蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202311390577.3(22)申请日 2023.10.25(71)申请人 武汉大学地址 430072 湖北省武汉市武昌区八一路299号(72)发明人 陈铭佳杜巍张琪黄岚杰(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002专利代理师 王庆龙(51)Int.Cl.G01N 5/04(2006.01)(54)发明名称一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法(57)摘要本发明涉及蛋白质测试技术领域,提供一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,包括:先将蛋白质提取液置于截。

2、留分子量为812kDa且材质为再生纤维素的透析袋中进行透析,透析结束后,再采用等电点析出和冷冻干燥工艺得到蛋白质粉末,计算所述蛋白质提取率;所述蛋白质提取液是以毛发为原料在碱性的L半胱氨酸尿素复合液体中溶解得到;所述蛋白质提取液第一次置于透析袋进行透析时,采用的透析液为含有非离子表面活性剂的水溶液,且所述透析液中,非离子表面活性剂的浓度在其临界胶束浓度以下,该方法可以缩短第一次透析时透析袋完全填充满的时间,提高透析效率,从而避免因人为疏忽而导致的测试失败的情况。权利要求书2页 说明书6页CN 117129366 A2023.11.28CN 117129366 A1.一种蛋白质提取液中高分子量蛋。

3、白质提取率的测试方法,其特征在于,包括:先将蛋白质提取液置于截留分子量为812kDa且材质为再生纤维素的透析袋中进行透析,透析结束后,再采用等电点析出和冷冻干燥工艺得到蛋白质粉末,计算所述蛋白质提取率;所述蛋白质提取液是以毛发为原料在碱性的L半胱氨酸尿素复合液体中溶解得到;所述蛋白质提取液第一次置于透析袋进行透析时,采用的透析液为含有非离子表面活性剂的水溶液,且所述透析液中,非离子表面活性剂的浓度在其临界胶束浓度以下。2.根据权利要求1所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述透析的过程为:第1次透析:将所述蛋白质提取液装入第一批透析袋中,使第一批透析袋中预留容积为5。

4、070%,以所述含有非离子表面活性剂的水溶液为透析液在535下进行透析,至透析袋完全填充满时结束第1次透析;将所述第1次透析得到的保留液进行n次透析至所述透析结束;其中,n次透析中,每次透析时,是将第n1次透析后的部分或者全部保留液装入第n批透析袋中,使第n批透析袋中预留容积为5070%;且每次透析时,将透析液替换为未作为透析液用过的水,继续对装有保留液的第n1批透析袋和第n批透析袋在535下进行透析,透析时间为8h以上;其中,n2;当在第n1次透析中,透析8h以上时,透析袋完全填充满,则进行第n次透析;当在第n1次透析中,透析8h以上时,透析袋未填充满,则判定透析结束。3.根据权利要求2所述。

5、的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,透析时,透析袋中的保留液与透析液的体积比为200ml:4060L。4.根据权利要求1所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述非离子表面活性剂为吐温20和/或吐温80。5.根据权利要求4所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述非离子表面活性剂为吐温20。6.根据权利要求2所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述第n批透析袋置于含有非离子表面活性剂的水溶液中浸泡2040min后使用,其中,n2。7.根据权利要求6所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测。

6、试方法,其特征在于,除第一批透析袋外,其余所有透析袋均置于浓度为0.040.055mM的吐温20的水溶液中浸泡2040min后使用。8.根据权利要求17中任一项所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述蛋白质提取液中人发的溶解率30%,且所述蛋白质提取率25%。9.根据权利要求8所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述蛋白质提取液中人发的溶解率70%。10.根据权利要求8所述的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其特征在于,所述蛋白质提取液是以人发为原料在pH值8的L半胱氨酸尿素复合液体中溶解得到;所述L半胱氨酸尿素复合液体中,L。

7、半胱氨酸的含量为220g/L,尿素的含量为1M以权利要求书1/2 页2CN 117129366 A2上;所述人发与L半胱氨酸尿素复合液体的质量体积比为1g:1525ml。权利要求书2/2 页3CN 117129366 A3一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法技术领域0001本发明涉及蛋白质测试技术领域,尤其涉及一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法。背景技术0002蛋白质是以氨基酸为基本单位构成的生物高分子。蛋白质具有一级、二级、三级和四级结构,不同结构的蛋白质具有不同的功能,在生物材料领域,从废弃毛发中提取高分子量蛋白质,对于高值化利用废弃毛发具有十分重要的意义。在现有。

8、的提取方法中,利用L半胱氨酸提取毛发角蛋白的方法,能一定程度上促进蛋白质从螺旋结构部分转变为折叠结构,含有更多折叠结构的蛋白质更利于提升由其制得的生物材料的性能,而且该方法还具有提取工艺简单温和的特点,但是,由于该方法中采用高浓度的尿素碱溶液促进角蛋白的溶解,导致所得的提取液需要采用透析方法去除其中小分子量蛋白质,才能确定该方法对其中高分子量蛋白质的提取效果。0003为了准确测得上述提取液中高分子量蛋白质的提取率,传统的透析方法是将提取液装入截留分子量为812kDa且材质为再生纤维素的透析袋内,并将其整体放入水(透析液)中进行透析以使其中的尿素、碱以及小分子蛋白质等含量降到最低,然后采用等电点。

9、析出和/或冷冻干燥得到透析袋中保留液所含的蛋白质质量,从而计算出提取率。在该透析过程中,透析袋内的小分子蛋白质、尿素和碱等不断进入透析液中,透析液中的水也会不断进入透析袋内,当透析袋内的保留液中的小分子蛋白质的含量足够低,透析会达到平衡,则透析结束。在试验过程中发现,由于水大量进入透析袋,常常导致透析袋内液体的体积增加,而为了避免因透析袋内液体体积的增加使透析袋膨胀破裂,实验室常采用的方式是:在透析时,在透析袋内预留50%以上的体积;但试验中发现,透析袋破裂的概率仍然较高,这导致对高分子量蛋白质提取率的测试过程被迫中断和失败,进而需要多次重复实验却未必能确保透析袋不破裂,这浪费了人力、物力和时。

10、间,使得测试成本提高,测试周期延长。0004鉴于此,提出本发明。发明内容0005经过对透析袋破裂的原因进行分析,发现,第一次透析时透析时间监控不合理,往往在未达到透析时间时,透析袋已破裂,本发明提供一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,通过在透析过程中以特定的方法使用特定的表面活性剂,缩短透析初期的透析时间,且通过监控该第一次透析的过程用以降低透析袋破裂的可能性。解决现有技术中因透析时间过长导致测试效率低、试验成本高的缺陷,具体地,本发明提供一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,包括:先将蛋白质提取液置于截留分子量为812kDa且材质为再生纤维素的透析袋中进行透析,透析。

11、结束后,再采用等电点析出和冷冻干燥工艺得到蛋白质粉末,计算所述蛋白质说明书1/6 页4CN 117129366 A4提取率;所述蛋白质提取液是以毛发为原料在碱性的L半胱氨酸尿素复合液体中溶解得到;所述蛋白质提取液第一次置于透析袋进行透析时,采用的透析液为含有非离子表面活性剂的水溶液,且所述透析液中,非离子表面活性剂的浓度在其临界胶束浓度以下。0006本发明中所述蛋白质提取率的计算公式为:a=w1/w100%;其中,a为蛋白质提取率,w为所述蛋白质提取液中毛发溶解的质量,w1为蛋白质粉末的质量。0007一般而言,新的透析袋在使用前,可以将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。且透析袋的使用。

12、次数34次。本发明中的透析袋在装入含有高分子量蛋白质的液体后,需要预留一定的体积,在采用密封夹密封透析袋之前,将其中的空气排出,而本发明中的透析袋完全填充满是指装有保留液的透析袋的一端被提起时,在其自身重力作用下,观察被提起的一端完全填充无空气,且透析袋整体呈圆柱形。0008通过对传统的透析方法进行观察发现,提取液刺鼻的味道随着透析的时间延长而变淡,且在第二次透析时,基本不易发觉,由于透析时,前期主要是小分子物质,如尿素、碱等从透析袋内进入透析液中,而且前期的透析速率最快,透析袋在前期达到完全填充满的时间较短基本在2h以上,且透析袋较容易因为未及时察觉膨胀过度而破裂,导致测试过程无法正常进行,。

13、本发明意外地发现,若在透析液中加入微量的非离子表面活性剂,可以缩短前期透析的时间,减少操作人员监控透析袋的时间,从而避免因人为因素导致的测试失败的情形。其中,该透析液中非离子表面活性剂的浓度至关重要,若浓度超过临界胶束浓度,将对后续的透析和测试准确性产生较大的负面影响。0009根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述透析的过程为:第1次透析:将所述蛋白质提取液装入第一批透析袋中,第一批透析袋中预留容积为5070%,以所述含有非离子表面活性剂的水溶液为透析液在535下进行透析,至透析袋完全填充满时结束第1次透析,并立即进行下一次透析;将所述第1次透析得到的保留液进行n次。

14、透析至所述透析结束;其中,n次透析中,每次透析时,是将第n1次透析后的部分或者全部保留液装入第n批透析袋中,第n批透析袋中预留容积为5070%;且每次透析时,将透析液替换为新鲜未作为透析液用过的水,继续对装有保留液的第n1批透析袋和第n批透析袋在535下进行透析,透析时间为8h以上;其中,n2;当在第n1次透析中,透析8h以上时,透析袋完全填充满,则进行第n次透析;当在第n1次透析中,透析8h以上时,透析袋未填充满,则判定透析结束。0010一般地,为了提高透析的效率,会在第一次更换透析液时,将透析袋内保留液分装到新的透析袋中,并同样预留50%以上的体积。试验中发现,采用上述方式使用透析袋,可以。

15、有效避免透析袋膨胀破裂。由于透析袋本身力学性能的限制,一般其长度不超过40cm,本发明中每批次透析袋可以包括为1个以上,如前一批次中待分装的保留液的体积过大,则需要同时使用多个透析袋进行透析,此时,该批次透析袋包括多个透析袋。0011根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,透析时,透析袋中的保留液与透析液的体积比为200ml:4060L。说明书2/6 页5CN 117129366 A50012根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述非离子表面活性剂为吐温20和/或吐温80。0013根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述。

16、非离子表面活性剂为吐温20。0014试验中发现,虽然吐温20和吐温80均能有效缩短第一次透析的时间,降低测试失败的概率,但是吐温80对于整体透析效率的提升效果不如吐温20。进一步优选地,第一次透析时,采用的透析液为浓度为0.0150.035mM的吐温20的水溶液,以尽量降低其对后续保留液透析速率的影响。0015根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述第n批透析袋置于含有非离子表面活性剂的水溶液中浸泡2040min后使用,其中,n2。0016根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,除第一批透析袋外,其余所有透析袋在置于80以下的热水中浸泡815分钟。

17、后,还均置于浓度为0.040.055mM以下的吐温20的水溶液中浸泡2040min后使用。0017由于透析袋使用时间越长,其透析效果越差,一般经历3次透析至平衡状态的透析袋,需要更换为新的透析袋,这导致提取率较高的提取液需要很长的时间才能达到透析结束,且对透析袋的需求量非常大,试验成本高,而且,在透析后期,透析速率逐渐变缓,为了缩短透析时间,减少透析袋的使用,虽然现有技术中建议采用流动的透析液、加热透析液、离心等方式,但这些方式均需要引入其他设备或者特定的透析袋装置,或者加热的过程可能会导致提取物进一步降解,而不利于测试的准确性,因此,本发明深入研究透析过程中蛋白质的运动过程以及本发明测试提取。

18、率所关注的主要是高分子量蛋白质质量的关系,发现,在透析袋投入使用前,除了常规的清洗方式之外,还将其置于吐温20的水溶液中浸泡,有助于在更短的透析时间内透析结束,且对提取率测试的准确度影响很小。0018根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述蛋白质提取液中人发的溶解率30%,且所述蛋白质提取率25%。0019根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述蛋白质提取液中人发的溶解率70%。0020由于利用L半胱氨酸提取毛发中蛋白质的方法,所实现的提取率一般在60%以内,提取率越高,溶解率也越大,提取率高的蛋白质提取液其小分子量蛋白质的量也更多,其对应的。

19、透析时间也显著增加,本发明的上述方法在保证测试的准确度的前提下,对于缩短溶解率更高的蛋白质提取液的透析时间以及降低测试失败的概率,效果更加显著。0021根据本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,所述蛋白质提取液是以人发为原料在pH值8的L半胱氨酸尿素复合液体中溶解得到;所述L半胱氨酸尿素复合液体中,L半胱氨酸的含量为220g/L,尿素的含量为1M以上;尿素的含量优选为8M;所述人发与L半胱氨酸尿素复合液体的质量体积比为1g:1525ml。0022本发明提供的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,通过在透析过程中以特定的方法使用特定的表面活性剂,可以缩短第一次透析时透。

20、析袋完全填充满的时间,提高透析效率,从而避免因人为疏忽而导致的测试失败的情况。0023而且,进一步地,通过对透析袋进行特定的预处理,可以实现更少透析袋的使用以说明书3/6 页6CN 117129366 A6及更短的透析时间即可达到透析平衡,进而大大提高的蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试效率和测试成本。具体实施方式0024为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。00。

21、25实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。其中,本发明采用的透析袋,其规格为:截留分子量为8k,材质为再生纤维素,压平宽度为3045mm,每次使用时,透析袋的长度为3540cm。本发明按照论文 荧光角蛋白纳米纤维制备及其应用性能研究 的方法得到蛋白质提取液A和蛋白质提取液B,其中,提取时,尿素的含量为8M,L半胱氨酸的含量分别为20g/L和10g/L,其对应的溶解率和按照传统方法测试的提取率为:提取液A:溶解率85%,提取率48%。0026提取液B:溶解率43%,提取。

22、率34%。0027实施例10028一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其步骤如下:(1)第1次透析:将200ml提取液A装入第一批透析袋中,透析袋两端用透析袋夹密封,第一批透析袋中预留容积为70%,以含有吐温20的水溶液为透析液在25下进行透析,透析时,提取液与透析液的体积比为200ml:50L,且其中透析液中吐温20的浓度为0.02mM,且透析袋在使用前,将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。发现:在透析1.5h时,透析袋即完全填充满,立即对其进行第2次透析。0029(2)第2次透析:将步骤(1)中的透析袋取出,将其中50%的保留液装入第二批透析袋中,第二批透析袋中预留。

23、容积为50%。其中,第二批透析袋在使用前,先将透析袋置于80热水中浸泡10分钟,再将其置于浓度为0.05mM的吐温20的水溶液中,在25下浸泡30min。0030同时,将透析液等体积替换为新鲜未作为透析液用过的自来水,继续对装有保留液的第一批透析袋和第二批透析袋在常温下进行透析8h,发现透析袋完全填充满,立即对其进行第3次透析。0031(3)第3次透析:将步骤(2)中的透析袋取出,将其中50%的保留液装入第三批透析袋中,第三批透析袋中预留容积为50%。其中,第三批透析袋在使用前,先将透析袋置于80热水中浸泡10分钟,再将透析袋置于浓度为0.05mM的吐温20的水溶液中,在常温下浸泡30min。。

24、0032同时将透透析液等体积替换为新鲜未作为透析液用过的自来水,继续在常温下对装有保留液的第一批透析袋、第二批透析袋、第三批透析袋进行透析8h,发现透析袋完全填充满,立即对其进行第4次透析。0033(4)第4次透析:将步骤(3)中的透析袋取出,将第一批透析袋中的全部保留液、第二批透析袋和第三批透析袋中50%的保留液装入第四批透析袋中,第四批透析袋中预留容说明书4/6 页7CN 117129366 A7积为50%。其中,第四批透析袋在使用前,先将透析袋置于80热水中浸泡10分钟,再将透析袋置于浓度为0.05mM的吐温20的水溶液中,在常温下浸泡30min。0034同时,将透析液等体积替换为新鲜未。

25、作为透析液用过的自来水,继续在常温下对装有保留液的第二批透析袋、第三批透析袋和第四批透析袋进行透析8h,发现透析袋完全填充满,立即对其进行第5次透析。0035(5)第5次透析:将步骤(4)中的透析袋取出,将第二批透析袋中的全部保留液、第三批透析袋、第四批透析袋中50%的保留液装入第五批透析袋中,第五批透析袋中预留容积为50%。其中,第五批透析袋在使用前,先将透析袋置于80热水中浸泡10分钟,再将透析袋置于浓度为0.05mM的吐温20的水溶液中,在常温下浸泡30min。0036同时,将透析液等体积替换为新鲜未作为透析液用过的自来水,继续在常温下对装有保留液的第三批透析袋、第四批透析袋和第五批透析。

26、袋进行透析,发现透析袋中保留液的体积增长缓慢,透析8h时,仍未填充满,认定透析结束。0037(6)等电点析出。0038(7)冷冻干燥、称量,按照蛋白质提取率计算公式计算提取液A中高分子量的蛋白质提取率为48.3%。0039实施例20040一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其步骤与实施例1基本相同,不同之处仅在于:将步骤(1)中的透析液等体积替换为水。0041结果发现:在第1次透析时,当透析至2.3h时,发现透析袋破裂,后重复操作,并持续对第1次透析进行监控,发现,透析2h时,透析袋完全填充满,并立即对其进行第2次透析。0042透析过程进行至第5次,且在第5次透析时,透析袋中保留。

27、液的体积比实施例1稍多,但也未完全填充满,且步骤(7)中计算该提取液A中高分子量的蛋白质提取率为48.2%。0043实施例30044一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其步骤与实施例1基本相同,不同之处在于:除了第一批透析袋外,所有透析袋在使用前,仅将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。0045结果发现:虽然在第1次透析在透析1.5h时,透析袋即完全填充满,但在第5次透析至8h时,透析袋完全填充满。继续进行如下的第6次透析和第7次透析:第6次透析:将第5次透析的透析袋取出,且将第三批透析袋中的全部保留液、第四批透析袋和第五批透析袋中50%的保留液装入第六批透析袋中,第六批。

28、透析袋中预留容积为50%。其中,第六批透析袋在使用前,仅将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。同时,将透析液等体积替换为新鲜未作为透析液用过的自来水,继续在常温下对装有保留液的第四批透析袋、第五批透析袋和第六批透析袋进行透析8h,发现透析袋完全填充满,立即对其进行第7次透析。0046第7次透析:将第6次透析的透析袋取出,且将第四批透析袋中的全部保留液、第五说明书5/6 页8CN 117129366 A8批透析袋和第六批透析袋中50%的保留液装入第七批透析袋中,第七批透析袋中预留容积为50%。其中,第七批透析袋在使用前,仅将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。同时,将透析液等体积。

29、替换为新鲜未作为透析液用过的自来水,继续在常温下对装有保留液的第五批透析袋、第六批透析袋和第七批透析袋进行透析,发现透析袋中保留液的体积增长缓慢,透析8h时,仍未填充满,认定透析结束。0047且进一步对其进行实施例1中的步骤(6)和步骤(7)的操作,发现,该提取液A中高分子量的蛋白质提取率为48%。0048这说明,采用浓度为0.05mM的吐温20的水溶液对透析袋进行预处理对于提升透析效率起到显著的作用,且由于越往后期,透析袋中保留液的体积越大,透析袋的使用量越多,相应地,该方法也大大节省了透析袋的使用,显著降低了试验成本,于此同时,本发明的方法并不会对提取率的测试结果产生影响。0049实施例4。

30、0050一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法方法,其步骤与实施例1基本相同,不同之处在于:将实施例1步骤(1)的提取液A等体积替换为提取液B。0051发现,第1次透析在透析1.1h时,透析袋完全填充满,在第2次透析时,透析袋完全填充满,第3次透析时,透析袋中保留液的体积增长缓慢,透析8h时,仍未填充满,认定透析结束。0052且进一步对其进行实施例1中的步骤(6)和步骤(7)的操作,发现,该提取液B中高分子量的蛋白质提取率为34.2%。0053实施例50054一种蛋白质提取液中高分子量蛋白质提取率的测试方法,其步骤与实施例4基本相同,不同之处在于:除了第一批透析袋外,其余所有透析袋在。

31、使用前,仅将透析袋置于80热水中浸泡10分钟即投入使用。0055发现,第1次透析在透析1.1h时,透析袋完全填充满,在第2次透析时,透析袋完全填充满,第3次透析时,透析袋中保留液的体积增长相较于与实施例4略缓慢,认定透析结束。0056且进一步对其进行实施例1中的步骤(6)和步骤(7)的操作,发现,该提取液B中高分子量的蛋白质提取率为34.1%。0057从上述实施例4和5的结果可以看出,当提取液中小分子蛋白质的含量减少时,本发明所提出的方法提高其透析效率的程度显著下降,因而,本发明的方法更加适用于溶解率很高的提取液对其中高分子量的蛋白质提取率的测试。0058最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。说明书6/6 页9CN 117129366 A9。

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