玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310459431.3(22)申请日 2023.04.25(83)生物保藏信息CGMCC NO.26821 2023.03.17CGMCC NO.26822 2023.03.17(71)申请人 齐齐哈尔大学地址 161006 黑龙江省齐齐哈尔市文化大街42号(72)发明人 刘晓兰丛珊滋郑喜群曹雨佳(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569专利代理师 高辉(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12P 21/06(2006.01)A23L 33/135(2016.。

2、01)A23L 33/18(2016.01)A23L 33/125(2016.01)A61K 38/01(2006.01)A61K 35/747(2015.01)A61K 47/26(2006.01)A61P 39/00(2006.01)C12R 1/225(2006.01)(54)发明名称一种玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用(57)摘要本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用。本发明提供的鼠李糖乳杆菌YY15和发酵乳杆菌YY16均是从野生果实表皮分离筛选获得的益生菌，可以特异性分解玉米蛋白，且二者之间存在协同共生作用，与单菌株发酵相比，混合菌株发酵后的活菌。

3、数、总酸含量(以乳酸计)、发酵物对DPPH自由基清除率均有显著提高，说明二者混合使用时对制备高活性玉米蛋白发酵物具有良好的协同作用，两者协同发挥作用可以进一步高效降解玉米蛋白水解物中的多肽，提高其活性成分含量和抗氧化活性，并能改善玉米蛋白水解物经酶解产生的苦味和异味，赋予玉米蛋白水解物特殊的发酵风味，为玉米蛋白水解物的开发提供新思路。权利要求书1页 说明书22页 附图6页CN 116606765 A2023.08.18CN 116606765 A1.一种益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YY15和发酵乳杆菌(Lactobac。

4、illusfermentum)YY16；所述鼠李糖乳杆菌YY15保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.26821；所述发酵乳杆菌YY16保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.26822。2.根据权利要求1所述的益生菌菌剂，其特征在于，所述益生菌菌剂为鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的混合物；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为(2.53.5)：(0.51.5)；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液的活菌浓度为(13)107CFU/mL；所述发酵乳杆菌YY16菌液的活菌浓度为(13)107CFU/mL。3.权利。

5、要求1或2所述的益生菌菌剂在发酵玉米蛋白水解物中的应用。4.一种玉米蛋白发酵物，其特征在于，所述玉米蛋白发酵物的制备原料包括：玉米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、权利要求1或2所述的益生菌菌剂和糖。5.根据权利要求4所述的玉米蛋白发酵物，其特征在于，所述玉米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、权利要求1或2所述的益生菌菌剂和糖的比例为50g：30g：8g：3050mL：4060mL。6.权利要求4或5所述玉米蛋白发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将玉米蛋白粉、水和碱性蛋白酶混合，第一酶解，得到第一酶解混合物；将所述第一酶解混合物和复合蛋白酶混合，第二酶解，得到第二酶解混合物；将所述第二酶。

6、解混合物离心，得到上清液，即玉米蛋白水解物；将所述玉米蛋白水解物、益生菌菌剂和糖混合，发酵，得到所述玉米蛋白发酵物。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述玉米蛋白水解物、益生菌菌剂和糖混合前，还包括：将所述玉米蛋白水解物依次进行浓缩和干燥。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩的方法包括：利用150Da纳滤膜对所述玉米蛋白水解物进行脱水脱盐处理；所述脱水脱盐处理的条件包括：20bar，纳滤频率50Hz，纳滤5次，最终浓缩倍数为2。9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一酶解的条件包括：pH值为8.5，温度为60，时间为2h；所述第二酶解的条件包括：pH。

7、值为7.0，温度为50，时间为3h；所述发酵的温度为39.5；所述发酵的时间为24h。10.权利要求1或2所述的益生菌菌剂或权利要求4或5所述的玉米蛋白发酵物或利用权利要求69任一项所述制备方法制备得到的玉米蛋白发酵物在抗疲劳中的应用。权利要求书1/1 页2CN 116606765 A2一种玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用。背景技术0002疲劳是指人体在同一强度下工作一段时间后，机体无法维持正常水平，致使工作能力下降、能量供应不足的一种复杂的状态。疲劳由多方面原因引起，如肌肉功能不足、神经肌肉连接处效率。

8、降低、中枢神经系统驱动源降低等。若机体长时间处于疲劳状态，得不到及时恢复，就可能会导致机体的内分泌失调和免疫能力下降，甚至诱发疾病。0003玉米蛋白水解物是由蛋白酶水解或微生物发酵而成的低聚肽类混合物。玉米蛋白水解物不仅具有良好的溶解性、并且易吸收，具有多种功能特性，如抑制血管紧张素转换酶活性、抗氧化、解酒护肝、抗疲劳等，但通过蛋白酶水解后，玉米蛋白水解物存在苦味和异味，严重影响食用口感。发明内容0004有鉴于此，本发明提供了一种玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用。本发明提供的益生菌菌剂能够显著发酵玉米蛋白水解物，两种益生菌协同发挥作用进一步高效降解玉米蛋白水解物中的多肽组分，提高其活性成分含量。

9、，并能改善玉米蛋白水解物经酶解产生的苦味和异味。0005为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：0006本 发 明 提 供 了 一 种 益 生 菌 菌 剂，所 述 益 生 菌 菌 剂 包 括鼠 李 糖 乳 杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)YY15和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)YY16；所述鼠李糖乳杆菌YY15保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26821；所述发酵乳杆菌YY16保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.26822。0007优选的，所述益生菌菌剂为鼠李糖乳杆菌YY15菌液和。

10、发酵乳杆菌YY16菌液的混合物；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为(2.53.5)：(0.51.5)；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液的活菌浓度为(13)107CFU/mL；所述发酵乳杆菌YY16菌液的活菌浓度为(13)107CFU/mL。0008本发明还提供了上述技术方案所述的益生菌菌剂在发酵玉米蛋白水解物中的应用。0009本发明还提供了一种玉米蛋白发酵物，所述玉米蛋白发酵物的制备原料包括：玉米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、上述技术方案所述的益生菌菌剂和糖。0010优选的，所述玉米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、权利要求1或2所述的益生菌菌剂和糖的比例为50g：30。

11、g：8g：3050mL：4060mL。0011本发明还提供了上述技术方案所述玉米蛋白发酵物的制备方法，包括以下步骤：说明书1/22 页3CN 116606765 A30012将玉米蛋白粉、水和碱性蛋白酶混合，第一酶解，得到第一酶解混合物；0013将所述第一酶解混合物和复合蛋白酶混合，第二酶解，得到第二酶解混合物；0014将所述第二酶解混合物离心，得到上清液，即玉米蛋白水解物；0015将所述玉米蛋白水解物、益生菌菌剂和糖混合，发酵，得到所述玉米蛋白发酵物。0016优选的，所述玉米蛋白水解物、益生菌菌剂和糖混合前，还包括：将所述玉米蛋白水解物依次进行浓缩和干燥。0017优选的，所述浓缩的方法包括：。

12、利用150Da纳滤膜对所述玉米蛋白水解物进行脱水脱盐处理；所述脱水脱盐处理的条件包括：20bar，纳滤频率50Hz，纳滤5次，最终浓缩倍数为2。0018优选的，所述第一酶解的条件包括：pH值为8.5，温度为60，时间为2h；所述第二酶解的条件包括：pH值为7.0，温度为50，时间为3h；所述发酵的温度为39.5；所述发酵的时间为24h。0019本发明还提供了上述技术方案所述的益生菌菌剂或上述技术方案所述的玉米蛋白发酵物或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的玉米蛋白发酵物在抗疲劳中的应用。0020有益效果：0021本 发 明 提 供 了 一 种 益 生 菌 菌 剂，所 述 益 生 菌 菌 剂 。

13、包 括鼠 李 糖 乳 杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)YY15和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)YY16；所述鼠李糖乳杆菌YY15保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26821；所述发酵乳杆菌YY16保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26822。本发明提供的鼠李糖乳杆菌YY15和发酵乳杆菌YY16均是从野生果实表皮分离筛选获得的益生菌，可以特异性分解玉米蛋白，且二者之间存在共生作用，与单菌株发酵相比，混合菌株发酵后的活菌数、总酸含量(以乳酸计)、发酵物对DPPH自由基清除率均有显著提。

14、高，说明二者混合使用时对制备高活性玉米蛋白发酵物具有良好的协同作用，两者协同发挥作用可以进一步高效降解玉米蛋白水解物中的多肽，提高其活性成分含量和抗氧化活性，并能改善玉米蛋白水解物经酶解产生的苦味和异味，赋予玉米蛋白水解物特殊的发酵风味，为玉米蛋白水解物的开发提供新思路。0022生物保藏说明0023鼠李糖乳杆菌YY15菌株，拉丁名为Lactobacillus rhamnosus，于2023年03月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.26821；0024发酵乳杆菌YY16菌株，拉丁名为Lactob。

15、acillusfermentum，于2023年03月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.26822。附图说明0025为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。0026图1为不同玉米蛋白发酵物对DPPH自由基清除率、总酸含量(以乳酸计)、乳酸菌活说明书2/22 页4CN 116606765 A4菌数和感官评价结果；0027图2为FCH对小鼠体重的影响；0028图3为FCH对小鼠血清尿素氮含量的影响；0029图4为FCH对小鼠血乳酸含量的影响；。

16、0030图5为FCH对小鼠血清乳酸脱氢酶含量的影响；0031图6为FCH对小鼠肌糖原含量的影响；0032图7为FCH对小鼠肝糖原含量的影响；0033图8为FCH对小鼠超氧化物歧化酶活力的影响；0034图9为FCH对小鼠谷胱甘肽含量的影响；0035图10为FCH对小鼠丙二醛含量的影响。具体实施方式0036本 发 明 提 供 了 一 种 益 生 菌 菌 剂，所 述 益 生 菌 菌 剂 包 括鼠 李 糖 乳 杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)YY15和发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)YY16；所说鼠李糖乳杆菌YY15保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

17、，保藏编号为CGMCC NO.26821；所述发酵乳杆菌YY16保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.26822。0037在本发明中，所述益生菌菌剂优选为鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的混合物；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的体积比优选为(2.53.5)：(0.51.5)，更优选为3：1；0038所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液的活菌浓度优选为(13)107CFU/mL；所述发酵乳杆菌YY16菌液的活菌浓度优选为(13)107CFU/mL；所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液的活菌浓度和所述发酵乳杆菌YY16菌液的活菌浓度优选相同。003。

18、9在本发明中，培养所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和发酵乳杆菌YY16菌液的培养基均优选包括MRS液体培养基；所述优选MRS液体培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、七水合硫酸镁0.58g、四水合硫酸锰0.25g，蒸馏水定容至1000mL。0040本发明提供的鼠李糖乳杆菌YY15和发酵乳杆菌YY16均是从野生果实表皮分离筛选获得的益生菌，可以特异性降解玉米蛋白；且二者之间存在共生作用，与单菌株发酵相比，混合菌株发酵后的活菌数、总酸含量(以乳酸计)、发酵物对DPPH自由基清除率均有显著提高，特别。

19、是当YY15与YY16菌种混合比例为3:1时，活菌数、总酸含量(以乳酸计)、发酵物对DPPH自由基清除率最大(P0.05)，分别为78.88、53.25g/L、2.4109CFU/mL，说明二者混合使用时对制备高活性玉米蛋白发酵物具有良好的协同作用，两者协同发挥作用可以进一步高效降解玉米蛋白水解物中的多肽，提高其活性成分含量和抗氧化活性，并能改善玉米蛋白水解物经酶解产生的苦味和异味，赋予玉米蛋白水解物特殊的发酵风味，为玉米蛋白水解物的开发提供新思路。0041本发明还提供了上述技术方案所述的益生菌菌剂在发酵玉米蛋白水解物中的应用。0042本发明还提供了一种玉米蛋白发酵物，所述玉米蛋白发酵物的制备。

20、原料包括：玉说明书3/22 页5CN 116606765 A5米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、上述技术方案所述的益生菌菌剂和糖。0043在本发明中，所述玉米蛋白粉、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、上述技术方案所述的益生菌菌剂和糖的比例优选为50g：30g：8g：3050mL：4060mL，更优选为50g：30g：8g：40ml：50ml。0044在本发明中，所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶优选购自诺维信生物技术有限公司；所述糖优选包括果葡糖浆，更优选为食品级果葡糖浆。0045利用本发明所述制备原料制备得到的玉米蛋白发酵物能显著延长小鼠负重游泳时间及爬杆时间，降低由运动性疲劳引起的血乳酸含量、血清尿素氮含量。

21、和乳酸脱氢酶含量，同时增加小鼠肝糖原、肌糖原及谷胱甘肽的含量、超氧化物歧化酶的活力，可见该玉米蛋白发酵物具有显著抗疲劳效果。0046本发明还提供了上述技术方案所述玉米蛋白发酵物的制备方法，包括以下步骤：0047将玉米蛋白粉、水和碱性蛋白酶混合，第一酶解，得到第一酶解混合物；0048将所述第一酶解混合物和复合蛋白酶混合，第二酶解，得到第二酶解混合物；0049将所述第二酶解混合物离心，得到上清液，即玉米蛋白水解物；0050将所述玉米蛋白水解物、益生菌菌剂和糖混合，发酵，得到所述玉米蛋白发酵物。0051本发明将玉米蛋白粉、水和碱性蛋白酶混合，第一酶解，得到第一酶解混合物。在本发明中，所述玉米蛋白粉、。

22、水和碱性蛋白酶的比例优选为50g：1L：30g；所述第一酶解的条件优选包括：pH值为8.5，温度为60，时间为2h。本发明通过第一酶解可以优先水解不带电荷的疏水性的蛋白质或肽的键。0052得到第一酶解混合物后，本发明将所述第一酶解混合物和复合蛋白酶混合，第二酶解，得到第二酶解混合物。在本发明中，所述第一酶解混合物和复合蛋白酶的比例优选为1L：8g；所述第二酶解的条件优选包括：pH值为7.0，温度为50，时间为3h。本发明碱性蛋白酶和复合蛋白酶将玉米蛋白水解成不同的肽组分，复合蛋白酶的加入使水解物产生了新的肽段，小分子量的水解物较大分子量的水解物抗氧化效果更好，从而提高了水解物的抗氧化效果。00。

23、53得到第二酶解混合物后，本发明优选对所述第二酶解混合物进行灭酶处理；所述灭酶的条件优选包括：100处理15min。0054第二酶解混合物进行灭酶处理后，本发明将灭酶处理后的第二酶解混合物离心，得到上清液，即玉米蛋白水解物。在本发明中，所述离心的条件优选包括：4000r/min离心15min。0055得到上清液后，本发明优选还包括：将所述玉米蛋白水解物依次进行浓缩和干燥，得到玉米蛋白水解物干粉。在本发明中，所述浓缩的方法优选包括：利用150Da纳滤膜对所述上清液脱水脱盐处理；所述脱水脱盐处理的条件优选包括：20bar，纳滤频率50Hz，纳滤5次，最终浓缩倍数为2。本发明通过浓缩处理可以脱去盐分。

24、带来的异味，以及截流150Da以下的组分。0056在本发明中，所述干燥的装置优选包括喷雾干燥器；所述干燥的条件优选包括：进口温度70、出斜线口温度120，气体压力0.6Mpa、蠕动泵流速20mL/min。0057得到玉米蛋白水解物干粉后，本发明将所述玉米蛋白水解物干粉、水、益生菌菌剂和糖混合，发酵，得到所述玉米蛋白发酵物。在本发明中，所述玉米蛋白水解物干粉、水、益说明书4/22 页6CN 116606765 A6生菌菌剂和糖的比例优选为205g：1L：40mL：50mL；所述发酵的温度优选为39.5；所述发酵的时间优选为24h；所述发酵的转速优选为150r/min。0058本发明还提供了上述技。

25、术方案所述的益生菌菌剂或上述技术方案所述的玉米蛋白发酵物或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的玉米蛋白发酵物在抗疲劳中的应用。0059利用本发明所述的益生菌菌剂发酵制备玉米蛋白发酵物(Lactic acid bacteria ferment corn protein hydrolysate，FCH)，其对DPPH自由基清除率的IC50值为0.227mg/mL(以蛋白浓度计)，对OH自由基清除率的IC50值为0.19mg/mL(以蛋白浓度计)，对超氧阴离子自由基清除率的IC50值为12.581mg/mL(以蛋白浓度计)。该发酵物能显著延长小鼠负重游泳时间及爬杆时间，降低由运动性疲劳引起的血乳酸。

26、含量、血清尿素氮含量和乳酸脱氢酶含量，同时增加小鼠肝糖原、肌糖原及谷胱甘肽的含量、超氧化物歧化酶的活力，具有显著抗疲劳效果。0060为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种益生菌菌剂、玉米蛋白发酵物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。0061实施例10062利用碳酸钙平板筛选野生果实表皮上的乳酸菌。乳酸菌在生长的过程中，会产生乳酸，乳酸会溶解平板中的碳酸钙从而产生溶钙圈。因此，根据所产溶钙圈从野生果实表皮中分离出30株乳酸菌，进一步筛选得到了8株高产蛋白酶的乳酸菌。0063碳酸钙平板：MRS琼脂培养基(北京索莱宝科技有限公司)6.36。

27、g，碳酸钙2g，蒸馏水100mL，于121灭菌15min。0064根据SB/T 103171999 蛋白酶活力测定法 记载的方测定蛋白酶活力，根据Folin酚法测定可溶性蛋白含量，对8株菌进行了产蛋白酶活力和特异性分解玉米蛋白能力的测定，其中测定特异性分解玉米蛋白能力的培养基的配置方法为：玉米蛋白粉10g，葡萄糖4g，蒸馏水100ml，配好后于121下灭菌30min，灭好后放置室温。各菌株的接菌量4ml，初始投菌量1106CFU/mL。结果如表1和表2所示。0065表1 8株乳酸菌产蛋白酶能力结果0066菌株编号蛋白酶活力(U/mL)YY10100.060.44eYY11108.930.31d。

28、YY12100.590.08eYY1398.000.07fYY14114.370.30bYY15120.420.27aYY16111.240.1cYY17108.850.25d0067注：不同字母代表存在显著性差异，下表同理。0068由表1可知，8株乳酸菌均能高产蛋白酶，其中菌株YY15蛋白酶酶活力最强，为120.420.27U/mL。其次酶活力由大到小分别是菌株YY14、YY16、YY11、YY17、YY12、说明书5/22 页7CN 116606765 A7YY10、YY13。0069表2 8株乳酸菌分解玉米蛋白的能力结果007000710072玉米蛋白粉中的蛋白质主要包括醇溶蛋白和谷蛋白。

29、，不溶于水，且结构稳定不易分解，限制了其在食品行业中的应用，通过筛选可以特异性分解玉米蛋白的乳酸菌是一项具有难度的工作。因此，分别测定了8株乳酸菌对玉米蛋白的分解能力，将8株乳酸菌加入到玉米蛋白悬浊液中培养24h，测定体系中可溶性蛋白含量，以此判断乳酸菌对玉米蛋白的分解能力。各组初始投菌量为106CFU/mL。由表2可知，未投菌时可溶性蛋白含量为10.38mg/mL，YY15和YY16两株菌经过发酵后，使得可溶性蛋白含量提升至32.14mg/mL和26.32mg/mL，说明这两株菌分泌的蛋白酶降解玉米蛋白的能力较其余菌株相比有显著差异(P0.05)。因此后续将对这两株菌进行16SrDNA鉴定。。

30、0073对2株菌进行了鉴定，确定测序菌株的种属信息，结果见下表3。他们分别为鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌。0074表3乳酸菌纯化菌株16S rDNA鉴定结果0075属名种名菌株编号lactobacillusrhamnosusYY15lactobacillusfermentansYY160076将鼠李糖乳杆菌YY15菌株和发酵乳杆菌YY16菌株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。0077实施例20078一种益生菌菌剂，由以下方法制备得到：0079将实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌YY15按1(V/V)接种量接种于MRS培养基中，发酵温度37，静置培养18h，于OD600nm下测定其吸光度值，当OD值。

31、为1.3时，菌体数量为1.0107CFU/mL，得到鼠李糖乳杆菌YY15菌液；0080将实施例1筛选得到的发酵乳杆菌YY16按1(V/V)接种量接种于MRS培养基中，说明书6/22 页8CN 116606765 A8发酵温度37，静置培养18h，于OD600nm下测定其吸光度值，当OD值为1.3时，菌体数量为1.0107CFU/mL，得到发酵乳杆菌YY16菌液；0081所述MRS培养基由以下方法制备得到：将蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母粉5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、七水合硫酸镁0.58g和四水合硫酸锰0.25g混合，pH值自然，蒸馏水定。

32、容至1000mL，121高压蒸汽灭菌20min；0082将所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和所述发酵乳杆菌YY16菌液按3：1的体积比混合，得到所述益生菌菌剂。0083对比例10084一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，所述益生菌菌剂仅含有鼠李糖乳杆菌YY15菌液。0085对比例20086一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，所述益生菌菌剂仅含有发酵乳杆菌YY16菌液。0087对比例30088一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和所述发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为2：1。0089对比例40090一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，。

33、所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和所述发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为1：1。0091对比例50092一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和所述发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为1：2。0093对比例60094一种与实施例2相似的益生菌菌剂，唯一区别在于，所述鼠李糖乳杆菌YY15菌液和所述发酵乳杆菌YY16菌液的体积比为1：3。0095应用例10096一种玉米蛋白发酵物，由以下方法制备得到：0097将膨化玉米蛋白粉(购自北京粮食集团责任有限公司和水混合，得到底物浓度为5的玉米蛋白液(w/v，即膨化玉米蛋白粉和水的比例为50g：1L)；0098向所述玉米蛋白液中添。

34、加碱性蛋白酶3(w/v，即碱性蛋白酶和膨化玉米蛋白粉的比例为30g：50g)，在pH为8.5，反应温度为60的条件下反应时间2h；然后添加复合蛋白酶0.8(w/v，即碱性蛋白酶和膨化玉米蛋白粉的比例为8g：50g)，在pH为7.0，反应温度为50的条件下反应时间3h；所述碱性蛋白酶和复合蛋白酶均购自诺维信生物技术有限公司；0099反应结束后将酶解液进行100，15min高温处理，随后于室温下以4000r/min离心15min，离心结束后取上清液；0100利用150Da纳滤膜对上清液脱水脱盐处理，条件为20bar、频率50Hz、纳滤5次，最终浓缩倍数为2；0101将浓缩出来的液体利用喷雾干燥器制。

35、备成玉米蛋白水解物干粉(记为CPH)，条件说明书7/22 页9CN 116606765 A9为进口温度70、出斜线口温度120，气体压力0.6Mpa、蠕动泵流速20mL/min；0102将所述玉米蛋白水解物干粉和水混合，得到底物浓度为20.5的发酵底物(w/v)，添加4(v/v，即菌液和发酵底物的体积比为4：100)的实施例2制备的益生菌菌剂和5(v/v，即食品级果葡糖浆和发酵底物的体积比为5：100)的食品级果葡糖浆，放置于摇床中培养24h，发酵温度39.5，转速150r/min；发酵结束后利用喷雾干燥器将发酵物制成干粉(记为FCH)，即得所述玉米蛋白发酵物。0103对比应用例10104采用。

36、应用例1相同的方法，将实施例2制备的益生菌菌剂分别替换为对比例16的益生菌菌剂，制备得到不同的玉米蛋白发酵物。0105检测利用实施例2和对比例16的益生菌菌剂制备得到的不同玉米蛋白发酵物对DPPH自由基清除率、总酸含量(以乳酸计)、乳酸菌活菌数和感官评价，每个检测指标进行3次平行重复实验，其中，DPPH自由基清除率采用酶标仪法，总酸含量(以乳酸计)测定采用GB 124562021，乳酸菌活菌数采用GB 4789.352016，感官评价标准见表4，检测结果表5和图1。0106表4感官评价标准010701080109表5不同玉米蛋白发酵物的检测结果说明书8/22 页10CN 116606765 A。

37、1001100111由表5和图1所示，与单菌株发酵相比，混合菌株发酵后的活菌数有明显提高，说明鼠李糖乳杆菌和发酵乳杆菌之间不仅存在共生作用，而且混合培养促进二者更好的生长。混合发酵的DPPH自由基清除率、总酸(以乳酸计)也均有提升，说明二者的混合培养对水解玉米蛋白水解物有良好的协同作用。当YY15与YY16菌种混合比例为3:1(v/v)时，对DPPH自由基清除率、总酸含量及乳酸菌活菌数最大(P1的物质的阈值进行查阅。ROAV1的挥发性成分是样品中的关键气味物质；0.1ROAV1的组分对样品的整体气味有修饰作用，ROAV0.1的组分对样品的气味有潜在影响。通常规定对样本总体气味贡献最大的挥发性成。

38、分ROAVmax100，其他挥发性成分的ROAV值按公式1计算。01280129式中：0130ROAV：相对气味活度值；0131Ci：各成分的相对含量()，通过表6总结的数据查询；0132Ti：各成分的感觉阈值(mg/kg)，通过 化合物香味阈值汇编 及文献查阅可知；0133Cmax：对整体气味贡献最大的成分的相对含量()，FCH中4乙烯基2甲氧基苯酚的相对含量6.12；0134Tmax：对整体气味贡献最大的成分的感觉阈值(mg/kg)，FCH中4乙烯基2甲氧基苯酚的感觉阈值为0.0028mg/kg。0135(4)关键挥发性成分的分析结果0136香气成分相对含量的高低并不能作为评定玉米蛋白水解。

39、物特征香气的依据，通常赋予玉米蛋白水解物香气特征的是具有较高ROAV值的香气成分。4乙烯基2甲氧基苯酚是CPH和FCH中相对含量较高且阈值较低的香气成分，对两个样品的总体香气贡献最大，因此规定4乙烯基2甲氧基苯酚的ROAV100，进而计算每个香气成分的ROAV值来评价对玉米蛋白水解物整体香气的贡献，结果见表7。0137表7玉米蛋白水解物发酵前(CPH)和发酵后(FCH)挥发性成分的ROAV值0138说明书14/22 页16CN 116606765 A160139说明书15/22 页17CN 116606765 A1701400141注：仅计算了能查阅到阈值的挥发性成分。“”表示未检出。发酵后的。

40、玉米蛋白水解物中的4乙烯基2甲氧基苯酚的ROAV值为100。0142由表7可知，CPH中关键挥发性成分(ROAV1)有15种，其中9种挥发性成分呈烘焙味和花果香等令人愉悦的香气，6种挥发性成分呈粪臭味、烧焦味等刺激性气味。0143FCH中关键挥发性成分(ROAV1)有15种，其中17种挥发性成分呈花果香和烘焙味等令人愉悦的香气，1种挥发性成分呈刺激性气味。0144CPH中，起主导作用的挥发性气味是二乙基二硫醚，通过计算其ROAV值为1108.06，呈现明显的刺激性气味。在FCH中，起主导作用的挥发性成分有两种，分别是ROAV值为112.44的2,3丁二酮及ROAV值为100的4乙烯基2甲氧基苯。

41、酚，两种香气成分呈现糕点香、花香及咖啡香气。0145与CPH相比，FCH中新增加了7种关键挥发性香气(ROAV1)，分别是橙花叔醇、苯乙醛、邻甲基苯甲醛、2,3丁二酮、2,3,5三甲基吡嗪、2,6二乙基吡嗪、2正戊基呋喃，使CPH增加了花果香和烘焙味。值得注意的是，苯并噻唑、吲哚等刺激性气味消失不见，二乙基二硫醚相对含量显著降低。0146综上所述，本发明提供的益生菌菌剂发酵后，可以大大改善玉米蛋白水解物的苦味及异味，并给发酵后的水解物赋予令人愉悦的气味。0147应用例30148玉米蛋白发酵物抗疲劳效果分析0149(1)动物实验分组0150实验设计分为6组，正常组(CG)、疲劳模型组(MG)、玉。

42、米蛋白水解物中剂量组(CPHMG)、发酵玉米蛋白水解物低剂量组(FCHLG)、发酵玉米蛋白水解物中剂量(FCHMG)及发酵玉米蛋白水解物高剂量组(FCHHG)。选取96只4周龄ICR级雄性小鼠分为6个处理，每个处理16只小鼠。正常组和疲劳模型组小鼠每日灌胃量为10mL/kgbw(体重)灌胃生理盐水，其余各组按照对应灌胃受试物进行灌胃，其中CPHMG为玉米蛋白水解物中剂量组，分组情况见表8；在进行小鼠试验时，除正常组不进行运动试验以外，疲劳模型组和各个给药剂量组均说明书16/22 页18CN 116606765 A18进行运动试验。0151饲养实验在齐齐哈尔大学西二校区动物实验室进行，为期28d。

43、，各组小鼠采用笼养方式进行饲养，自由采食和饮水，饲养温度保持25，按照日光进行光照控制。0152表8动物实验设计与分组0153组别缩略词灌胃受试物灌胃剂量正常组CG生理盐水/疲劳模型组MG生理盐水/低剂量组FCHLGFCH125mg/kgbw中剂量组FCHMGFCH250mg/kgbw高剂量组FCHHGFCH500mg/kgbw玉米蛋白水解物中剂量组CPHMGCPH250mg/kgbw0154注：表中的FCH为应用例1制备的玉米蛋白发酵物，CPH为应用例1制备的玉米蛋白水解物干粉。0155动物实验结果0156(1)动物生长性能0157动物生长性能指标测定方法0158记录4周龄小鼠初始体重，于每。

44、日灌胃前进行称重，连续记录4周。计算平均日增重(Average daily gain，ADG)。0159生长性能结果见表9和图2。0160表9发酵玉米蛋白水解物对小鼠体重的影响016101620163在饲养过程中，各组小鼠无任何异常状况发生。由表9和图2所示，各组处理组小鼠的体重呈现平稳的上升趋势，FCHLG、FCHMG、FCHHG和CPHMG的体重增加量分别为16.190.76g、17.090.74g、16.181.49g和16.021.76g，与正常组15.760.74相比无显著性差异(P0.05)。实验组和正常组的体重增加趋势相似，说明在实验剂量下，发酵前后的玉米蛋白水解物无毒副作用，不。

45、影响小鼠正常生长，没有对小鼠的健康造成不利影响。0164(2)小鼠耐力实验0165负重游泳测定方法0166每组6只小鼠，末次灌胃30min后，在小鼠尾部负其体重10的铅皮，放置于水深251cm、水温251的游泳箱中。记录小鼠自开始游泳至头部完全沉入水下8s不能露出水面的时间，即为小鼠负重游泳时间。0167负重游泳实验测定结果见表10。0168表10 FCH对小鼠负重游泳时间的影响说明书17/22 页19CN 116606765 A190169组别负重游泳时间/s正常组(CG)46.3616.67d玉米蛋白水解物中剂量组(CPHMG)50.1925.13c低剂量组(FCHLG)52.6911.7。

46、2c中剂量组(FCHMG)69.5027.87b高剂量组(FCHHG)90.9438.01a0170由表10可见，FCHHG组小鼠负重游泳时间为90.94s，为正常组的1.96倍，FCHLG和FCHMG组小鼠负重游泳时间分别为52.69s和69.5s，为正常组的1.14倍和1.5倍，且FCH的剂量与小鼠负重游泳的时间呈正相关性。FCH各剂量组与正常组之间达到了显著性差异(P0.05)，说明FCH剂量组可以显著延长小鼠的负重游泳时间，且具有一定的抗疲劳功效。除此之外，CPHMG也可以延长小鼠负重游泳的时间，与FCH剂量组之间存在显著性差异(P0.05)。0171转棒实验测定方法0172负重游泳实。

47、验结束的小鼠休息三天后，依次将各实验组小鼠放在转棒上，缓慢调节转棒的速度至15r/min，记录每组小鼠因肌肉疲劳从棒上跌落的时间，前3次为预实验，从第4次开始计时，小鼠从转棒上跌下即为小鼠转棒时间。若小鼠30min未从转棒上跌下，则记其转棒时间为30min。0173小鼠转棒实验测定结果见表11。0174表11 FCH对小鼠转棒时间的影响0175组别转棒时间/min正常组(CG)4.783.22d玉米蛋白水解物中剂量组(CPHMG)10.195.13bc低剂量组(FCHLG)9.696.72bc中剂量组(FCHMG)12.515.66b高剂量组(FCHHG)17.357.34a0176由表11可。

48、见，与正常组相比，CPHMG和FCH各剂量组小鼠的转棒时间均有所增加，尤其是FCHMG和FCHHG组，小鼠的转棒时间存在显著性差异(P0.05)，但达到了正常组小鼠的水平。0186模型组小鼠胸腺指数为0.22，经FCH灌胃后，FCH三个剂量组的小鼠胸腺指数分别增加到0.23、0.29、0.33，但各组间也未达到显著性差异(P0.05)，此外，FCHLG组与模型组相比也有所增加。0187在小鼠的心脏指数中，CPHMG的心脏指数为0.59，高于与之对应的FCHMG组的心脏指数为0.58。但在其余脏器指数中，FCHMG组高于CPHMG(P0.05)。0188可见，小鼠在剧烈运动后，FCH剂量组的各个。

49、脏器指数与模型组相比都有所增加，虽然均未达到显著性差异(P0.05)，但在一定程度上能够起到抗疲劳作用，提高小鼠免疫能力。因此，FCH在一定程度上可以改善小鼠的疲劳状态，且效果优于CPH。0189解剖获得的肝脏、骨骼肌及眼球取血的血液进行如下实验：血液置于4下过夜后，于3000r/min下离心10min分离出血清；用预冷的生理盐水将肝脏及骨骼肌制成10的肝匀浆液和骨骼肌匀浆液，于3000r/min下离心10min，取上清液用于生化相关指标的测定。0190使用试剂盒分别测定血清中尿素氮含量、乳酸含量及乳酸脱氢酶含量，肝匀浆中的超氧化物歧化酶酶活、谷胱甘肽含量、丙二醛含量及肝糖原含量，骨骼肌匀浆中。

50、的肌糖原含量。0191小鼠尿素氮含量的测定结果见图3和表13。0192表13 FCH对小鼠血清尿素氮含量的影响0193组别尿素氮含量(mmol/L)正常组(CG)4.461.09a疲劳模型组(MG)8.830.79e玉米蛋白水解物中剂量组(CPHMG)5.980.67d低剂量组(FCHLG)6.090.96d中剂量组(FCHMG)5.811.00c高剂量组(FCHHG)5.391.17b0194血清尿素氮的含量可以直接代表血尿素的水平，并且血清尿素氮水平与运动耐受性呈现显著负相关性，即血清尿素氮水平越低，其运动耐受性越好。由图3和表13可以看出，FCH可以提高小鼠的抗疲劳能力。与模型组比较，C。