SmHD-Zip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310758960.3(22)申请日 2023.06.26(71)申请人 山东中医药大学地址 250355 山东省济南市长清区大学科技园大学路4655号(72)发明人 刘谦白艳红周颖刘芳瑞刘玉红韩凤霞(74)专利代理机构 济南克雷姆专利代理事务所(普通合伙)37279专利代理师 吴梦飞(51)Int.Cl.C12N 15/29(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C07K 14/415(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/50(2018.01)。

2、(54)发明名称SmHD-Zip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用(57)摘要本发明公开了SmHDZip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用，属于基因工程技术领域。所述SmHDZip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丹参毛状根性状为根长、根粗、根毛数量、根重中的任意一种或两种以上。本发明还公开了一种过表达SmHDZip12基因的丹参植株的构建方法：构建含有SmHDZip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养即得。本发明通过研究发现，SmHDZip12基因对丹参毛状根的性状具有正向调控作用，过表达SmHDZip12基因可使丹参毛状根的根长更长、根粗更粗。

3、、根毛数量更多、根重更重。本发明具有较高的产业价值。权利要求书1页 说明书8页序列表（电子公布）附图3页CN 116606866 A2023.08.18CN 116606866 A1.SmHDZip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用，其特征在于：所述SmHDZip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述丹参毛状根性状为根长、根粗、根毛数量、根重中的任意一种或两种以上。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述丹参毛状根性状为根长、根粗、根毛数量和根重。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在丹参植株中过表达SmHDZip12基因，则丹参毛状根的根长更长和/或根粗更粗和/。

4、或根毛数量更多和/或根重更重。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在丹参植株中过表达SmHDZip12基因，则丹参毛状根的根长更长，根粗更粗，根毛数量更多，根重更重。5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，在丹参植株中过表达SmHDZip12基因的具体方式为：构建含有SmHDZip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHDZip12基因的丹参植株。6.一种过表达SmHDZip12基因的丹参植株的构建方法，其特征在于：构建含有SmHDZip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHDZip12基因的丹参植株。7.根。

5、据权利要求6所述的过表达SmHDZip12基因的丹参植株的构建方法，其特征在于：与野生型丹参植株相比，过表达SmHDZip12基因的丹参植株的毛状根的根长更长和/或根粗更粗和/或根毛数量更多和/或根重更重。权利要求书1/1 页2CN 116606866 A2SmHDZip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用技术领域0001本发明涉及SmHDZip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用，属于基因工程技术领域。背景技术0002丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，其功效为活血祛瘀，清心除烦，通经止痛，凉血消痈，为我国传统中药材。现代药理研究。

6、表明，丹参主要用于治疗心绞痛、痛经、骨节疼痛等疾病，在山东、河南、甘肃、陕西、四川等地均有种植。丹参适宜生长在土壤肥沃、土质疏松、光照充足、空气湿润的地方。但是近年来，我国各地区降水量分布不均匀部分地区干旱频发，致使丹参根系生长缓慢，其产量明显下降。与此同时，丹参市场规模不断扩大，目前野生资源难以满足市场需求，而人工栽培模式下种植的丹参普遍存在混杂情况，不能满足临床需求。因此，深入发掘可以调节丹参产量相关的基因，开展功能与机制研究，对筛选抗旱、高产的丹参品种具有重要意义。0003同源异型域亮氨酸拉链(homeodomainleucine zipper I，HDZip )亚家族蛋白属于HDZip。

7、基因家族，它的结构由两部分组成，即一个高度保守的HD结构域和一个相较不保守的亮氨酸拉链结构域。HDZip 类基因在非生物胁迫过程中起重要作用，比如：干旱、盐、温度胁迫。据统计，在所有非生胁迫中，干旱胁迫对植物生长发育造成的损害最大，HDZip类基因可以提高植物在干旱胁迫过程中的耐受性。Li S等人将小麦(Triticum aestivum)TaHDZ56A基因在拟南芥中进行过表达，结果表明过表达植株的脯氨酸含量高于野生型所具有的脯氨酸含量，在干旱条件下，TaHDZ56A过表达植株具有更好的持水能力，植物的存活率更高。Dezar CA等人将向日葵Hahb4基因在拟南芥中进行过表达，基因过表达拟南。

8、芥表现出比野生型植物对水压力条件的耐受性更强的表型，存活率更高。Zhao等人发现，通过调节ABA信号通路，Zmhdz10提高过表达拟南芥的抗干旱能力。HDZip 基因家族在植物根系生长发育过程中也发挥着重要的作用。Perotti M F等人研究发现AtHB23在植物发育早期影响次级侧根原基的基部表达，AtHB23基因过表达植物比野生型植物表现出侧根明显被抑制生长的现象。通过染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应测定显示该基因直接影响了LBD16的表达，从而调控次生根的形成。Ora Son等人通过在拟南芥ATHB53基因过表达，发现ATHB53基因过表达影响植物根系的生长发育。0004SmHDZip12。

9、基因是HDZip 基因家族的成员之一，目前尚未见到关于SmHDZip12基因在调控丹参毛状根根系生长发育方面的研究报道。发明内容0005针对上述现有技术，本发明提供了SmHDZip12基因的一种新用途在调控丹参毛状根性状中的应用。本发明还提供了一种过表达SmHDZip12基因的丹参植株的构建方法。0006本发明是通过以下技术方案实现的：说明书1/8 页3CN 116606866 A30007SmHDZip12基因在调控丹参毛状根性状中的应用，所述丹参毛状根性状为根长、根粗、根毛数量、根重中的任意一种或两种以上。所述SmHDZip12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质的。

10、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。0008具体的调控体现为：在丹参植株中过表达SmHDZip12基因，则丹参毛状根的根长更长和/或根粗更粗和/或根毛数量更多和/或根重更重，显著优于野生型丹参植株，即SmHDZip12基因对丹参毛状根的性状(根长、根粗、根毛数量，根重)具有正向调控作用。0009过表达SmHDZip12基因在提高丹参毛状根性状中的应用，所述丹参毛状根性状为根长、根粗、根毛数量、根重中的任意一种或两种以上。0010进一步地，在丹参植株中过表达SmHDZip12基因的具体方式为：构建含有SmHDZip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHD。

11、Zip12基因的丹参植株，与野生型丹参植株相比，该丹参植株的毛状根的根长更长和/或根粗更粗和/或根毛数量更多和/或根重更重。0011一种过表达SmHDZip12基因的丹参植株的构建方法：构建含有SmHDZip12基因的过表达载体，利用农杆菌介导法侵染丹参无菌叶片，培养得到过表达SmHDZip12基因的丹参植株，与野生型丹参植株相比，该丹参植株的毛状根的根长更长和/或根粗更粗和/或根毛数量更多和/或根重更重。0012本发明基于丹参基因组和不同干旱胁迫下丹参幼苗根转录组的数据，筛选出一个可以强烈响应ABA、PEG、NaCl的基因SmHDZip12，该基因是同源异型域亮氨酸拉链(HDZip )家族的。

12、成员。本发明通过构建pMDC202SmHDZip12过表达载体，通过发根农杆菌介导，对丹参叶片建立遗传转化体系，进而得到SmHDZip12过表达型毛状根，通过观察野生型和过表达型丹参毛状根生长发育情况，分析其SmHDZip12基因对根系发育的影响。结果表明，SmHDZip12基因具有促进丹参毛状根根系生长发育的功能，SmHDZip12基因对丹参毛状根的性状(根长、根粗、根毛数量，根重)具有正向调控作用，过表达SmHDZip12基因，可使丹参毛状根的根长更长、根粗更粗、根毛数量更多、根重更重。0013本发明利用基因工程手段，通过农杆菌介导遗传转化的方法将SmHDZip12基因成功转化到丹参毛状根。

13、中，获得SmHDZip12过表达型毛状根，通过研究发现了SmHDZip12基因的新用途。本发明为提升丹参品质提供了新的思路和可用的基因资源，为丹参新品种的改良提供了理论依据，具有较高的产业价值。附图说明0014图1：重组质粒转化发根农杆菌电泳检测图，其中，M：DL 2000；16：重组质粒转入发根农杆菌。0015图2：SmHDZip12基因过表达毛状根的培养生长过程图，其中，A：丹参无菌苗；B：农杆菌侵染后的丹参受伤叶片(共培养)；C：分化培养；D：毛状根阳性单克隆；E：扩大培养的阳性毛状根。0016图3：SmHDZip12阳性株系PCR验证结果示意图，其中，M：DL 2000；19：过表达型。

14、毛状根；10：野生型毛状根；11：pMDC202SmHDZip12重组质粒。0017图4：毛状根培养21天的照片，其中，A：野生型毛状根；B：SmHDZip12过表达型毛状根。说明书2/8 页4CN 116606866 A40018图5：显微镜下观察的毛状根的照片，其中，A：野生型毛状根(4)；B：SmHDZip12过表达型毛状根(4)。0019图6：丹参毛状根株系的照片，其中，A：野生型毛状根；B：SmHDZip12过表达型毛状根。0020图7：丹参毛状根生物量统计结果示意图，其中，WT为野生型，OE为SmHDZip12基因过表达型。*代表P0.05，*代表P0.01。具体实施方式0021下。

15、面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。0022下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。0023实施例1SmHDZip12基因对丹参毛状根根系生长发育的影响00241.材料与方法00251.1实验材料00261.1.1植物材料0027丹参无菌苗在本实验室的组培室中继代培养，培养条件：25，16小时。

16、光照，8小时黑暗。00281.1.2载体和菌株0029pMDC202SmHDZip12过表达载体，保存于本课题组实验室(载体为通用材料，为商业购买后实验室自存自用)。0030Ar,Qual发根农杆菌感受态细胞(菌株)，上海唯地生物技术有限公司。00311.1.3主要实验仪器0032如表1所示。0033表1主要实验仪器说明书3/8 页5CN 116606866 A5003400351.1.4培养基和抗生素的配制0036组成如表2、3、4所示。0037表2YEB培养基配制00380039表3MS培养基004000410042表4抗生素00430044抗生素溶解后，过0.22 m滤膜，灭菌，分装于1。

17、.5mL的离心管中，储存于20冰箱中。说明书4/8 页6CN 116606866 A600451.2重组质粒转化发根农杆菌0046(1)100 L的Ar.Qual发根农杆菌加入5 L的pMDC202SmHDZip12质粒，用手快速、剧烈拨打管底混匀，依次放于冰中静置5min、液氮5min、37水浴5min、冰浴5min。0047(2)室温条件下加入700 L无抗生素YEB液体培养基，于28振荡培养2h。0048(3)6000rpm离心1min，弃掉700 L上清，轻轻吹打重悬菌块，涂布于含50mg/L Kana和50mg/L Str的YEB平板上，倒置放于28培养箱培养3天。0049(4)挑取。

18、单菌落，接种于7.5mL的YEB液体培养基(含50mg/L Kana和50mg/L Str)，28、200rpm培养12h，通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆。00501.3诱导丹参毛状根0051(1)吸取750 L转化了pMDC202SmHDZip12的农杆菌菌液，加入到75mL的YEB液体培养基(含50mg/mL Str和50mg/mL Kana)中，28、200rpm摇至OD600为0.6。同时挑取不含任何外源质粒的Ar.Qual单菌落，接入不含抗生素的YEB液体培养基中活化，用于诱导野生型丹参毛状根。0052(2)将上述活化的菌液转移至50mL离心管，4000rpm离心10min，弃上清。。

19、0053(3)用50mL的MS液体培养基重悬菌体，转移至锥形瓶中，200rpm、28培养30min。0054(4)选取继代30天左右长势良好的丹参无菌苗叶片，将叶片剪成0.5cm2大小的小块，转入上述锥形瓶中，200rpm、28侵染10min。0055(5)在超净工作台中用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，转移至含200 mol/L乙酰丁香酮的MS固体培养基，置于暗环境下共培养3天。0056(6)无菌水冲洗叶片5遍，用无菌滤纸吸干后，接种于含500mg/L头孢噻肟钠和200 mol/L乙酰丁香酮MS分化培养基上。0057(7)待毛状根长出5cm以上后，分离单根系。每7天左右更换一次培养基，并逐渐降低头。

20、孢噻肟钠浓度，最终转移至无抗生素的MS培养基中培养。0058(8)在MS固体培养基上培养1个月后无细菌生长，转移至50mL的MS培养基中，25、120rpm暗环境下扩大培养。00591.4过表达SmHDZip12毛状根阳性株系的鉴定0060(1)提取毛状根基因组DNA0061利用试剂盒(DC104，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)提取野生型和过表达型毛状根DNA。0062(2)过表达型毛状根阳性鉴定0063根据载体中包含的35S启动子，设计上游引物35SF，根据SmHDZip 12基因ORF序列，设计下游引物SmHDZip12R，以提取的DNA为模板，进行PCR检测。0064引物的核苷酸序列如。

21、下所示：006535SF：5GAGCACGACACACTTGTCTACT3；0066SmHDZip12R：5CTGCGCAGTACCACCAGTATT3。0067PCR扩增体系为：2M5 Hiper plus Taq HiFi PCR mix，10 L；上游引物(10 mol/L)，0.5 L；下游引物(10 mol/L)，0.5 L；DNA模板，2 L；ddH2O补足至20 L。0068扩增程序为：95、3min；94、30s，55、30s，72、1min，30个循环；72、10min，4恒温保存。说明书5/8 页7CN 116606866 A700691.5丹参毛状根的性状观察0070分别。

22、观察野生型和过表达丹参毛状根生长状况，观察并统计两种侵染叶片后毛状根的生长状态，同时进行显微镜下观察。随机选取培养21天的野生型和SmHDZip12基因过表达型毛状根，置于载玻片上，放置于显微镜下，用4倍镜进行观察、拍照，记录该基因对丹参毛状根生长状况的影响。00712.结果与分析00722.1过表达载体转化发根农杆菌0073将重组质粒pMDC202SmHDZip12转化Ar.Qual发根农杆菌，28培养3天，挑取单菌落，PCR鉴定，利用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，6个单克隆的条带都在1 000bp左右，其结果与预期相吻合，说明重组质粒成功转入Ar.Qual发根农杆菌。00742。

23、.2毛状根诱导0075将含有重组质粒pMDC202SmHDZip12的菌液侵染丹参无菌受伤叶片，进行共培养(图2B)和分化培养，获得丹参毛状根，转移至液体培养基中进行扩大培养。丹参受伤叶片经过发根农杆菌侵染后，分化培养7天，发现丹参叶片周围逐渐形成愈伤，叶片边缘长出细微的毛状根(图2C)。当毛状根长度超过5cm，挑取单根转移至MS培养基上继续培养(图2D)。培养一段时间后，经PCR鉴定为阳性的毛状根转移至MS液体培养基中进行扩大培养，获得长势良好的毛状根(图2E)。00762.3SmHDZip12基因过表达型毛状根阳性鉴定0077利用上游引物35SF和下游引物SmHDZip12R进行PCR扩增。

24、检测SmHDZip12过表达型毛状根是否为阳性，结果如图3所示，10号为野生型毛状根，无条带；19号为SmHDZip12过表达单株系，共检测9个株系，其中6个(1号、2号、3号、5号、7号、9号)的条带与重组质粒(11号)的条带大小一致。根据阳性株系的数量/总检测株系的数量*100计算阳性率，结果表明阳性率为6/9*10067。00782.4SmHDZip12基因过表达型毛状根的表型分析0079利用含有pMDC202SmHDZip12质粒的农杆菌菌液和不含任何外源质粒的农杆菌侵染丹参受伤叶片，培养得到毛状根，观察(如图4、图5所示)并统计野生型和SmHDZip12过表达型毛状根的生长状态，结果。

25、表明，野生型与过表达型植株相比，野生型毛状根生长缓慢，相比之下，在MS培养基上的野生型(图4A)毛状根状态纤细、短小，与过表达型毛状根(图4B)的粗、长相差甚远。在显微镜下进行观察，在相同的放大倍数视野下(4)，过表达型毛状根明显比野生型毛状根株系粗(图5)。且生长21天后的过表达型毛状根的根长、根毛数、根粗显著高于野生型，经统计图4A、图5A野生型毛状根长度为4.200.33cm，根毛数为6.50.5根，粗度为25128 m，图4B、图5B过表达型毛状根长度为8.470.64cm，根毛数为30.310根，粗度为512.725 m。结果表明过表达SmHDZip12基因可促进丹参毛状根根长、根毛。

26、数量、根粗。0080农杆菌侵染丹参受伤叶片后，将其置于含有抗生素的MS培养基上，进行筛选培养，鉴定为SmHDZip12过表达的毛状根长至一定程度后转移到MS液体培养基，扩大培养，观察野生型和SmHDZip12基因过表达型毛状根生长状况，结果如图6所示。由图6可见，野生型毛状根(图6A)团较小，纤细且呈浅黄色，过表达型毛状根(图6B)团较大，粗长且呈红色。统计毛状根生物量，结果如图7所示，野生型毛状根的湿重为23.551g，过表达型毛状根的湿重为说明书6/8 页8CN 116606866 A827.291g；野生型毛状根的干重为1.166g，过表达型毛状根的干重为1.701g，过表达型毛状根的干。

27、重与湿重均大于野生型毛状根，说明SmHDZip12基因过表达对丹参毛状根的重量有一定的影响。00813.结论和讨论0082近年来，随着生物基因研究技术的不断发展，丹参基因相关的遗传体系逐渐完善，为深入探究丹参植株根系的发育起到了至关重要的作用。本发明的研究结果表明，SmHDZip12基因过表达可以促进根系根长、根粗的发育，同时，SmHDZip12过表达型毛状根的根系比较粗壮，外观为红棕色，野生型毛状根的根系比较纤细，外观呈淡白色。说明SmHDZip12基因对丹参毛状根的生长有正向调控作用。0083外界环境对植物生长发育有很大的影响，转录因子在此过程中发挥重要作用。转录因子的调控作用表现出不同的。

28、适应机制，包括植物的形态、生理、发育和分子组成发生变化，以适应外界环境的变化。本发明的研究阐明SmHDZip12基因过表达可以提高丹参毛状的根长、根粗、根重，对丹参毛状根的生长发育具有正向调控作用，本发明推测SmHDZip12促进根系发育可能与根系细胞的伸长区和分生区的细胞有关，这有待进一步的证实。0084附：pMDC202SmHDZip12过表达载体的构建(内容与CN 114717257 A中的实施例1一致)，步骤如下：0085(1)线性化载体的制备0086使用Xba 和Kpn 酶切载体pMDC202，酶切体系为：10FastDigest Green Buffer，2 L；Xba，1 L；K。

29、pn，1 L；质粒DNA，2 L；ddH2O，14 L；共20 L。金属浴37反应1小时。酶切后进行1琼脂糖凝胶电泳检测。利用诺唯赞公司胶回收试剂盒，回收目的载体大片段，得线性化载体。0087(2)目的片段PCR扩增0088以继代培养的丹参无菌苗作为实验材料，利用诺唯赞公司RNA提取试剂盒提取总RNA，Takara反转录酶反转获得cDNA，根据SmHDZip12基因编码区序列设计引物SmHDZip12F和SmHDZip12R，进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2Phanta Max Buffer a，25 L；dNTP Mix(10mmol/L each)，1 L；SmHDZip12F(10 。

30、mol/L)，2 L；SmHDZip12R(10 mol/L)，2 L；Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase，1 L；cDNA，2 L；ddH2O，17 L；共50 L。扩增程序为：95、3min；94、30s，55、30s，72、1min，30个循环；72、10min，4恒温保存。PCR扩增后，1琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。利用诺唯赞公司胶回收试剂盒回收目的片段。0089引物的核苷酸序列如下所示：0090SmHDZip12F：5 GAGGACCTCGACTCTAGAATGTCTACCAGTATTAAGAAGGGCACCA3；0091SmHDZ。

31、ip12R：5 CATTTTTTCTACCGGTACCCTAGAAGTCCCACCACTGCGCA3。0092(3)同源重组0093于冰上配制同源重组反应体系：线性化载体，2L；目的片段，1L；5CE II Buffer，4 L；Exnase，2 L；ddH2O，11 L；共20 L。使用移液器轻轻吸打混匀反应液，短暂离心将反应液收集至管底，37反应30min；立即置于冰上冷却，得重组产物。0094(4)重组产物转化0095取10 L重组产物，加入到100 L的DH5 大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰说明书7/8 页9CN 116606866 A9上静置30min；42水浴热激45s，立。

32、即置于冰上冷却3min；加入900 L不含抗生素的LB培养基，37、200rpm摇菌1小时；5000rpm离心5min，弃掉900 L上清，用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有卡那霉素抗性的平板上轻轻涂匀，37培养箱中倒置培养16小时。0096(5)重组产物鉴定0097挑取单克隆菌落，加入含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37，200rpm，震荡培养4小时，进行菌液PCR验证，验证为阳性的菌落送去基因公司测序。测序成功后，保存菌液，并利用天根试剂盒提取重组质粒，成功得到pMDC202SmHDZip12质粒。0098给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。说明书8/8 页10CN 116606866 A10图1图2图3说明书附图1/3 页11CN 116606866 A11图4图5图6说明书附图2/3 页12CN 116606866 A12图7说明书附图3/3 页13CN 116606866 A13。