能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用.pdf

《能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用.pdf（10页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310398435.5(22)申请日 2023.04.14(83)生物保藏信息CGMCC NO.24028 2021.12.02CGMCC NO.15409 2018.03.05(71)申请人 微康益生菌（苏州）股份有限公司地址 215200 江苏省苏州市吴江经济技术开发区龙桥路1033号(72)发明人 方曙光陈婷吴智仪盖忠辉董瑶(74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332专利代理师 姚品雅(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)A61K 35/745(201。

2、5.01)A61K 35/747(2015.01)A61P 19/02(2006.01)A61P 29/00(2006.01)C12R 1/01(2006.01)C12R 1/245(2006.01)(54)发明名称一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用(57)摘要本发明涉及一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株，保藏编号为CGMCC No.24028。该菌株具有良好的耐胃酸能力，能顺利通过胃肠道到达小肠发挥益生功效；能使类。

3、风湿性关节炎模型小鼠得到有效的病症缓解；可以增加类风湿性关节炎模型小鼠肠道中主要优势菌群的数量，达到缓解关节炎的目的；能降低类风湿性关节炎模型小鼠血清中的类风湿因子；能增加类风湿性关节炎模型小鼠粪便中短链脂肪酸的含量。权利要求书1页 说明书8页序列表（电子公布）CN 116606761 A2023.08.18CN 116606761 A1.一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19，其特征在于，所述能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株，保藏编号为CGM。

4、CC No.24028，保藏日期为2021年12月2日。2.如权利要求1所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19在制备预防、改善或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。3.一种具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的益生菌剂，其特征在于，所述具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的益生菌剂包括权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株。4.如权利要求3所述的具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis su。

5、bsp.lactis BLa19菌株的活菌数不低于1108CFU/mL或1108CFU/g。5.如权利要求3所述的具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂；所述保护剂包括脱脂奶粉；所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。6.一种具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述复合益生菌剂包括权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.l。

6、actis BLa19菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株；所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。7.如权利要求6所述的具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的复合益生菌剂，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的质量比为(24):1。8.如权利要求6所述的具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的复合益生菌剂，其特征在于，所。

7、述复合益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂；所述保护剂包括脱脂奶粉；所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。9.如权利要求1所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括将动物双歧杆菌乳亚种BLA19接种于MRS培养基上进行培养。10.如权利要求9所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为3037，所述培养的时间为1824h。权利要求书1/1 页2CN 1。

8、16606761 A2一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用技术领域0001本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用，具体涉及一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其在制备预防、改善或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。背景技术0002类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的常见慢性免疫系统疾病，晨僵、疼痛、肿胀、畸形以及功能障碍等为其主要的临床表现，RA对人类的健康造成很大的威胁。因此预防和治疗类风湿性关节炎意义重大。0003目前临床上药物治疗和手术治。

9、疗是RA的主要治疗方式，药物治疗包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、抗风湿药(DMARDs)和糖皮质激素，此类药物均可减轻滑膜炎和全身性炎症，缓解病患的不适和疼痛；但这些药物并不一定能够产生足够的效果且会产生包括肾肝毒性等严重的副作用，限制了其在临床上的应用。0004关节中的免疫平衡紊乱目前被认为是RA的主要特征，各免疫细胞对维持宿主的免疫功能平衡和RA的发病机制有重要的作用。肠道是宿主最大的免疫器官，大量微生物居住在宿主肠道粘膜内的肠道内。有研究表明肠道内的微生物群发生紊乱，肠道衍生的免疫细胞被激活并分泌促炎因子，这可改变局部和后续的系统免疫反应，最终促进RA的发病机制。0005如何提供一种可。

10、以缓解类风湿性关节炎的产品，既不会增加类风湿性关节炎的耐药性，同时，在治疗过程中不会导致患者产生不良反应，提高类风湿性关节炎临床治疗的效果，已成为亟待解决的问题。发明内容0006针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用，具体提供一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其在制备预防、改善或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。0007为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：0008第一方面，本发明提供一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19，所述能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19命名。

11、为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株，保藏编号为CGMCC No.24028，保藏日期为2021年12月2日。0009本发明从健康婴儿粪便样本中分离获得并保藏了一株新的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力，能顺利通过胃肠道到达小肠发挥益生功效；能使类风湿性关节炎模型小鼠得到有效的病症缓解；可以增加类风湿性关节炎模型小鼠肠道中主要优势菌群的数量，达到缓解关节炎的目的；能降。

12、低类风湿性关节炎说明书1/8 页3CN 116606761 A3模型小鼠血清中的类风湿因子；能增加类风湿性关节炎模型小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸)的含量。该菌株是一种益生菌，安全性高，且其不会产生抗药性，不会导致患者产生不良反应。0010第二方面，本发明提供如第一方面所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19在制备预防、改善或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。0011本发明所涉及的动物双歧杆菌乳亚种BLa19菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。0012第三方面，本发明提供如第一方面所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧。

13、杆菌乳亚种BLa19以非诊断和/或治疗为目的的在制备类风湿因子抑制剂、白介素7促进剂或肽聚糖识别蛋白1抑制剂中的应用。0013根据本发明的研究结果，所述动物双歧杆菌乳亚种BLa19具有显著地抑制类风湿因子、肽聚糖识别蛋白1，以及促进白介素7的作用，因此，该结果表明所述动物双歧杆菌乳亚种BLa19可以作为一种以非诊断和/或治疗为目的的类风湿因子抑制剂、白介素7促进剂或肽聚糖识别蛋白1抑制剂，用于科研领域，例如研究更多的类风湿因子、白介素7或肽聚糖识别蛋白1的生物代谢机制和行为等。0014第四方面，本发明提供一种具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的益生菌剂，所述具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的。

14、益生菌剂包括第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株。0015优选地，在所述益生菌剂中，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株的活菌数不低于1108CFU/mL或1108CFU/g，例如1108CFU/mL、2108CFU/mL、5108CFU/mL、8108CFU/mL、1109CFU/mL、5109CFU/mL、11010CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。0016优选地，所述益生菌剂的剂型可以为冻干。

15、粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂等剂型。0017优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。0018所述保护剂包括脱脂奶粉。0019所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。0020第五方面，本发明提供一种具有预防、改善或治疗类风湿性关节炎的复合益生菌剂，所述复合益生菌剂包括第一方面所述的动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株和干酪乳杆菌Lactobacillus ca。

16、sei LC89菌株；所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。0021本发明还创造性地发现上述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株能够与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗类风湿性关节炎，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明BLa19菌株和LC89菌株在缓解类风湿性关节炎病症上具有协同增效作用。0022优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacter。

17、ium animalis subsp.lactis 说明书2/8 页4CN 116606761 A4BLa19菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株的质量比为(24):1，例如2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。0023在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。0024优选地，所述复合益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。0025所述保护剂包括脱脂奶粉。0026所述辅助添加剂包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺。

18、旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。0027第六方面，本发明提供如第一方面所述的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19的培养方法，所述培养方法包括将动物双歧杆菌乳亚种BLA19接种于MRS培养基上进行培养。0028优选地，所述培养的温度为3037，例如30、31、32、33、34、35、36、37等；所述培养的时间为1824h，例如18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。0029与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：0030本发明从健康婴儿粪便样本中分。

19、离获得并保藏了一株新的能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力，能顺利通过胃肠道到达小肠发挥益生功效；能使类风湿性关节炎模型小鼠得到有效的病症缓解；可以增加类风湿性关节炎模型小鼠肠道中主要优势菌群的数量，达到缓解关节炎的目的；能降低类风湿性关节炎模型小鼠血清中的类风湿因子；能增加类风湿性关节炎模型小鼠粪便中短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸)的含量。该菌株是一种益生菌，安全性高，且其不会产生抗药性，不会导致患者产生不良反应。0031本发明。

20、还创造性地发现上述动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株能够与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株进行复配使用用于预防、改善或治疗类风湿性关节炎，具有比单一菌剂或者其他复配方式显著优异的效果，说明BLa19菌株和LC89菌株在缓解类风湿性关节炎病症上具有协同增效作用。具体实施方式0032为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。0033下述涉及的动物双歧杆菌乳亚种为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacteri。

21、um animalis subsp.lactis BLa19菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24028，保藏日期为2021年12月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。0034下述涉及的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.15409，保藏日期为2018年3月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。说明书3/8 页5CN 116606761 A50035下述涉及的MRS固体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏。

22、10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO43H2O 2.6g、MgSO47H2O 0.1g、MnSO4 0.05g、琼脂20g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。0036下述涉及的MRS液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO43H2O 2.6g、MgSO47H2O 0.1g、MnSO4 0.05g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后备用。0037下述涉及的动物双歧。

23、杆菌乳亚种BLa19菌悬液：将动物双歧杆菌乳亚种BLa19接种于MRS液体培养基中，37下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，使用PBS重悬菌体，即得，实验中根据需要稀释菌液浓度。0038下述涉及的干酪乳杆菌LC89菌悬液：将干酪乳杆菌LC89接种于MRS液体培养基中，38下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，38下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，取上清液过0.22 m无菌滤。

24、膜，得到副干酪乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得，实验中根据需要稀释菌液浓度。0039实施例10040本实施例筛选一株能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种，步骤如下：0041(1)选取婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基(培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物)上，在37培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30的甘油进行保藏。0042(2)针对保藏的单菌进行体外生理特性测试，具体为如下：。

25、0043A.菌株对胃肠道环境耐受性评价：0044人工模拟胃液：配制0.5NaCl溶液，加入0.3胃蛋白酶，用1mol/L HCl调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22 m微孔滤膜过滤除菌备用。0045人工模拟肠液：配制0.5NaCl溶液，加入0.1胰蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22 m微孔滤膜过滤除菌备用。0046保藏的菌株在人工胃液和肠液中厌氧培养3h，取0h和3h的消化液进行活菌数检测，计算其存活率。其中，菌株存活率()A/B100，式中A表示该菌0h的活菌数(CFU/mL)，B表示该菌3h的活菌数(CFU/mL)。每个实验进行三次平行。

26、实验。0047B.菌株的HT29细胞粘附能力评价：0048菌种活化：菌按2接种量接种于含有0.1的L半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。0049HT29细胞培养：在细胞培养瓶中，加入5mL DMEM完全培养液(含10胎牛血清，1青霉素和链霉素溶液)，于5 CO2恒温培养箱中37孵育，每天换1次培养液，待细胞状态良好后(7080融合)，用0.2消化液(胰酶EDTA)进行消化传代。说明书4/8 页6CN 116606761 A60050黏附性试验：将消。

27、化的HT29细胞调整浓度到105cell/mL，接种到12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5 CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，其中一个孔用胰酶消化，用血球计数板进行细胞计数；其他孔中分别加入菌悬液和对照菌鼠李糖乳杆菌LGG菌悬液各1mL，于5 CO2培养箱中37孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞5次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。每个实验做3次平行实验，通过黏附实验对菌株对HT29细胞的黏附性进行检测。0051C.菌株抑制病原菌的能力评价：0052采用牛津杯法，。

28、取菌株按2(V/V)接种至含有0.1的L半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，每孔注入200 L拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。每个实验进行三次平行实验。0053综合上述筛选实验，筛选。

29、出胃肠液耐受能力(人工模拟)、HT29细胞粘附能力和抑菌能力更好的菌株，将其命名为动物双歧杆菌乳亚种BLa19。0054实施例20055本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：0056(1)形态鉴定：0057将菌株接种在MRS固体培养基中，于37培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落为白色，呈半圆形，表面光滑、湿润，边缘整齐。0058(2)16S rRNA分子生物学鉴定：0059将80保藏的菌株取出，按2比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在37下培养18h后进行离心分离，8000rpm下离心10min，去上清液，收集。

30、菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交中国科学院微生物研究所进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rRNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌乳亚种。0060SEQ ID No:1：0061ACGGCTCCCCCCACAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAG。

31、TTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCG。

32、TGTCTCCACGGCGATCCGGCACATTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCG说明书5/8 页7CN 116606761 A7TTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCACGTCAGTGACGG。

33、CCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGC。

34、GGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGG。

35、GCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTG。0062基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于动物双歧杆菌乳亚种，命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株。0063实施例30064本实施例对动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa19菌株的培养条件进行优化，步骤如下：0065将动物双歧杆菌乳亚种BLa19接种于MRS液体培。

36、养基中，分别于2045的不同温度下培养36h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如表1所示：0066表100670068结果显示，BLa19在3037，培养1824h即可达到生长稳定期。0069实施例40070本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa19对类风湿性关节炎小鼠的治疗效果(体重、足趾肿胀度和临床评分)，步骤如下：0071(1)选取健康ICR雄性小鼠60只，8周龄，初始体重约30g，动物房(室温：2225。湿度：4060)中适应性饲养一周(自由饮食和饮水)。0072(2)造模：将鸡II型胶原与完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合充分进行乳化，制得胶原乳剂。乳剂。

37、的制备采用冰浴混合乳化。在无菌条件下，首次对50只小鼠的尾部进行皮下注说明书6/8 页8CN 116606761 A8射0.1mL的剂量，首次注射后第21天，再准备相同的注射液注射0.1mL的剂量加强小鼠免疫。增强免疫后间隔4天对造模的小鼠进行关节炎评分，共进行3次评分，筛选出成功造模的小鼠。0073(3)分组：然后在造模成功的小鼠中挑选出40只关节炎评分差异无统计学意义的小鼠，随机分为4组(模型组、动物双歧杆菌乳亚种BLa19的BLa19组、干酪乳杆菌LC89的LC89组、BLa19和LC89联用组)，10只/组。正常组，10只/组。0074(4)灌胃：(4.1)正常组：在其他组小鼠造模后的。

38、第2天，每只小鼠每天灌胃0.5mL生理盐水，持续4周。(4.2)模型组：造模后第2天，每只小鼠每天灌胃0.5mL生理盐水，持续4周。(4.3)BLa19组：造模后第2天，每只小鼠每天灌胃0.5mL浓度是11010CFU/mL的动物双歧杆菌乳亚种BLA19菌液。(4.4)LC89组：造模后第2天，每只小鼠每天灌胃0.5mL浓度是11010CFU/mL的干酪乳杆菌LC89菌液。(4.5)BLa19和LC89联用组：造模后第2天，每只小鼠每天灌胃0.4mL浓度是11010CFU/mL的动物双歧杆菌乳亚种BLa19菌液和0.1mL浓度是11010CFU/mL的干酪乳杆菌LC89菌液。0075(5)小鼠。

39、灌胃期的4周内(造模完成算0周)，每周观察小鼠的进食情况、测定小鼠的体重、足趾肿胀程度以及临床评分。测定结果见表2、表3和表4。0076表200770078由表2数据可知：小鼠灌胃的4周内，除正常组的小鼠，其它组小鼠行动相对迟缓，进食量略微减少，体重增长量相对减少。在小鼠灌胃期间，模型组小鼠体重增长缓慢，甚至前两周体重出现负增长；而BLa19组和联用组小鼠体重稳步增长。推测给类风湿性关节炎小鼠服用BLa19菌液，炎症在一定程度上得到缓解。0079表300800081由表3数据可知：小鼠灌胃4周，模型组小鼠足趾肿胀明显，对比模型组BLa19组和联用组小鼠足趾有一定程度的缓解，说明给类风湿性关节炎。

40、小鼠服用BLa19菌液，炎症在一定程度上得到缓解。0082表4说明书7/8 页9CN 116606761 A900830084由表4数据可知：用BLa19菌液、LC89菌液或混合菌液灌胃类风湿性关节炎小鼠能有效降低类风湿性关节炎小鼠的关节炎评分，灌胃3周关节炎评分最高，灌胃4周关节炎评分有所降低。可见动物双歧杆菌乳亚种BLa19可缓解类风湿性关节炎的症状。0085实施例50086本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa19对类风湿性关节炎小鼠血清中类风湿因子(RF)、IL7和PGLYRP1的影响，步骤如下：0087实施例4小鼠灌胃4周后，取血后处死小鼠，取血清，类风湿因子(RF)采用散射比浊法检测。

41、、白介素7(IL7)和肽聚糖识别蛋白1(PGLYRP1)的含量通过ELISA试剂盒测定，结果如表5所示(表中呈现的为平均数)：0088表500890090由表5数据可知：相对于正常组，模型组小鼠血清RF水平明显较高，且BLa19组、联用组显著低于模型组，说明小鼠灌胃BLa19菌液能降低类风湿性关节炎小鼠血清中的类风湿因子。相对于正常组，模型组小鼠血清IL7水平明显降低，且BLa19组、联用组显著高于模型组，说明小鼠灌胃BLa19菌液能回调类风湿性关节炎小鼠血清中的IL7水平。同时相比于模型组，BLa19组和联用组能降低类风湿性关节炎小鼠血清中PGLYRP1含量。0091申请人声明，本发明通过上。

42、述实施例来说明本发明的一种能够缓解类风湿性关节炎的动物双歧杆菌乳亚种BLa19及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。0092以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。0093另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。说明书8/8 页10CN 116606761 A10。