACAAAACTTTTCAACATT(5 -3 ) 说。

23、明书 2/6 页 5 CN 110607389 A 5 0026 Seq A05SD473-F： ACACCATTTATTATCTTTGCAC(5 -3 ) 0027 Seq A05SD473-R： GGAGGAGCCTGAGTCTTG(5 -3 ) 0028 Seq A05SD478-F： TTGAAAAGTCAACGGTTTG(5 -3 ) 0029 Seq A05SD478-R： TTTGGATTCGGTTAGCAT(5 -3 ) 0030 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 在含所述的甘。

24、蓝型油菜半矮杆性状位点的品种和种质检测中的 应用。 0031 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478在选育半矮杆油菜品种和种质中的应用。 0032 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478引物对， 这四个紧密连锁的分子标记的上游引物序列分别为Seq A05SD405-F、 Seq A05SD425-F、 Seq A05SD473-F和Seq A05SD478-F， 下游引物序列分别为 Seq A05SD405-。

25、R、 Seq A05SD425-R、 Seq A05SD473-R和Seq A05SD478-R。 0033 Seq A05SD405-F的序列如SEQ ID NO.5所示； 0034 Seq A05SD405-R的序列如SEQ ID NO.6所示； 0035 Seq A05SD425-F的序列如SEQ ID NO.7所示； 0036 Seq A05SD425-R的序列如SEQ ID NO.8所示； 0037 Seq A05SD473-F的序列如SEQ ID NO.9所示； 0038 Seq A05SD473-R的序列如SEQ ID NO.10所示； 0039 Seq A05SD478-F的序。

26、列如SEQ ID NO.11所示； 0040 Seq A05SD478-R的序列如SEQ ID NO.12所示。 0041 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478引物对， 在含所述的甘蓝型油菜半矮杆性状位点的品种和种质检 测中的应用。 0042 本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点的分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478引物对在选育半矮杆油菜品种和种质中的应用。 0043 一种利用本发明所述分子标记或引物对检测半矮杆甘蓝型油菜的方法， 利用本发 。

27、明所述的引物对扩增油菜基因组DNA， 扩增产物在40聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 检测是否获 得亲本NJAU5737的扩增片段。 如果获得亲本NJAU5737的扩增片段， 则表明存在本发明所述 的半矮杆油菜。 0044 一种利用本发明所述分子标记或引物对选育半矮杆甘蓝型油菜品种的方法， 优选 用所述BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478引物对扩增油菜基因组DNA， 扩 增产物在40聚丙烯酰胺凝胶电泳后， 检测是否获得NJAU5737的扩增片段。 如果获得 NJAU5737的扩增片段， 则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜半矮杆位点， 预测该油菜是半 矮。

28、杆油菜。 如果获得亲本ZS11的扩增片段， 则表明存在本发明所述的甘蓝型油菜高杆位点， 预测该油菜是高杆油菜。 0045 本发明甘蓝型油菜半矮杆基因连锁的分子标记是通过下列步骤筛选的： 0046 (1)遗传群体构建： 在自交多代的甘蓝型油菜品系中发现一株矮杆突变体 NJAU5737， 利用NJAU5737与常规优良品种中双11杂交， 得到杂种F1， F1与中双11回交多代， 得 说明书 3/6 页 6 CN 110607389 A 6 到BC5、 BC6， BC5连续自交分别得到BC5F2、 BC5F3， 对F1、 BC5、 BC6、 BC5F2和BC5F3进行表型调查； 0047 (2)甘蓝。

29、型油菜BC6、 BC5F2和BC5F3群体表型测定： 对上述BC6、 BC5F2和BC5F3群体中共 2193个单株进行表型观察以及农艺性状调查； 0048 (3)SNP芯片分析： 选择BC5群体中的8个半矮杆单株和回交亲本ZS11以及亲本 NJAU5737一起， 作SNP芯片分析， 分析回交得到的半矮杆与轮回亲本ZS11之间的遗传差异。 结果得到BnUD1位点的三个候选区段， 分别位于A05、 C02、 C07染色体上。 0049 (4)根据SNP分析得到的三个区段序列设计SSR引物， 利用BC6、 BC5F2群体， 将控制甘 蓝型油菜半矮杆性状的BnUD1位点定位于A05染色体上， 定位区。

30、间位于10139922- 13976417bp的区段内。 0050 (5)利用油菜A05染色体10139922-13976417bp的SSR信息， 设计分子标记， 采用 JoinMap4.0作图软件构建连锁图谱， 将BnUD1位点精细定位于11341200-11424391bp的区段 内； 0051 (6)根据BC5F3群体表型数据和分子标记数据， 发现紧密连锁共显性分子标记 BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 而且其遗传带型清晰可见。 0052 有益效果： 0053 本发明在国际上首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜A05染色体1134120。

31、0- 11424391bp区域内控制甘蓝型油菜半矮杆位点， 同时发现与半矮杆位点紧密连锁的共显性 分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478， 这些分子标记在BC5、 BC6、 BC5F2和BC5F3群体的表现使其在甘蓝型油菜半矮杆育种中具有非常重要的价值。 0054 1、 首次鉴定了一个位于甘蓝型油菜A05染色体11341200-11424391bp区域内控制 甘蓝型油菜半矮杆位点， 同时发现与半矮杆位点紧密连锁的共显性分子标记BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478； 0055 2、 。

32、在BC5、 BC6、 BC5F2和BC5F3群体中， 甘蓝型油菜半矮杆性状与这四个分子标记呈极 显著相关， BC5、 BC6、 BC5F2和BC5F3单株基因型和表型一致， 因此这四个分子标记在今后的半 矮杆油菜辅助选择育种中具有巨大的应用前景； 0056 3、 本发明能够在甘蓝型油菜中找到纯合半矮杆油菜， 对矮杆/半矮杆株型育种有 很大帮助。 附图说明 0057 图1： 半矮杆油菜表型图。 0058 图2： 分子标记BnA05SD405对BC5F3部分单株基因分型； 其中1为NJAU5737扩增带型， 2为ZS11扩增带型， 6、 9和12为高杆油菜扩增带型， 4为纯合半矮杆油菜扩增带型， 。

33、3、 5、 7、 8、 10和11为杂合半矮杆扩增带型。 0059 图3： 分子标记BnA05SD425对BC5F3部分单株基因分型； 其中1为ZS11扩增带型， 2为 NJAU5737扩增带型， 7、 8、 10、 11和12为高杆油菜扩增带型， 6和9为纯合半矮杆油菜扩增带 型， 3、 4和5为杂合半矮杆油菜扩增带型。 0060 图4： 分子标记BnA05SD473对BC5F3部分单株基因分型； 其中1为NJAU5737扩增带型， 2为ZS11扩增带型， 5和9为纯合半矮杆油菜扩增带型， 12为高杆油菜扩增带型， 3、 4、 6、 7、 8、 10和11为杂合半矮杆油菜扩增带型。 说明书 。

34、4/6 页 7 CN 110607389 A 7 0061 图5： 分子标记BnA05SD478对BC5F3部分单株基因分型； 其中1为ZS11扩增带型， 2为 NJAU5737扩增带型， 9为纯合半矮杆油菜扩增带型， 3、 5和12为高杆油菜扩增带型， 4、 6、 7、 8、 10和11为杂合半矮杆油菜扩增带型。 具体实施方式 0062 下面结合说明书附图对本发明创造作进一步说明。 0063 实施例1 0064 甘蓝型油菜半矮杆位点的获得： 0065 (1)遗传群体构建 0066 利用两个甘蓝型油菜材料 “NJAU5737” 与中双11进行杂交， 得到杂种F1， F1与ZS11回 交多代， 。

35、得到BC5、 BC6， BC5连续自交分别得到BC5F2、 BC5F3。 0067 (2)甘蓝型油菜BC6、 BC5F2和BC5F3群体表型测定： 对上述BC6、 BC5F2和BC5F3群体中共 2193个单株进行表型观察以及农艺性状调查； 半矮杆油菜表型图如图1所示。 0068 (3)SNP芯片分析： 选择BC5群体中的8个半矮杆单株和回交亲本ZS11以及亲本 NJAU5737一起， 作SNP芯片分析， 分析回交得到的半矮杆与轮回亲本ZS11之间的遗传差异。 结果得到BnUD1位点的三个候选区段， 分别位于A05、 C02、 C07染色体上。 0069 (4)根据SNP分析得到的三个区段序列。

36、设计SSR引物， 利用BC6、 BC5F2群体， 将控制甘 蓝型油菜半矮杆性状的BnUD1位点定位于A05染色体上， 定位区间位于10139922- 13976417bp的区段内。 0070 (5)利用油菜A05染色体10139922-13976417bp的SSR信息， 设计分子标记， 采用 JoinMap4.0作图软件构建连锁图谱， 将BnUD1位点精细定位于11341200-11424391bp的区段 内； 0071 实施例2 0072 甘蓝型油菜半矮杆位点紧密分子标记的获得： 0073 (1)分子标记开发 0074 本研究利用SNP和SSR标记将矮秆位点定位在油菜A05染色体的11341。

37、200- 11424391bp区段内， 下载油菜参考基因组序列， 利用SSR hunter 1.3软件查找SSR位点， 在 其上下游各增加150bp设计引物， 采用Primer Premier 5.0软件在BnaA05:11341200- 11424391bp区域内设计多个分子标记。 0075 (2)BC5F3群体分子标记鉴定 0076 采用CTAB法提取BC5F3群体油菜材料叶片的基因组DNA， PCR反应体系(10ul)， 其中 含有0.5ulDNA模板、 上、 下游引物(1mmol/L)各0.25ul、 5ulMix， 和4ulddH2O。 PCR反应程序： 95变性5min； 随后进行。

38、35个循环的95变性30s， Tm值退火30s， 72延伸30s； 再经72延 伸10min； 最后4保存。 PCR扩增产物用40聚丙烯酰胺凝胶电泳， 银染显色。 胶片在BIO- RAD visadoc3.0(Bio-RAD， USA)成像系统中扫描分析。 0077 (3)结果与分析 0078 在设计的多个分子标记中， BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478分 子标记与表型一致性达到99， 认为这四个分子标记与甘蓝型油菜半矮杆位点是紧密连 锁。 在BC5F2和BC5F3群体中这四个紧密连锁分子标记分别有三种带型， BnA05SD405条带大小。

39、 说明书 5/6 页 8 CN 110607389 A 8 分别为199bp， 181bp和同时拥有两条带， 拥有199bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.94 6.56cm)， 拥有181bp带型的单株是高杆油菜(168.7412.14cm)， 同时具有199bp与181bp 条带的为半矮杆杂合体(147.6811.84cm)； BnA05SD425条带大小分别为265bp， 247bp和同 时拥有两条带， 拥有247bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.946.56cm)， 拥有265bp带 型的单株是高杆油菜(168.7412.14cm)， 同时具有265bp与247bp条带的为半。

40、矮杆杂合体 (147.6811.84cm)； BnA05SD473条带大小分别为221bp， 215bp和同时拥有两条带， 拥有 215bp带型的单株是纯合半矮杆单株(121.946.56cm)， 拥有221bp带型的单株是高杆油菜 (168.7412.14cm)， 同时具有221bp与215bp条带的为半矮杆杂合体(147.6811.84cm)； BnA05SD478条带大小分别为264bp， 240bp和同时拥有两条带， 拥有240bp带型的单株是纯合 半矮杆单株(121.946.56cm)， 拥有264bp带型的单株是高杆油菜(168.7412.14cm)， 同 时具有264bp与240。

41、bp条带的为半矮杆杂合体(147.6811.84cm)。 这四个紧密连锁的分子 标记的上游引物序列分别为Seq A05SD405-F、 Seq A05SD425-F、 Seq A05SD473-F和Seq A05SD478-F， 下游引物序列分别为Seq A05SD405-R、 Seq A05SD425-R、 Seq A05SD473-R和 Seq A05SD478-R。 0079 实施例3 0080 紧密连锁分子标记在半矮杆油菜选择上的应用： 0081 (1)双亲本基因组扩增检测 0082 用于验证半矮杆油菜亲本分别为亲本 “NJAU5737” (BnA05SD405等位条带为181bp； 。

42、BnA05SD425等位条带为247bp； BnA05SD473等位条带为215bp； BnA05SD478等位条带为 240bp， 株高为121.946.56cm)， 亲本ZS11(BnA05SD405等位条带为199bp； BnA05SD425等位 条带为265bp； BnA05SD473等位条带为221bp； BnA05SD478等位条带为264bp， 株高为168.74 12.14cm)， 如图2-5所示。 0083 (2)群体扩增检测及标记分析 0084 用以上两个亲本进行杂交， 得到F1代种子种植后长成一个F1代单株， 其与ZS11进行 回交多代， 分别得BC5、 BC6家系群体，。

43、 BC5家系群体连续自交两代分别得到BC5F2和BC5F3家系 群体。 对BC6、 BC5F2和BC5F3家系群体单株进行农艺性状测定和表型调查。 0085 采用CTAB法分别提取每份BC6、 BC5F2和BC5F3单株叶片的基因组DNA。 PCR反应体系 (10ul)， 其中含有0.5ulDNA模板、 上、 下游引物(1mmol/L)各0.25ul、 5ulMix， 和4ulddH2O。 PCR反应程序： 95变性5min； 随后进行35个循环的95变性30s， Tm值退火30s， 72延伸 30s； 再经72延伸10min； 最后4保存。 PCR扩增产物用40聚丙烯酰胺凝胶电泳， 银染显 。

44、色。 胶片在BIO-RAD visadoc3.0(Bio-RAD， USA)成像系统中扫描分析。 分析BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478在亲本NJAU5737和ZS11的条带类型。 0086 (3)结果与分析 0087 在NJAU5737和ZS11的杂交组合后代BC6、 BC5F2和BC5F3因型的检测中， 发现 BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478分子标记与表型一致性达到99。 结果 表明了用BnA05SD405、 BnA05SD425、 BnA05SD473和BnA05SD478分。

45、子标记预测油菜高矮杆有 较好的预测效果。 说明书 6/6 页 9 CN 110607389 A 9 序列表 南京农业大学 甘蓝型油菜半矮杆性状位点的分子标记及其应用 12 SIPOSequenceListing 1.0 1 308 DNA 甘蓝型油菜(Brassica napus) 1 ggtgatgagc tgcggttgtg aacttcaagc aatgtgatga actccaagag gttggtcata 60 ctctcttgtt atagaagtta tagatattag aatatgtctt ccattctatt ttaatttggt 120 atcttgtgtt ctagct。

46、tttt ttcatattgc atatatatac tccatcctat cgacgactat 180 tgacatctca ggaccgccta atgcatatgt aagcccaagt tcactaatac ataccgaaga 240 ataaagacaa ctaacttggg cccaatttca aatatgcaca aaggtccacc taaatagttg 300 agggtatg 308 2 309 DNA 甘蓝型油菜(Brassica napus) 2 gtcaattgta tatactttgt aaagtcacca tgagggcaat cctcccacaa gagag。

47、catat 60 atgatcgttg atttgaatat gccatatact acccttcata tcaagtcgag aaccatcgaa 120 cttaaaatga ttttggcaat cttacaaatt atcatcatct ttgctctaat accgttttta 180 gtttttaaga aaattaagct catgtccaac tatatctttt tttttgtcaa catgtccaac 240 tatatctatt agtgtaaaat aattatcaga ttttatagaa tgttgaaaag ttttgtgcgt 300 aactttagt 3。

48、09 3 309 DNA 甘蓝型油菜(Brassica napus) 3 tactagacac actttttagt tgcaaaaaga cttcattatc cttgtactac accatttatt 60 atctttgcac tacaccatct ctagtttctt ctaaaccaaa ttaaagaaaa aaagtaaatg 120 aaaaagtaaa tagaaaagca taacaattta tcttcttctt tgtttctcga tttcagattc 180 cagattgagt aaatgtttta aaaaaccaaa ttagatgaga aatccaccca。

49、 tcttttgtct 240 ttcaccaaga ctcaggctcc tcctccatca taggacacgt ctctcaccga aaataattat 300 cgtggtttt 309 序列表 1/3 页 10 CN 110607389 A 10 4 309 DNA 甘蓝型油菜(Brassica napus) 4 gaataggtta tcactatgtg tacgtgtttt gaaaagtcaa cggtttgtat tcatttcaac 60 tccataatac agcaaaaggt aaagttgtcg aaaaataaca ctcggataca tgcgtttaag 。

50、120 ttcggtagga atgcactagt ttgcgttgta gttgttgttg gtcacaatta tgggtaatta 180 ggtgttgttt gcacaaaaaa aaggtgttgc gctcgtttta atatcaaaca ttttataatt 240 caataagcat atgctaaccg aatccaaata aaaatatata aaaagagaaa acgtcctctc 300 gtttacaag 309 5 18 DNA 甘蓝型油菜(Brassica napus) 5 atgagctgcg gttgtgaa 18 6 19 DNA 甘蓝型油菜(B。