胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法.pdf



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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310300727.0(22)申请日 2023.03.24(71)申请人 青岛农业大学地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路700号青岛农业大学机电学院(72)发明人 李华涛侯明晓张忠顺丰艳妮付开强刘锡武高磊曹荣峰朱士勇姜忠玲(74)专利代理机构 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 37256专利代理师 段晓菲(51)Int.Cl.C12N 5/073(2010.01)(54)发明名称胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法(57)摘要本发明公开了一。
2、种胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法,属于畜牧业技术领域。其技术方案包括一种胚胎培养液,以用于胚胎培养的培养液为基质,还包括胡桃醌,所述胡桃醌的浓度为2.57.5M。本发明应用于畜牧业养殖方面,解决温度升高时,使用传统培养液培养的胚胎,其发育率以及囊胚孵化率均会随温度升高而降低的技术问题,具有可以大幅度提高胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵化率的特点,解决传统培养液培养的胚胎耐受热应激能力低下的问题。权利要求书2页 说明书9页 附图1页CN 116496981 A2023.07.28CN 116496981 A1.一种胚胎培养液,以用于胚胎培养的培养液为。
3、基质,其特征在于,还包括胡桃醌,所述胡桃醌的浓度为2.57.5 M。2.根据权利要求1所述的胚胎培养液,其特征在于,当胚胎为牛胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为SOF培养液;所述胚胎为小鼠胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为KSOM培养液;所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得;所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取获得。3.一种权利要求1或2所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。4.根据权利要求3所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用,其特征在于,利用包含胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎培养58h,从而影响表观遗传中的H3K27ac调控,进而。
4、诱导胚胎获得耐热能力。5.一种建立胚胎培养程序的方法,其特征在于,以权利要求1或2所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括的胚胎培养液配置步骤、模型建立步骤、培养程序建立步骤以及验证步骤。6.根据权利要求5所述的建立胚胎培养程序的方法,其特征在于,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液,以及包含梯度浓度胡桃醌的多胡桃醌浓度的胚胎培养液;所述模型建立步骤包括:将若干胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的若干胚胎各转入多胡桃醌浓度的胚胎培养液中进行培养,且设置置于相同胡桃醌浓度的胚胎培养液中的胚胎的培养时间不同;然后将胚胎转入不包含所述胡。
5、桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期给予胚胎热刺激后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况;所述培养程序建立步骤包括:依据所述模型建立步骤获得的不同条件下胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况,确定能够使胚胎获得耐热能力的培养液中胡桃醌的浓度及培养时间,从而建立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序;所述验证步骤包括:收集桑椹胚时期的胚胎进行H3K27ac蛋白检测,确定胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响。7.根据权利要求6所述的建立胚胎培养程序的方法,其特征在于,当胚胎为牛胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置SOF培养液和在SOF培养液中添加。
6、2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中做60 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于38.5含有5CO2饱和湿度的培养箱平衡2h以上;所述模型建立步骤包括:将体外受精获得的早期牛胚胎移入SOF培养液中,震荡,去除颗粒细胞,再用SOF培养液充分洗涤之后进行培养,在38.5含5CO2的CO2培养箱中培养,转入SOF培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入SOF培养液中培养至桑椹胚时期,每24h换液一次,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚。
7、孵化的情况。8.根据权利要求6所述的建立胚胎培养程序的方法,其特征在于,当胚胎为小鼠胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置KSOM培养液和在KSOM培养液中添加2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中做40 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于37含有权利要求书1/2 页2CN 116496981 A25CO2饱和湿度的培养箱平衡4h以上;所述模型建立步骤包括:获取小鼠胚胎,在37含5CO2的CO2培养箱中培养,然后转入KSOM培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入KSOM培养液中培养至桑椹胚时期,每24。
8、h换液一次,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况。9.一种胚胎培养方法,其特征在于,以权利要求1或2所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括:将胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的胚胎各转入胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液中培养58h;然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期进行42热刺激12h后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。10.根据权利要求9所述的胚胎培养方法,其特征在于,当胚胎为牛胚胎时,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之。
9、后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;当胚胎为小鼠胚胎时,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。权利要求书2/2 页3CN 116496981 A3胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法技术领域0001本发明属于畜牧业技术领域,尤其涉及胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法。背景技术0002夏季湿热天气容易使动物产生强烈的热应激反应,造成其生理状态改变,进一步影响其生产性能,尤其是繁殖性能。动物遭受热应激时,受精卵着床率低,因而导致受胎率低流产率高,严重影响畜牧业生产效率。
10、。因此,在奶牛育种过程中,热应激抗性成为需要关注的新性状之一。由于产奶量的增加导致代谢产热增加以及全球气候的预期变暖,热应激对动物的影响日益严重。然而,牛良种扩繁和群体改良周期很长,其技术有待于进一步优化和改良。对于公牛来说,性控精液、冻精两项技术最大可能的利用了良种公牛的繁殖潜能。但由于母牛的繁殖周期限制,良种母牛的生产效率低,对其繁殖潜能利用率不高。在这种情况下,活体采卵技术、体外胚胎生产和胚胎移植技术的联合应用可以有效利用母牛的繁殖潜能。因此胚胎的体外培养过程就成为良种选育的关键节点。附植前胚胎可以随着自身生长发育或者环境诱导获得一定的耐热能力附植前胚胎可能本身具有一定的耐热能力,也随着。
11、自身的生长发育这种能力得以提高或者体外环境的诱导也可使其获得一定的耐热能力。如果建立一种能够诱导附植前胚胎获得耐热能力的特殊培养程序则可以大大节省选育耐热品种的时间,提高培育的效率,并且可以为生产中预防因热应激造成的早期胚胎死亡提供思路。0003目前早期胚胎发育过程中可经药物作用使得胚胎获得抗应激能力,提高胚胎质量和在热应激条件下的胚胎发育率。如褪黑素,白藜芦醇等抗氧化剂可以显著提高囊胚细胞数,降低细胞凋亡率,提高胚胎质量。小檗碱、黄芩苷、黄芪多糖等中药单体对体外胚胎生长发育和细胞增殖有促进作用。其次,环境条件的改变也可诱导早期胚胎获得耐热能力,且具有一定的剂量依赖性。强烈热应激对早期胚胎有损。
12、伤作用,但是温和热应激对囊胚发育率孵化率没有显著影响。0004对小鼠着床前胚胎的研究开始于20世纪50年代,培养微滴的制作方法如今仍被广泛应用。随着培养液配方的不断改进,在适宜的培养条件下,胚胎可以有较高的囊胚率和孵化率;但在热应激条件下,随着温度的升高胚胎的发育率显著降低。因为当温度升高时,胚胎自身会产生一系列反应影响其正常发育;另外,当环境温度升高时,胚胎代谢加快、对营养物质的消耗量增加,因此普通的培养液并不能满足高温环境下胚胎的生长发育。胚胎正常的培养温度为:牛胚胎3839、小鼠胚胎37。在正常培养温度下牛胚胎发育至囊胚的百分率是16.885.41,孵出率是4.323.48;小鼠胚胎发育。
13、至囊胚的百分率是83.552.53,孵出率是58.151.74。目前,提高小鼠胚胎耐热性的培养液有TCZB,其优点是可以提高小鼠早期胚胎在41热应激条件下的发育率,用TCZB培养的胚胎,其囊胚发育率及孵出率(81.34.5和76.57.6)显著高于CZB组(80.25.4和73.46.2),提高小鼠胚胎的热说明书1/9 页4CN 116496981 A4耐受性;但是TCZB并不能提高39培养小鼠胚胎发育至囊胚率及囊胚孵出率。此外,TCZB培养液需要利用原核表达法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体TatHsp70,此法技术要求高,操作复杂,且不易成功。发明内容0005针对现有技术存在的不。
14、足之处,本发明所要解决的技术问题是克服当温度升高时,使用传统的培养液培养胚胎,其发育率以及囊胚孵化率均会随温度升高而降低的技术问题,提出一种可以大幅度提高胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵化率的胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法。0006为解决所述技术问题,本发明采用的技术方案为:0007本发明一方面公开一种胚胎培养液,以用于胚胎培养的培养液为基质,还包括胡桃醌,所述胡桃醌的浓度为2.57.5 M。0008优选的,当胚胎为牛胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为SOF培养液;所述胚胎为小鼠胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为KSOM培养液;所述牛胚胎由奶牛卵母。
15、细胞体外成熟培养、体外受精获得;所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取获得。0009本发明还提供一种上述任一技术方案所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。0010优选的,利用包含胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎培养58h,从而影响表观遗传中的H3K27ac调控,进而诱导胚胎获得耐热能力。0011本发明另一方面公开了一种建立胚胎培养程序的方法,以上述任一技术方案所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括的胚胎培养液配置步骤、模型建立步骤、培养程序建立步骤以及验证步骤。0012优选的,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液,以及包含梯度浓度胡。
16、桃醌的多胡桃醌浓度的胚胎培养液;0013所述模型建立步骤包括:将若干胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的若干胚胎各转入多胡桃醌浓度的胚胎培养液中进行培养,且设置置于相同胡桃醌浓度的胚胎培养液中的胚胎的培养时间不同;然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期给予胚胎热刺激后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况;0014所述培养程序建立步骤包括:依据所述模型建立步骤获得的不同条件下胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况,确定能够使胚胎获得耐热能力的培养液中胡桃醌的浓度及培养时间,从而建。
17、立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序;0015所述验证步骤包括:收集桑椹胚时期的胚胎进行H3K27ac蛋白检测,确定胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响。0016优选的,当胚胎为牛胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置SOF培养液和在SOF培养液中添加2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中做60 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于38.5含有5CO2饱和湿度的培养箱平衡2h以上;0017所述模型建立步骤包括:将体外受精获得的早期牛胚胎移入SOF培养液中,震荡,去除颗粒细胞,再用SOF培养液充分洗涤之后进行培养,在38.5含5CO2的CO2培养箱中培说明书2/9 页5CN 116。
18、496981 A5养,转入SOF培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入SOF培养液中培养至桑椹胚时期,每24h换液一次,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况。0018优选的,当胚胎为小鼠胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置KSOM培养液和在KSOM培养液中添加2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中做40 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于37含有5CO2饱和湿度的培养箱平衡4h以上;0019所述模型建立步骤包括:获。
19、取小鼠胚胎,在37含5CO2的CO2培养箱中培养,然后转入KSOM培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入KSOM培养液中培养至桑椹胚时期,每24h换液一次,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况。0020本发明还提供一种胚胎培养方法,以上述任一技术方案所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括:0021将胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的胚胎各转入胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液中培养58h;然后。
20、将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期进行42热刺激12h后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。0022优选的,当胚胎为牛胚胎时,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;当胚胎为小鼠胚胎时,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。0023与现有技术相比,本发明的有益效果在于:0024本发明提供一种胚胎培养液,将其用于小鼠胚胎或者牛胚胎体外培养时,可以大幅度提高胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵出率,同时具有经济成本低、配制方法简单方便的特点。附图说明0025图1为胡桃醌对小鼠桑椹胚组蛋白乙酰。
21、化的影响示意图;0026其中,C:空白对照组;CJ:胡桃醌组;H:42热应激组;HJ:胡桃醌+42热应激组;A和A+:小鼠桑椹胚H3K27ac免疫荧光结果及荧光强度分析。*:与对照组比较,P0.01;*:与对照组比较,P0.05。具体实施方式0027下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行详细、完整的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明总的技术方案的部分具体实施方式,而非全部的实施方式。基于本发明的总的构思,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都落于本发明保护的范围。0028本发明一方面公开一种胚胎培养液,以用于胚胎培养的培养液为基质,还包括胡桃醌,所述胡桃醌的浓度为2.57.5 M。。
22、胡桃醌(Juglone)是从胡桃科植物胡桃及其同属植物黑核桃的未成熟的外果皮(青皮)中的提取分离出来的一种萘醌类化合物,具有多种药理说明书3/9 页6CN 116496981 A6活性(如抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、止血、治疗湿疹牛皮癣等作用)。并且,由于其可以影响机体活性氧的正常代谢,引起活性氧含量积累而常被用做氧化剂来诱导细胞和秀丽隐杆线虫等的氧化应激。中国专利CN113416128A、CN111557965A、CN110229054A、CN107311850A等均公开了胡桃醌的提取、纯化方法;中国专利CN113368087A、CN107913302A、CN106614763A、CN107。
23、303289A、CN104288134A等公开了胡桃醌用作药物的用途;中国专利CN102824335A公开了胡桃醌用于调节小鼠的免疫状态及氧化反应的用途,该过程中,胡桃醌作为抗氧化剂来提高正常小鼠的体液免疫。然而,到目前为止,尚未见有关胡桃醌用于家畜繁殖技术领域,特别是用于提高胚胎体外培养耐热性的报道。本发明中所用胡桃醌购自美国APExBIO,纯度为98.81。关于包含胡桃醌的胚胎培养液的组成,具体的,每100mL组成如下:0.087mg胡桃醌,常规培养液补足至100mL。本实施例具体限定了胡桃醌的浓度,可以理解的是,该浓度还可以为3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6。
24、 M、6.5 M、7 M及其范围内的任意点值。0029在一优选实施例中,当胚胎为牛胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为SOF(人工合成输卵管液)培养液;所述胚胎为小鼠胚胎时,所述用于胚胎培养的培养液为KSOM培养液;所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得;所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取获得。0030本发明还提供一种上述任一技术方案所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用,具体的,所述的胚胎培养液在提高胚胎体外培养耐热性方面的应用,利用包含胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎培养58h,从而影响表观遗传中的H3K27ac调控,进而诱导胚胎获得耐热能力。
25、。需要说明的是,发育晚期胚胎(桑椹胚或囊胚)比早期胚胎(18细胞期胚胎)具有更能强的耐热能力,且这种耐热能力可被温和热刺激加强,使胚胎获得更强的耐热能力。由此推测使用低浓度氧化剂刺激也可使胚胎获得一定的耐热能力,而这种对热的记忆性可能是与表观遗传信息的改变有关。在果蝇和哺乳动物中的研究表明,细胞通过重新编程它们的转录组来响应温度应激,涉及数百个先前活性基因的沉默和许多先前沉默的基因的激活。而组蛋白修饰是调控基因转录活性的主要表观遗传机制之一,尤其在胚胎基因组激活过程中展现着重要的作用,其中H3K27ac与转录活跃基因密切相关,并有研究证实其具有对抗多梳基因沉默的重要作用。在分析热应激对全球人类。
26、胚胎干细胞转录的影响中H3K27ac的水平在对照细胞和热休克细胞之间至少改变了3倍。由此猜测诱导胚胎获得耐热能力可能是由表观遗传中的H3K27ac调控。本实施例具体限定胡桃醌在胚胎培养液中的浓度以及利用包含胡桃醌的胚胎培养液对胚胎进行培养的培养时间,原因在于,生命早期的轻度刺激或许会对机体的基因表达产生持久的影响,增强其耐热能力,而低浓度的胡桃醌可以产生刺激作用且具有自由基清除活性;另外,本技术方案选择利用包含胡桃醌的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎进行培养,而不是对处于八细胞时期的任意时段的胚胎进行培养,原因在于,24细胞期胚胎较为脆弱,对外界刺激十分敏感,胚胎发育过程中细胞数的增多会使其。
27、逐渐提高对热应激的承受能力,尤其是在桑椹胚囊胚期开始产生一系列反应抵抗热应激的损伤,并且在八细胞时期才开始产生大量HSP70。可以理解的是,胡桃醌的浓度还可以为3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M、6 M、6.5 M、7 M及其范围内的任意点值;培养时间还可以是6h、7h及其范围内的任意点值。0031本发明另一方面公开了一种建立胚胎培养程序的方法,以上述任一技术方案所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括的胚胎培养液配置步骤、模型建立步骤、培养程序建立说明书4/9 页7CN 116496981 A7步骤以及验证步骤。具体的,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置不包含所述胡桃醌的常。
28、规胚胎培养液,以及包含梯度浓度胡桃醌的多胡桃醌浓度的胚胎培养液;所述模型建立步骤包括:将若干胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的若干胚胎各转入多胡桃醌浓度的胚胎培养液中进行培养,且设置置于相同胡桃醌浓度的胚胎培养液中的胚胎的培养时间不同;然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期给予胚胎热刺激后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况;所述培养程序建立步骤包括:依据所述模型建立步骤获得的不同条件下胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况,确定能够使胚胎获得耐热能力的培养液中胡桃醌的浓度及。
29、培养时间,从而建立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序;所述验证步骤包括:收集桑椹胚时期的胚胎进行H3K27ac蛋白检测,确定胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响。上述技术方案中,基于模型建立步骤获取的胚胎发育情况,确定获得耐热能力培养液选用的胡桃醌浓度及作用时间从而确定诱导流程,建立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序。然后,收集小鼠桑椹胚时期胚胎进行H3K27ac蛋白检测,与对照组对比看胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响,进而验证该方法的有效性。0032其中,当胚胎为牛胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置SOF培养液和在SOF培养液中添加2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中。
30、做60 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于38.5含有5CO2饱和湿度的培养箱平衡2h以上;所述模型建立步骤包括:将体外受精获得的早期牛胚胎移入SOF培养液中,震荡,去除颗粒细胞,再用SOF培养液充分洗涤之后进行培养,在38.5含5CO2的CO2培养箱中培养,转入SOF培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入SOF培养液中培养至桑椹胚时期,每24h换液一次,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况。需要说明的是,无论是小鼠胚胎还是牛胚胎在桑。
31、椹胚时期进行42热刺激12h是验证条件,看胡桃醌诱导完毕后胚胎是否能抵抗42热刺激。0033当胚胎为小鼠胚胎时,所述胚胎培养液配置步骤包括:配置KSOM培养液和在KSOM培养液中添加2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液,在培养皿中做40 L/滴的培养微滴,覆盖矿物油后置于37含有5CO2饱和湿度的培养箱平衡4h以上;所述模型建立步骤包括:获取小鼠胚胎,在37含5CO2的CO2培养箱中培养,然后转入KSOM培养液中发育至八细胞时期,于八细胞时期在含2.5/5/10 M胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h,然后将胚胎转入KSOM培养液中培养至桑椹胚时期,每24h换液一次,在桑椹胚时期进行42。
32、热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期,记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况。0034本发明还提供一种胚胎培养方法,以上述任一技术方案所述的胚胎培养液作为胚胎培养液,包括:将胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期;将处于八细胞时期的胚胎各转入胡桃醌浓度为2.57.5 M的胚胎培养液中培养58h;然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期,并在桑椹胚时期进行42热刺激12h后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。其中,当胚胎为牛胚胎时,在桑椹胚时期进行42热刺激12h,之后在38.5下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期;当胚胎为小鼠胚胎时,在桑椹胚。
33、时期进行42热刺激12h,之后在37下培养直到胚胎发育至囊胚孵化期。说明书5/9 页8CN 116496981 A80035为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法,下面将结合具体实施例进行描述。0036实施例10037(1)制备含胡桃醌的小鼠胚胎体外培养液0038首先制备常规KSOM培养液,各种成分的浓储液。A、B液制备需要先称量盐(除乳酸钠外)加入到含三蒸水的烧杯中,每加入一种成分后都用磁力搅拌器搅动、摇匀,直至完全溶解,再加入下一种物质。每加完一种成分后立即将烧杯口盖严,以减少液体与空气接触时间,避免使配制溶液。
34、的PH值升高。最后洗涤几次,倒入100mL容量瓶内,然后在10ml烧杯内称量乳酸钠,倒入容量瓶,洗涤几次,倒入容量瓶,最后定容到100mL。最后用微孔过滤器过滤所有浓储液,分装。存放至80冰箱。0039配置G液加BSA时,将BSA放在培养液表面,使其缓慢、逐渐混合,避免摇晃培养液,防止产生气泡,使蛋白质变性。待BSA完全溶解后定容。配置好的C、D、F、G液存放至20冰箱备用。0040配置好A、B、C、D、F、G浓储液后,取50mL离心管,继续按照表1储液体积配置培养液。最后加入0.5mL必需氨基酸和0.25mL非必需氨基酸后定容。用微孔过滤器过滤后分装培养液,存放至80冰箱备用。0041准确称。
35、取胡桃醌5mg,先用2.87mL DMSO溶解制成浓度为10mM的溶液,再取1 L用常规KSOM培养液2mL溶解成浓度为5 M的培养液,分装后在4下保存备用,长时间不用需保存在20条件下,一般现用现配。0042(2)培养微滴的制作:于培养前4h,在40mm培养皿中,用上述含胡桃醌和普通的KSOM培养液做成40 L的培养微滴,覆盖矿物油后置37含5CO2的CO2培养箱中平衡。0043(3)小鼠胚胎获取:将67周龄昆明系小鼠用人工注射激素方法使小鼠超数排卵,首先腹腔注射PMSG(10IU/只),48h后注射相同剂量的hCG再合笼,第二天早上检查阴栓。见栓小鼠第三天早上使用脱颈法处死,用眼科剪和眼科。
36、镊迅速剖开小鼠腹腔,找到其子宫及卵巢,剔除周围的系膜与脂肪。获取小鼠输卵管壶腹部2cell期胚胎,放入普通KSOM培养液中,每个培养滴放置约25枚胚胎。在37含5CO2的CO2培养箱中培养。8cell时期将胚胎换至含2.5/5/10 M胡桃醌的培养液中,经过5/8h再换至普通培养液中。桑椹胚时期进行42热应激1h.。将注射hCG设定为第0h,在第48h胚胎发育至24细胞期,第76h发育至816细胞期,第88h发育至桑椹胚,第112h发育至囊胚期的胚胎,并记录发育数据。0044表1小鼠胚胎常规KSOM培养液组成成分说明书6/9 页9CN 116496981 A9004500460047表2添加胡。
37、桃醌对体外培养小鼠附植前胚胎发育的影响添加胡桃醌对体外培养小鼠附植前胚胎发育的影响结果见表2及图1。00480049结果显示,与常规KSOM培养液相比,在42热应激条件下,用本发明设计的培养程序培养的胚胎桑椹胚、囊胚和孵化囊胚发育率分别为96.6、89.8、81.0。该新发明的使用特殊培养液的培养程序相比使用常规胚胎培养液和常规培养程序,其体外胚胎的桑葚说明书7/9 页10CN 116496981 A10胚、囊胚和孵化囊胚都有显著地提高,且在42热应激条件下,添加胡桃醌可以提升小鼠桑椹胚H3K27ac程度。0050实施例20051(1)制备含胡桃醌的牛胚胎体外培养液:准确称取胡桃醌5mg,先用。
38、2.87mL DMSO溶解制成浓度为10mM的溶液,再取1 L用常规SOF培养液2mL溶解成浓度为5 M的培养液,用微孔过滤器过滤除菌,在4下储存,备用。0052(2)培养微滴的制作:于培养前2h,根据受精卵数量的多少,在60mm培养皿中,用上述含胡桃醌的胚胎体外培养液做成60 L的培养微滴,覆盖矿物油后置38.5含5CO2的CO2培养箱中平衡。0053(3)奶牛卵母细胞的培养及体外受精0054所述牛卵母细胞体外培养方法如下:从屠宰场获取奶牛卵巢,用手术刀刺破卵巢的卵泡,以此获取奶牛卵母细胞,用成熟培养液在38.5、5CO2的环境内培养18h,获得成熟的牛卵母细胞。所述成熟培养液以常规培养液为。
39、基质,所述基质中还含有100IU/mL的青链霉素及体积百分含量15的血清,所述常规培养液为DMEM。牛卵母细胞体外受精方法如下:将牛卵母细胞培养成熟后,与精子一同放入受精培养液中,在38.5含5CO2的CO2培养箱中培养18h,使精卵结合(受精),以此获得牛早期胚胎。所述受精培养液为含10mg/mL肝素的BO液。0055(4)奶牛胚胎培养0056受精结束后,将受精卵移入含有200 L培养液的1.5mL离心管中,震荡40s,以去除颗粒细胞,受精卵用胚胎培养液充分洗涤3次后进行培养,将受精卵移入已平衡2h以上,且覆盖矿物油的60 L胚胎培养微滴中进行培养,每个微滴中移入25枚胚胎,将培养皿置于38。
40、.5含5CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养,每隔48h半量更换培养液。8cell时期将胚胎换至含2.5/5/10 M胡桃醌的培养液中,经过5/8/12h再换至普通培养液中。桑椹胚时期进行42热应激1h。受精后48h统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞,继续培养至8d,定期观察早期胚胎发育情况、囊胚率和孵化囊胚率。0057(5)结果0058与常规培养程序相比,在42热应激条件下,用本发明培养液培养的胚胎桑椹胚、囊胚和孵化囊胚发育率分别为67.5、21.3、7.5。该新发明的培养液与培养程序相比常规胚胎培养液和培养程序,其体外胚胎的桑葚胚、囊胚和孵化囊胚率都有显著地提高。0059对比例10060同实施例1,不同之处在于,包含胡桃醌的胚胎培养液在桑椹胚对胚胎进行培养,胚胎发育结果结果如表3。0061表3对比例1添加胡桃醌对体外培养小鼠附植前胚胎发育的影响说明书8/9 页11CN 116496981 A110062说明书9/9 页12CN 116496981 A12图1说明书附图1/1 页13CN 116496981 A13。
- 内容关键字: 胚胎 培养液 提高 耐热性 方面 应用 建立 培养 程序 方法
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