对样本中囊泡提取效率质控的方法.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310463892.8(22)申请日 2023.04.26(71)申请人 谱天（天津）生物科技有限公司地址 300308 天津市滨海新区空港经济区西七道26号(72)发明人 陈亮宇马聪聪乔舰赵娜李捷(74)专利代理机构 南京中律知识产权代理事务所(普通合伙)32341专利代理师 郑立发(51)Int.Cl.G01N 27/62(2021.01)G01N 33/68(2006.01)(54)发明名称一种对样本中囊泡提取效率质控的方法(57)摘要本发明公开了一种对样本中囊泡提取效率质控的方法，包。

2、括向待测样本中加入包裹着标准品物质的脂质体标品，对样本进行提取及检测，对标准品物质含量进行分析，评估样本提取过程中囊泡组分的提取效率。本发明方法简单可靠，能有效评估囊泡的纯化效率，提升囊泡蛋白质组学的稳定性。权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 116500119 A2023.07.28CN 116500119 A1.一种对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备包裹着蛋白或肽段化合物标准物质的脂质体标准品；2)取两份等量的样品，一份作为目标样品，一份作为对照样品，目标样品中加入脂质体标准品，对照样品中加入与脂质体标准品等量的稀释液，两份样品同时进行囊泡的提取；3)。

3、取步骤2)处理后的样品，对照样品中加入脂质体标准品，加入量与步骤2)中目标样品中的加入量相同，目标样品中加入等量的稀释液，两份样品同时进行蛋白质组检测前处理；4)对步骤3)处理后的样品进行检测，并分析其中蛋白或肽段化合物标准物质的含量，目标样品中的含量与对照样品中的含量之比即为囊泡结构提取效率。2.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤1)中，所述脂质体标准品中的脂质选自阴离子脂质或中性脂质；所述蛋白或肽段化合物标准物质选自目标样品不具有的物质。3.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤1)中，所述脂质体标准品的粒径范围为10nm10。

4、 m，其尺寸基于目的脂质体组学类型，如外泌体：30150nm之间，血小板：18 m之间。4.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤1)中，所述脂质体标准品的制备方法包括注入法、薄膜分散法、超声波分散法或高压乳匀法。5.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤2)中，所述样品选自包含囊泡结构的体液样本、组织或细胞裂解液、细胞培养液、微生物细胞裂解液或微生物培养液；所述稀释液选自磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris缓冲液或生理盐水，或者选自水。6.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤2)中，所述囊泡的。

5、提取包括吸附囊泡、清洗除杂步骤。7.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤3)中，所述蛋白质组检测前处理，若其中蛋白质组检测采用高效液相质谱检测，则所述前处理包括还原烷基化、蛋白纯化、酶解、除盐、肽段纯化步骤；若其中蛋白质组检测采用蛋白定性定量实验，则不进行所述前处理，或者简单处理。8.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤3)中，所述稀释液选自磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris缓冲液或生理盐水，或者选自水。9.根据权利要求1所述的对样本中囊泡提取效率质控的方法，其特征在于，步骤4)中，所述对步骤3)处理后的样品进行检测，采。

6、用基于液相质谱的靶向方法或者非靶向方法。权利要求书1/1 页2CN 116500119 A2一种对样本中囊泡提取效率质控的方法技术领域0001本发明属于囊泡蛋白质组学技术领域，具体地，涉及一种对样本中囊泡提取效率质控的方法。背景技术00021、脂质体的构成0003某些两亲性分子，如许多天然的、合成的表面活性剂，分散于水中时会自发形成一类具有封闭双层结构的分子有序组合体，也称为囊泡，也称为脂质体(liposome)。囊泡是一种或多种脂质构成的球状双层。脂质的类型、数目、比率可不同，可以从天然或人工合成而来。脂质的至少一种(或一些)是两亲脂质，定义为具有亲水部分和疏水部分(通常为亲水头部和疏水尾部。

7、)。疏水部分通常长袖疏水相(双层内)，亲水部分通常朝向水相(双层外，可能在邻居并列的双层表面之间)。亲水部分可包含极性或带电基团，如碳水化合物、磷酸、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基、以及其他类似基团。疏水部分可包含非极性基团，包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基和一种或多种芳香族基团、脂环族基团或脂环基团取代的基团。两亲化合物的例子包括但不限于磷脂、氨脂、鞘脂、磷酸乙醇氨脂。0004通常，脂质通常是指磷脂，脂质也可以是阴离子脂质和中性(包括两性离子和极性)脂质，包括阴离子磷脂和中性磷脂。在选定pH下，中性脂质以不带电或中性两性离子的形式存在。在生理pH下，这样的脂质包括例如，二油酰磷脂。

8、酰甘油(DOPG)、二酰磷脂胆碱、二酰磷脂酰乙醇胺、神经酰胺鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑脂和二酰甘油。两性脂质的例子包括但不限于二油酰磷脂疏胆碱(DOP)、二肉豆磷脂酰胆碱(DMPC)和二油磷脂酰丝氨酸(DOPS)。阴离子脂质是在生理pH下带负电的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰磷脂酰丝氨酸、二酰磷脂酸、N十二疏磷脂疏乙醇胺、N琥珀疏磷脂酰乙醇胺、N戊二磷脂疏乙醇胺、赖氨疏磷脂酰甘油、棕榈油疏磷脂酰甘油(POPG)以及与中性脂质结合的其它阴离子修饰基团。0005阴离子脂质和中性脂质在本文中共同称为非阳离子脂质。这样的脂质可以包含磷但它们并不限于此。非阳离子脂质的例子包括卵磷脂、。

9、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂乙醇胺(DOPE)、二棕桐酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂疏磷脂酰乙醇胺(DSPE)桐酰油磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕桐酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油疏磷脂酰胆碱(DOPC)二棕桐酰磷胎酰胆碱(DPPC)、二油磷脂酰甘油(DOPG)、二棕桐酰磷脂酰甘油(DPPG)棕桐油酰磷脂酰甘油(POPG)160单甲基PE、160二甲基PE181反式PE、棕桐疏油疏磷脂酰乙醇胺(POPE)、1硬胎2油磷脂乙醇胺(SOPE)、磷脂丝氨酸、磷脂疏肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、。

10、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡和胆固醇。另一些不含磷的脂质包括硬脂胺、十二胺、十六胺、棕构酸乙酰酰、蓖麻醇酸甘油醋、硬脂酸十六醋、肉豆楚酸异丙酰、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺十二烷基硫酸酰、烷基芳基硫酸聚乙氧基化的脂肪酰胺、双十八基二甲基澳化钱等、二基磷脂疏胆碱、二酰基磷脂疏乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一些情说明书1/5 页3CN 116500119 A3况下，可以使用脂质如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酥乙醇胺。非阳离子脂质还包括聚乙二醇基聚合物如PEG 2000、PEG5000和与磷脂或神经胺缀合的聚乙二醇(称为PEGCer)。00062、脂质体的生物学意义0007囊泡(ves。

11、icles)是真核细胞中十分常见的膜泡结构，具有磷脂双分子层，是重要的生物来源的脂质体形态，是细胞内膜系统不可或缺的重要功能结构组分和细胞内物质定向运输的载体功能和表现形式。目前，针对这些体液中的囊泡类的组学研究，包括但不限于外泌体组学、血小板组学，随着各种提取、分析技术的日益成熟，正收到越来越多的关注。0008由于血小板及细胞内细胞器，如内质网和高尔基体，都能够分泌形成囊泡结构，其本身也是一种较大尺寸的囊泡结构。人体体液，包括血液、尿液、脑脊液、胸腔液、口水等，都存在细胞释放的囊泡结构，以外泌体(exosome)为主，这些囊泡结构中含有生物体各个组织器官释放的物质，因此蕴藏着大量的潜在可利用。

12、的生理或病理信息。外泌体是一种广泛存在并分布于各种体液中可由多种细胞分泌的膜性小囊泡，具有由脂质双层膜形成的泡囊结构，直径一般介于30120nm之间，包含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，除了能作携带和传递重要的信号分子，形成一种全新的细胞间信息传递系统从而改变其他细胞的功能外，在很多生理病理上起着重要的作用。人体多种细胞可分泌外泌体，人体体液中(血液、尿液、唾液、乳液)都含有外泌体，体外培养细胞的条件培养液中都存在由细胞分泌的外泌体。0009囊泡的提取对于研究囊泡内的成分具有关键性意义，其提取的效率直接影响后续目标研究物质的定性定量。但是，目前仅有少量手段定性、定量纯品囊泡，对于囊泡的纯化效率并。

13、没有有效评估手段。对于囊泡的蛋白质组学来说，囊泡的纯化效率直接决定了蛋白质组的提取量，相应的会影响后续的蛋白质组鉴定数据的质量。发明内容0010发明目的：针对目前对于各种提取方案中，对囊泡类结构提取效率的评估方法的不足，本发明提供了一种利用脂质体包裹蛋白或肽段标准品构成脂质体标准品，将脂质体标准品加入目标提取物并伴随提取过程，通过相应指定方法检测、分析相应标准品含量以评估样本囊泡类结构在蛋白质组学中的提取效率。0011技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：0012一种对样本中囊泡提取效率质控的方法，包括以下步骤：00131)制备包裹着蛋白或肽段化合物标准物质的脂质体标准品；00。

14、142)取两份等量的样品，一份作为目标样品，一份作为对照样品，目标样品中加入脂质体标准品，对照样品中加入与脂质体标准品等量的稀释液，两份样品同时进行囊泡的提取；00153)取步骤2)处理后的样品，对照样品中加入脂质体标准品，加入量与步骤2)中目标样品中的加入量相同，目标样品中加入等量的稀释液，两份样品同时进行蛋白质组检测前处理；00164)对步骤3)处理后的样品进行检测，并分析其中蛋白或肽段化合物标准物质的含量，目标样品中的含量与对照样品中的含量之比即为囊泡结构提取效率。0017进一步的，优选或者具体的实施方案如下：00181、制备脂质体标准物：说明书2/5 页4CN 116500119 A4。

15、0019a.脂质体标准物为脂质体双层外壳及内含标准物质；0020b.脂质体双层外壳具有两亲聚合物周膜，所述两亲脂质体的尺寸从10nm10 m，其尺0021寸基于目的脂质体组学类型，如外泌体：30150nm之间，血小板：18 m之间；c.脂质体中脂质包括阴离子脂质和中性脂质，在本文中共同称为非阳离子脂质。这样0022的脂质可以包含磷但它们并不限于此。非阳离子脂质的例子包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂乙醇胺(DOPE)、二棕桐酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂疏磷脂酰乙醇胺(DSPE)桐酰油磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕桐酰油酰磷脂酰。

16、胆碱(POPC)蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油疏磷脂酰胆碱(DOPC)二棕桐酰磷胎酰胆碱(DPPC)、二油磷脂酰甘油(DOPG)、二棕桐酰磷脂酰甘油(DPPG)棕桐油酰磷脂酰甘油(POPG)160单甲基PE、160二甲基PE181反式PE、棕桐疏油疏磷脂酰乙醇胺(POPE)、1硬胎2油磷脂乙醇胺(SOPE)、磷脂丝氨酸、磷脂疏肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡和胆固醇。另一些不含磷的脂质包括硬脂胺、十二胺、十六胺、棕构酸乙酰酰、蓖麻醇酸甘油醋、硬脂酸十六醋、肉豆楚酸异丙酰、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺十二烷基硫酸酰、烷基芳基硫酸聚乙氧基化的脂肪。

17、酰胺、双十八基二甲基澳化钱等、二基磷脂疏胆碱、二酰基磷脂疏乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一些情况下，可以使用脂质如溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酥乙醇胺。非阳离子脂质还包括聚乙二醇基聚合物如PEG 2000、0023PEG5000和与磷脂或神经胺缀合的聚乙二醇(称为PEGCer)。优选地，脂质是接近于真实生物细胞膜成分的脂质，如卵磷脂、鞘磷脂、脑磷脂等。0024d.内含标准物质为氨基酸链，可以是蛋白或肽段；标准物质优选为目标样品不具有的物质为，包括氨基酸序列不同、同位素标记不同、位点修饰不同、标签修饰不同等；0025e.脂质体合成方法包括但不限于注入法、薄膜分散法、超声波分散法、高压乳。

18、匀法，优选微流控注入法及超声波分散法；00262、将脂质体标准物加入目标样品，并伴随提取过程：0027a.目标样品为包含囊泡结构的天然样品，包括体液样本，如血浆、尿液、脑脊液、胸腔液、口水等，也包括组织或细胞裂解液、细胞培养液、微生物细胞裂解液、微生物培养液样本等样本。0028b.囊泡提取过程包括吸附囊泡、清洗除杂的步骤，如高速离心、过滤、层析、材料吸附、抗体结合等方法；00293、样本进行后续蛋白质组检测前处理：0030对脂质体标准品中的标准物质进行检测包括对蛋白、肽段进行检测；0031对蛋白、肽段进行检测方法优选为高效液相质谱检测，也可适用于相关的蛋白定性定量实验，如包括Westernbl。

19、ot显色、ELISA定量等基于相应抗体结合的免疫发光、化学发光、荧光显色等实验；0032蛋白质组检测前处理方法步骤包括还原烷基化、蛋白纯化、酶解、除盐、肽段纯化等步骤，为后续液相质谱方法的前处理；0033相关的蛋白定性定量实验为对吸附清洗后的囊泡样本直接或简单处理(如重悬，煮沸，洗脱等)后，进行包括Westernblot显色、ELISA定量等基于相应抗体结合的免疫发说明书3/5 页5CN 116500119 A5光、化学发光、荧光显色等实验。00344、对处理后的样本进行检测，并分析其中蛋白或肽段化合物标准物质的含量，标样品中的含量与对照样品中的含量之比即为囊泡结构提取效率：0035a.蛋白质。

20、组样本进行检测方法优选为基于液相质谱的非靶向方法，包括非标定量法(Labelfree)、数据非依赖采集质谱(DIAMS)、串联质谱标签(TMT)、体外同重同位素标记(iTRAQ)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)；也可以使用靶向方法，包括平行反应监测(PRM)、多反应检测质谱法(MRMMS)等液相质谱检测方法；0036b.对于基于液相质谱的非靶向方法，方法本身为检测样本中所有信息，从中依据蛋白或肽段标准品的信息进行数据抽提，对获得的定量数据进行比值比较，得到囊泡结构提取效率；0037c.对于对于基于液相质谱的靶向方法，需要依据蛋白或肽段标准品的信息进行参数设置，在获得样本中目标物质信息的同时。

21、，检测蛋白或肽段标准品的定量信息，对获得的定量数据进行比值比较，得到囊泡结构提取效率；0038d.相关的蛋白定性定量实验，包括Westernblot显色、ELISA定量等基于相应抗体结合的免疫发光、化学发光、荧光显色等实验，其基本原理都为抗体特异性结合蛋白或肽段标志物，抗体上的发光基团显色，基于回收的脂质体比例不同，其包含的蛋白或肽段标志物含量不同，显色存在差异，通过显色强度进行定量比较，0039得到囊泡结构提取效率；0040有益效果：与现有技术相比，本发明通过向待测样本中加入包裹着标准品物质的脂质体标品，对样本进行提取及检测，对标准品物质含量进行分析，从而评估样本提取过程中囊泡组分的提取效率。

22、，该方法简单可靠，能有效评估囊泡的纯化效率，提升囊泡蛋白质组学的稳定性。附图说明0041图1为本发明对样本中囊泡提取效率质控的方法流程说明图。0042图2为各组分westernblot方法检测牛血清白蛋白含量。具体实施方式0043以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。0044实施例100451)制备脂质体标准品，本次使用牛血清白蛋白，用于质控人源样本00461、取卵磷脂加入氯仿，使用旋转蒸发去除氯仿，将卵磷脂均匀分布于旋蒸瓶；00472、向旋蒸瓶加入1mg/mL牛血清白蛋白溶液，充分震荡，得到多层脂质体(MLV)；3、多层脂质体(M。

23、LV)，12,000rpm离心10min，弃上清，可以得到平均粒径1.5 m的脂质体标准品1；00484、将多层脂质体(MLV)转移至离心管中，放在0水浴中；00495、将超声波细胞破碎仪的探头浸入样品中，调节超声功率至输出功率为100W左右，将定时器设为1030min，有效超声时间为50，分散体必须从乳白色转变为呈乳光状说明书4/5 页6CN 116500119 A6对着日光能透过样品看清窗框；00506、12,000rpm离心10min，得到直径为100nm左右的脂质体，得到脂质体标准品2；7、将脂质体标准品1和脂质体标准品2使用BCA检测法进行检测，依据测定浓度，将两种脂质体都稀释至0.。

24、01mg/mL；00512)使用脂质体标注品质控不同尺寸脂质体回收效率00521.取3份40 L人血浆样本，向A血浆中加入10 L水，向B血浆中加入10 L脂质体质控品1，向C血浆中加入10 L脂质体质控品2；00532.将3份血浆使用商品化的血浆蛋白吸附试剂盒进行处理，即加入纳米吸附磁珠和缓冲液，充分孵育后，磁分离去上清，使用清洗缓冲液清洗3次；00543.在A血浆吸附后的样品A中，加入10 L脂质体质控品1或脂质体质控品2，在样品B、C中加入10 L水；00554.将步骤3中3个样本进行同样的蛋白质组检测前样本处理，包括还原烷基化、酶解、除盐，得到蛋白质组样本，进行液相色谱质谱检测；005。

25、65.将检测得到的质谱数据进行数据抽提、分析，得到A、B、C三个样本中牛血清白蛋白定量数据，如表1所示；0057表1牛血清白蛋白定量数据0058005900606.表1结果所示，本次使用试剂盒，对大尺寸(1 m级别)脂质体囊泡结构回收率在76.23，低于对于小尺寸(100nm级别)脂质体囊泡结构的回收率92.43，表明该试剂盒更适用于小尺寸(100nm级别)脂质体囊泡结构的回收。00613)使用脂质体标准品2监控外泌体纯化试剂盒纯化过程00621.收集50mLHela细胞培养后的培养基上清，使用100kDa超滤离心管进行浓缩，浓缩至23mL，转移超滤管中浓缩样本至新的离心管中；00632.向浓。

26、缩样本中加入10 L脂质体标准品2；00643.取商业化外泌体纯化柱(排阻法)，加入2倍柱体积PBS替换封柱液进行活化；00654.取1mL浓缩样品加样入活化后的外泌体纯化柱；00665.待样本都进入纯化柱，持续加入PBS进行洗脱，每半个柱体积洗脱液收集为一个组分样本；00676.各组分样本取样进行电泳，并使用westernblot检测牛血清白蛋白浓度以确认外泌体所在组分，如图2；00687.经确认，组分3、4、5的条带清晰，说明其牛血清白蛋白含量高，即脂质体标准品1在这3个组分含量高，即可表示具有高浓度外泌体，将这3个组分进行合并，并使用100kDa超滤离心管进行浓缩至预期体积，即为纯化外泌体。说明书5/5 页7CN 116500119 A7图1图2说明书附图1/1 页8CN 116500119 A8。